在惡性實體瘤轉化的過程中，緊密連接蛋白 Claudins 的表達常常是失調的。Claudins 幾乎涵蓋了腫瘤生物學的每個方面以及癌癥進展的所有階段，這表明它們有望成為惡性實體瘤診斷、預后的生物標志物以及治療的新靶點。目前研究發現 Claudin18.2 在胃癌、胰腺癌、卵巢癌等疾病中過度表達，基于 Claudin 18.2 為靶點的抗腫瘤靶向治療已成為近年來的研究熱點。因此，該文綜述了 Claudin18.2 的基本結構特征、在各種惡性實體瘤中的表達情況及研究應用成果進展以及展望。
引用本文： 范密, 羅婷, 張羽, 杜小波. Claudin 18.2 在惡性實體腫瘤中的研究現狀與展望. 華西醫學, 2023, 38(9): 1428-1434. doi: 10.7507/1002-0179.202303157 復制
癌癥是世界范圍內的主要公共衛生問題，也是我國居民的主要死因[1]。目前我國肝癌、胃癌、食管癌和宮頸癌正處于高發和高負擔態勢，肺癌、乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌的發病率和負擔也在快速上升[2]。據統計，2016 年中國新增癌癥病例約 406.4 萬例[3]。目前癌癥常規治療策略主要分為 4 類：手術、化學治療（化療）、放射治療（放療）和生物療法，分別適應不同階段的不同腫瘤。相較于傳統放化療，靶向治療能精準治療具有突變驅動基因的患者[4]。在減少對正常組織破壞、減輕副作用的前提下，靶向治療顯著提高了生存率和生活質量[5]。但靶向治療依賴于特異性靶點的存在，導致許多癌癥缺乏有效的靶向治療方案，因此尋找新的特異性靶點并開發新的適應證是提高癌癥靶向治療效果的關鍵。最近，緊密連接（tight junction, TJ）蛋白 Claudin 18.2 在多種惡性腫瘤中被檢出異位表達，包括胃癌、食道癌、胰腺癌和卵巢癌等，并且可以被特異性靶向[6]。其高度特異性及穩定性使 Claudin18.2 成為最具潛力的靶點。因此，本文將對 Claudin18.2 的基本結構特征、在各種惡性實體瘤中的表達情況及研究應用成果進展以及展望作一綜述。
1 Claudin 18.2 的結構、表達情況及檢測方法
TJ 是位于各種上皮細胞和內皮細胞最頂部的結合體，是建立上皮屏障和維持上皮極性及細胞信號傳導方面的重要結構。TJ 由 Claudin 蛋白、閉鎖蛋白和連接黏附分子 3 種主要整合膜蛋白構成，與起連接作用的閉鎖小帶家族及脂膜共同作用形成通透性屏障和膜柵欄[7]。研究表明，癌細胞不可逆轉地逐漸失去 TJ。TJ 相關蛋白的異常表達使細胞屏障破壞和細胞極性失調，導致細胞癌變以及癌細胞轉移[8-9]。
在化學結構上 Claudin 家族具有高度同源性，均由 4 個跨膜結構域組成，即細胞內 N 和 C 末端和 2 個細胞外環[10]。Claudin 的表達具有組織特異性，它們的功能改變與相應組織癌癥的形成有關[11]。如 Claudin1 在結腸癌中的表達[12]，Claudin18 在胃癌中的表達[13]，Caudin10 在肝細胞癌中的表達[14]均已被證明具有預后價值等。Claudin18 表達為 Claudin18.1 和 Claudin 18.2 這 2 個亞型，具有 2 個不同的啟動子和外顯子。公共外顯子這段氨基酸的差異，可避免 2 種亞型發生交叉免疫反應。其中 Claudin18.1 蛋白是肺上皮特異性 TJ 蛋白，僅在正常肺泡組織中過表達[15]。而 Claudin 18.2 僅在正常胃上皮細胞和十二指腸潘氏細胞表達，在其他器官如食道、結腸、胰腺和肺中不表達。且 Claudin 18.2 在正常組織中的表達模式高度受限，在多種人類癌癥中經常發生異位激活，如胃腺癌及其轉移癌中，也可在胰腺、食管、卵巢、乳腺、肺和結腸炎相關的結直腸腫瘤等腫瘤疾病[6，16]。同時因為腫瘤組織中上皮細胞間質轉化導致上皮結構破壞，細胞間的 TJ 蛋白暴露[17]。為抗體靶向 Claudin 18.2 蛋白增加更多可及性。故腫瘤細胞中轉錄上調的 Claudin 18.2 可能作為靶向治療的潛力靶點。Claudin 18.2 上調機制尚不明確。最新研究發現 25%的印戒細胞癌患者存在 Claudin 18 和 Rho GTP 酶激活蛋白 26（ARHGAP26/6）基因融合[18]。Tanaka 等[19]研究顯示幾乎所有融合基因陽性的胃癌組織均表達 Claudin18.2 蛋白。這提示 Claudin 18-ARHGAP 26 融合基因可能是 Claudin18.2 蛋白過表達的條件之一。其他研究發現來自 Claudin 18.2 啟動子區域的磷酸化依賴性轉錄因子結合位點在正常組織中啟動子 CpG 島的基因組高度甲基化，而在正常細胞癌變過程中 CpG 島甲基化水平降低，進而磷酸化依賴性轉錄因子參與激活 Claudin 18.2 的轉錄[20]。這提示啟動子 CpG 島的甲基化水平改變可能導致了 Claudin 18.2 在癌組織和正常組織之間的明顯差異性。Yamaguchi 等[21]研究表明胎牛血清或 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯可上調 Claudin 18.2 的表達。在胰腺癌細胞系中，這種上調被蛋白激酶 C 抑制劑控制；蛋白激酶 C 信號通路的激活明顯參與了 Claudin 18.2 的轉錄；并且通過序列分析發現，其他幾個共同序列 GATA 和 SOX 轉錄因子位于人類 Claudin 18.2 啟動子的近端區域，為探明 Claudin 18.2 的調節機制提供新的方向[22]。
對 Claudin 18.2 的檢測技術除了免疫組織化學分析外，更多新型檢測方式正在研發中。目前研發出的超靈敏分子信標技術能快速識別 Claudin 18.2 RNA，在多個模型細胞驗證了其分辨率和選擇性，表明了分子信標可以區分 Claudin 18.2 在多個模型細胞中的表達。此外，超靈敏分子信標技術還成功地應用于外周循環腫瘤細胞分析。Claudin 18.2 在外周循環腫瘤細胞和免疫組織化學染色中的表達一致性為 100%（陰性：3 例 vs. 3 例；陽性：7 例 vs. 7 例）[23]。Wang 等[24]將一種新的 Claudin18.2 交叉反應特異性抗體用放射性核素 124I 標記，人工合成一種新型的成像劑 124I-18B10 探針；臨床前研究結果表明，124I-18B10 抗體探針顯示對 Claudin18.2 存在高度特異性；在 Claudin18.2 陽性腫瘤的荷瘤小鼠中，腫瘤組織中出現了 124I-18B10 抗體探針的聚集，而正常組織中沒有富集；同時用 18F-氟脫氧葡萄糖制作的 Claudin 18.2 納米探針也展開了研究。上述研究對檢測 Claudin18.2 的表達，并且確定腫瘤部位，提出了有效的輔助工具。
2 Claudin18.2 在各種惡性實體瘤中的表達情況及研究現狀
2.1 胃癌/食管癌
2.1.1 Claudin 18.2 在胃癌中的表達
目前胃癌是當今世界上第 5 大最常見的癌癥[25]。化療比最佳支持治療延長的總生存期（overall survival, OS）僅約 6.7 個月[26]。靶向治療逐漸在臨床治療中擁有著重要地位。如單克隆抗體曲妥珠單抗已批準可作為抗人表皮生長因子受體 2 陽性轉移性胃癌的一線治療[27]。但靶向治療的中位 OS（median OS, mOS）僅為 10～16 個月，2 年內 OS 很少超過 10%[28]。目前治療方案的較少生存獲益和二次耐藥使人們迫切需要開發新的靶向藥物[29]。
Claudin 18.2 作為一種高度選擇性的蛋白，僅局限表達于正常胃黏膜。在細胞惡性轉化時，細胞極性的改變使 Claudin 18.2 暴露于細胞表面，在胃腺癌及其轉移癌都有一定比例的保留[6]。Baek 等[30]的研究發現，74.4%的胃癌患者出現 Claudin 18.2 的表達，其中強陽性表達率高達 29.4%，且 Claudin 18.2 在正常組織中的有限表達可以減少不良事件的發生，使該分子可以作為安全、有效的靶點[31]。
Claudin 18.2 在胃癌中的表達分布與病理特征相關。Claudin 18.2 在彌漫性組織學亞型和高級別（G3）腫瘤中的表達顯著[32]。而在 Hong 等[33]的研究中發現腸型胃癌較彌漫型胃癌有更高的陽性率（P=0.026）。故 Claudin 18.2 的表達可能不能決定胃癌亞型。此外有研究發現 Claudin 18.2 的表達與人類表皮生長因子受體 2 表達、黏蛋白表型、EB 病毒狀態、整合素αvβ5、上皮細胞黏附分子胞外區和溶菌酶水平相關[31，34]。一項最新研究在產甲胎蛋白胃癌中發現了 Claudin 18.2 的表達，陽性表達率為 21.6%，低于常規胃癌組織中的 38.5%；且 Claudin 18.2 的表達與患者術前血清甲胎蛋白水平呈負相關，這種負相關展示了產甲胎蛋白胃癌的逆向分化，同時意味著這種胃癌需要特殊的治療方案[35]。
在預后方面，最新的一項 Meta 分析中表明，從已發表的數據來看，如果獲得 Claudin 18.2 表達的最佳臨界值，就可能達到有效的靶向治療效果[36]。目前已發表研究尚未發現 Claudin 18.2 表達與 TNM 分期、Lauren 分級和 OS 之間的相關性[31，36]。Claudin 18.2 與患者預后可能需要進一步研究。
2.1.2 Claudin 18.2 在食管癌中的表達
Sahin 等[20]的研究發現，在食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, EAC）組織中 Claudin 18.2 的表達率為 78%（17/22），強陽性表達率為 50%（11/22）。Moentenich 等[37]進一步證實了 Claudin 18.2 在 EAC 組織中高表達，表達率為 18.4%（89/485）；同時發現 Claudin18.2 在 EAC 原發灶和相應的淋巴結轉移灶中的表達無統計學差異。這提示在 Claudin 18.2 在轉移性食管癌靶向治療中的意義。
2.1.3 治療
佐妥昔單抗是一種對 Claudin 18.2 具有高度特異性的新型免疫球蛋白 G1 型單克隆抗體[38]，可與腫瘤細胞表面的 Claudin 18.2 的細胞外環特異性結合。研究證實佐妥昔單抗通過多種免疫機制介導細胞殺傷，從而激活抗體依賴的細胞毒和補體依賴的細胞毒和可溶性免疫效應[39]。此外，佐妥昔單抗還可能影響 Claudin 18.2 在癌細胞中的生物學功能，產生抗增殖和促進細胞凋亡作用。前期多個Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗對其臨床療效及安全性進行了評估，佐妥昔單抗有關于胃及胃食管結合部癌的試驗已經推進到第Ⅲ期。一項人體臨床試驗在 15 例晚期胃癌或胃食管癌的成年患者中進行，結果表明佐妥昔單抗在所有劑量下的耐受性均良好[38]。另一項Ⅰ期研究探討了佐妥昔單抗聯合唑來膦酸和白細胞介素 2 對化療難治性 Claudin 18.2 陽性胃 EAC 患者的安全性；其結果顯示 mOS 為 40 周，中位無進展生存期（median progression free survival, mPFS）為 12.7 周；治療相關不良反應包括惡心和嘔吐，主要為 1～3 級，無不良事件導致研究中止；15 例患者中有 13 例經歷了 1 次以上的治療相關不良反應，其中胃腸道疾病最為常見[40]。在一項Ⅱa 期臨床試驗中，該研究評估了佐妥昔單抗對 54 例難治性晚期或轉移性 Claudin18.2 陽性胃腺癌患者的療效和安全性[41]。其結果顯示 mPFS 提高到 14.5 周，應答的中位持續時間延長至 24.6 周；在獲得臨床獲益的 10 例患者中，9 例（90%）患者 70%的腫瘤細胞中 Claudin 18.2 表達為中至高水平[41]。這提示 Claudin 18.2 的高表達水平與較好的療效相關。另一項Ⅱb 期研究（FAST）評估了佐妥昔單抗與一線表柔比星、奧沙利鉑和卡培他濱（epirubicin hydrochloride+oxaliplatin+capecitabine tablets, EOX）化療對晚期/復發性胃癌/賁門腺癌患者的療效[42]。FAST 研究顯示，佐妥昔單抗聯合 EOX 和單用 EOX 的 mPFS 分別為 7.5 個月和 5.3 個月［危險比=0.44，95%置信區間（confidence internal, CI）（0.29，0.67）］；佐妥昔單抗聯合 EOX 組的 OS 為 13.2 個月，而單用 EOX 組為 8.4 個月［危險比=0.56，95%CI（0.40，0.79）］，聯合治療組客觀緩解率（objective response rate, ORR）更高（39% vs. 25%；P=0.022）；兩組報告最多的不良事件仍是胃腸道毒性（惡心和嘔吐），主要為輕至中等強度，這與先前單藥佐妥昔單抗的報道一致，提示聯合治療并不會增加額外毒性[42]。Osemitamab（TST001）是第 2 代靶向 CLDN18.2 的人源化抗體。臨床前研究表明，無論 Claudin18.2 表達水平如何，TST001 在相同劑量下均比佐妥昔單抗具有更強的抗腫瘤活性[43]。據目前研究成果看來，Claudin 18.2 單克隆抗體的研究前景十分可觀。
靶向 Claudin 18.2 的嵌合抗原受體 T（chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy, CAR-T）細胞療法，目前處于Ⅰ期臨床試驗研究階段。通過開發含有 Claudin 18.2 特異性單鏈可變片段的人源化抗體 hu8E5 和 hu8E5-2I，使用特異性單鏈可變片段作為靶向部分開發 Claudin 18.2 特異性 CAR-T 細胞。其結果顯示 Claudin 18.2 特異性 CAR-T 細胞均能有效抑制小鼠移植瘤細胞株的腫瘤生長（P<0.001），且對小鼠正常胃組織無明顯的損傷，展現出良好抗腫瘤活性和安全性[44]。可能是由于嵌合抗原受體結合表位在正常組織微環境中暴露有限。CT041 是世界首個靶向 CLDN18.2 的 CAR-T 細胞藥物。在Ⅰ期臨床試驗[45]中，CT041 用于既往治療失敗的 Claudin18.2 陽性消化系統癌癥患者，招募了 37 例消化系統癌癥患者，其中胃癌 28 例、胰腺癌 5 例、其他癌癥類型 4 例。其中期分析結果報道顯示所有癌種患者的 ORR 和疾病控制率（disease control rate, DCR）分別為 48.6%和 73.0%；其中胃癌患者的 ORR 和 DCR 分別達到 57.1%和 75.0%；94.6%的患者發生 1 級或 2 級細胞因子釋放綜合征；這項結果初步表明，CT041 在 Claudin 18.2 陽性的消化系統癌癥患者中具有良好的耐受性，CT041 有潛力成為晚期胃癌患者的重要治療方式。
雙特異性抗體藥物和抗體藥物偶聯物（antibody-drug conjugate, ADC）靶向 Claudin 18.2 的研發也在不斷進行。在 Zhu 等[46]的研究中，ADC 與白細胞分化抗原 3（cluster of differentiation 3, CD3）雙特異性抗體都存在體外細胞毒性，并可以控制胰腺癌和胃癌患者源性異種移植腫瘤的增殖。在大鼠探索性毒性研究中，ADC 耐受劑量高達 10 mg/kg，并持續 18 d，未觀察到 ADC 相關的臨床毒性體征；在對耐受性的進一步評價中，CD3 雙特異性抗體（0.34 mg/kg）給藥 4 周后在人源化免疫缺陷小鼠胃內并未產生明顯的毒性現象，兩者都具有良好的耐受性與安全性[46]。AMG 910 為半衰期延長抗 Claudin18.2×抗 CD3 雙特異性 T 細胞接合劑分子，是首個進入臨床階段的 Claudin 18.2 雙抗，目前正在全球處于胃癌或胃食管交界處癌的Ⅰ期臨床階段。此外目前 Claudin18.2/CD47 雙抗、Claudin 18.2/PD-L1 雙抗、Claudin 18.2/4-1BB 雙抗等雙抗藥物也在研發中。世界首例 Claudin 18.2 ADC 藥物 CMG901，于 2022 年 4 月，被美國食品和藥物管理局批準用于治療復發/難治性胃癌及賁門腺癌。其他療法包括納米抗體、融合蛋白、三特異性抗體等目前也處于臨床前階段或早期臨床階段。部分正開展的靶向 Claudin 18.2 臨床試驗見表1。
表1
在美國臨床試驗注冊庫注冊的藥物臨床試驗
2.2 胰腺癌
2.2.1 Claudin 18.2 在胰腺癌中的表達情況
胰腺癌在全球范圍內癌癥發病率中排名第 14 位，在癌癥死亡率中排名第 7 位[47]。全世界胰腺癌患者的 5 年生存率約為 6%，是實體瘤中預后較差的腫瘤之一[48]。其中胰腺導管腺癌及其變異型占所有胰腺腫瘤的 80%以上。目前胰腺癌術后 2 年復發率高達約 75%[49]，且 80%～85%的腫瘤患者初診時已是不可手術狀態[50]，晚期胰腺癌患者 mOS 不足 1 年[51]。目前胰腺癌治療策略的局限性不能滿足臨床需求，亟待新靶點新療法為患者帶來新的治療選擇。早有研究發現[52]Claudin18 在胰腺導管腫瘤中的普遍表達，且較黏蛋白 5AC 和黏蛋白 6 這 2 種標志物表達率更高（96.9% vs. 81.3% vs. 84.4%），在腫瘤區域的分布范圍更廣。W?ll 等[53]的研究進一步發現了 Claudin 18.2 在胰腺癌變過程中被異常激活，約 60%的原代胰腺癌細胞表達 Claudin 18.2，其中絕大多數表現出強陽性；而且 Claudin 18.2 的激活和高表達強度與淋巴結陽性的發生率呈正相關。
2.2.2 治療
Türeci 等[54]采用非臨床胰腺癌模型發現抗體依賴的細胞毒和補體依賴的細胞毒的幅度與細胞表面 Claudin 18.2 水平直接相關。化療藥物吉西他濱通過上調 Claudin 18.2 的表達水平和增強唑倍他濱誘導的細胞毒性作用，來減緩腫瘤生長、改善生存期并減少轉移發生。其研究了人胰腺癌細胞系的小鼠異種移植瘤，及對吉西他濱耐藥的腫瘤，發現佐妥昔單抗能夠抑制癌細胞生長，提高存活率，減少轉移率。這項研究結果驗證了 Claudin 18.2 作為胰腺癌的靶向生物標志物的有效性。目前一項評估佐妥昔單抗聯合白蛋白紫杉醇和吉西他濱（Nab-P+GEM）一線治療 Claudin18.2 陽性轉移性胰腺腺癌患者的有效性和安全性的Ⅱ期、開放性、隨機研究（NCT03816163）正在進行，有望能為晚期胰腺癌患者帶來新的治療方案[51]。一項 Claudin 18.2 CAR-T 細胞治療晚期胃癌和胰腺癌的Ⅰ期試驗中報道了 11 例可評估患者（包括 7 例胃癌和 5 例胰腺癌），經 CT041 治療后 DCR 高達 75%；觀察到的不良反應多與細胞因子釋放綜合征相關，均為 1 級和 2 級[55]。以上研究結果表明了 Claudin18.2 靶向藥物在胰腺癌治療中的安全性和耐受性方面均表現優異。
2.3 卵巢癌
Claudin 18.2 在原發性及轉移性卵巢癌中均有不同比例的陽性表達。目前相關研究通過免疫組織化學法發現原發性卵巢癌中出現 Claudin 18.2 的強陽性表達，表達率為 10%（4/42），表達水平明顯低于胃組織；但在胃癌轉移到卵巢的患者及原發灶來源不明的轉移灶中出現 Claudin 18.2 的顯著陽性（69% vs. 50%），這意味著部分轉移的晚期癌癥患者也可能從 Claudin18.2 靶向治療中獲益；同時 Claudin 18.2 與卵巢癌組織學亞型也有相關性，研究中僅在黏液性卵巢癌中發現 Claudin 18.2 的表達，而非漿液性卵巢癌[20]。一項Ⅰ期臨床試驗（NCT05472857）研究正研究 Claudin 18.2 CAR-T 細胞療法在 Claudin 18.2 過表達的晚期實體瘤中的安全性及有效性，該研究入組了胃癌、胰腺癌、晚期卵巢癌、胃食管交界處腺癌 4 種腫瘤病種，目前結果尚未公布。
2.4 結直腸癌
目前研究發現 Claudin 18.2 在結直腸癌的陽性表達率為 0.9%～12.5%[34]。而有最新研究發現，Claudin 18.2 在炎癥相關結直腸癌中呈高表達，且發現 Claudin 18.2 表達陽性的患者比 Claudin 18.2 陰性的患者更易發生淋巴結轉移[16]。這些發現表明，某些高表達 Claudin 18.2 的結直腸癌病例可能是佐妥昔單抗治療的候選對象，并由此推測 Claudin 18.2 的高表達可能與黏膜的持續炎癥和反復損傷有關。Claudin 18.2 不僅可能成為潛在的治療靶點，而且其表達情況與胃表型結直腸癌預后可能也有一定相關性。有研究證實 Claudin 18 表達陽性的患者預后明顯差于表達陰性的患者（P=0.0106）[56]。
2.5 肺癌
肺癌是目前惡性腫瘤中最常見的死亡原因，非小細胞肺癌占肺癌的 85%[57]。3.7%的非小細胞肺癌細胞具有 Claudin 18.2 蛋白高表達，在正常肺組織中呈陰性表達。有研究發現 Claudin 18.2 在腺癌、早期腫瘤和低 Ki-67 增殖指數的腫瘤中呈高表達[58]。這表明 Claudin 18.2 的高表達可能與低侵襲性的非小細胞肺癌相關。其中 78%的 Claudin 6 陽性肺腺癌同時伴有甲狀腺轉錄因子-1 的陽性表達，但只有 15%的 Claudin 18.2 陽性腫瘤同時出現甲狀腺轉錄因子-1 陽性。Claudin 18.2 陽性腫瘤在甲狀腺轉錄因子-1 陰性的腺癌中豐富，這提示 Claudin18 的異構體特異性表達可能描繪特定的亞型。然而目前相關研究較少，可能需要更深入、更全面的研究來闡明相關機制。
2.6 乳腺癌
Sahin 等[20]研究發現 Claudin 18.2 在正常乳腺組織中不表達，6%（1/16）的乳腺癌出現 Claudin 18.2 表達陽性。然而 T?kés 等[59]在 18 例乳腺浸潤性導管癌中發現 Claudin 18 的表達與正常乳腺組織相比顯著下調。可推測抗體的差異導致了矛盾的研究結果。
3 不足與展望
靶向治療由首次提出至今已經得到飛速發展，但臨床應用經驗仍然不足。目前 Claudin 18.2 的研究仍存有部分局限性。首先，在韓國人群的研究中，14.1%的胃癌患者觀察到 Claudin 18.2 的表達，與 Baek 等[30]的報告不一致。這導致結果相互矛盾的原因有 3 個方面[30，33]：第一，患者臨床病理特征的異質性導致 Claudin 18.2 表達率的不同。第二，檢測 Claudin 18.2 的抗體試劑未統一。Arnold 等[60]在研究中明確了 2 種不同的 Claudin 18.2 特異性單克隆抗體 EPR 19202 和 43- 14 A 的差異，并表明 43-14A 的靈敏度更高。第三，缺乏明確的陽性率判定標準。使用特異性更高的抗體篩選人群，可能會降低判讀臨界值。其次，Claudin 18.2 陽性胃癌有較高的 CD8+ T 細胞、CD4+ T 細胞和效應 T 細胞的比率和有效評分[44]，這種獨特的免疫微環境對靶向治療的影響尚不明確，需要進一步研究抗體結合后癌細胞的動力學。
4 小結
尋找新的、有效的靶點，拓展靶向治療適應證是提高癌癥患者療效的關鍵。Claudin 18.2 在多種腫瘤組織中過表達，但在周圍組織中不表達或低水平表達。Claudin 18.2 在腫瘤中高度選擇性和穩定表達的特點使 Claudin 18.2 成為抗腫瘤藥物的熱門分子靶點。雖然目前世界范圍內尚未有靶向 Claudin 18.2 的藥物被批準臨床應用，但目前臨床前研究和臨床研究揭示了 Claudin 18.2 靶向藥物治療具有較高安全性、耐受性及抗腫瘤活性，展示了 Claudin 18.2 是一個極具潛力和價值的有效靶點。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
癌癥是世界范圍內的主要公共衛生問題，也是我國居民的主要死因[1]。目前我國肝癌、胃癌、食管癌和宮頸癌正處于高發和高負擔態勢，肺癌、乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌的發病率和負擔也在快速上升[2]。據統計，2016 年中國新增癌癥病例約 406.4 萬例[3]。目前癌癥常規治療策略主要分為 4 類：手術、化學治療（化療）、放射治療（放療）和生物療法，分別適應不同階段的不同腫瘤。相較于傳統放化療，靶向治療能精準治療具有突變驅動基因的患者[4]。在減少對正常組織破壞、減輕副作用的前提下，靶向治療顯著提高了生存率和生活質量[5]。但靶向治療依賴于特異性靶點的存在，導致許多癌癥缺乏有效的靶向治療方案，因此尋找新的特異性靶點并開發新的適應證是提高癌癥靶向治療效果的關鍵。最近，緊密連接（tight junction, TJ）蛋白 Claudin 18.2 在多種惡性腫瘤中被檢出異位表達，包括胃癌、食道癌、胰腺癌和卵巢癌等，并且可以被特異性靶向[6]。其高度特異性及穩定性使 Claudin18.2 成為最具潛力的靶點。因此，本文將對 Claudin18.2 的基本結構特征、在各種惡性實體瘤中的表達情況及研究應用成果進展以及展望作一綜述。
1 Claudin 18.2 的結構、表達情況及檢測方法
TJ 是位于各種上皮細胞和內皮細胞最頂部的結合體，是建立上皮屏障和維持上皮極性及細胞信號傳導方面的重要結構。TJ 由 Claudin 蛋白、閉鎖蛋白和連接黏附分子 3 種主要整合膜蛋白構成，與起連接作用的閉鎖小帶家族及脂膜共同作用形成通透性屏障和膜柵欄[7]。研究表明，癌細胞不可逆轉地逐漸失去 TJ。TJ 相關蛋白的異常表達使細胞屏障破壞和細胞極性失調，導致細胞癌變以及癌細胞轉移[8-9]。
在化學結構上 Claudin 家族具有高度同源性，均由 4 個跨膜結構域組成，即細胞內 N 和 C 末端和 2 個細胞外環[10]。Claudin 的表達具有組織特異性，它們的功能改變與相應組織癌癥的形成有關[11]。如 Claudin1 在結腸癌中的表達[12]，Claudin18 在胃癌中的表達[13]，Caudin10 在肝細胞癌中的表達[14]均已被證明具有預后價值等。Claudin18 表達為 Claudin18.1 和 Claudin 18.2 這 2 個亞型，具有 2 個不同的啟動子和外顯子。公共外顯子這段氨基酸的差異，可避免 2 種亞型發生交叉免疫反應。其中 Claudin18.1 蛋白是肺上皮特異性 TJ 蛋白，僅在正常肺泡組織中過表達[15]。而 Claudin 18.2 僅在正常胃上皮細胞和十二指腸潘氏細胞表達，在其他器官如食道、結腸、胰腺和肺中不表達。且 Claudin 18.2 在正常組織中的表達模式高度受限，在多種人類癌癥中經常發生異位激活，如胃腺癌及其轉移癌中，也可在胰腺、食管、卵巢、乳腺、肺和結腸炎相關的結直腸腫瘤等腫瘤疾病[6，16]。同時因為腫瘤組織中上皮細胞間質轉化導致上皮結構破壞，細胞間的 TJ 蛋白暴露[17]。為抗體靶向 Claudin 18.2 蛋白增加更多可及性。故腫瘤細胞中轉錄上調的 Claudin 18.2 可能作為靶向治療的潛力靶點。Claudin 18.2 上調機制尚不明確。最新研究發現 25%的印戒細胞癌患者存在 Claudin 18 和 Rho GTP 酶激活蛋白 26（ARHGAP26/6）基因融合[18]。Tanaka 等[19]研究顯示幾乎所有融合基因陽性的胃癌組織均表達 Claudin18.2 蛋白。這提示 Claudin 18-ARHGAP 26 融合基因可能是 Claudin18.2 蛋白過表達的條件之一。其他研究發現來自 Claudin 18.2 啟動子區域的磷酸化依賴性轉錄因子結合位點在正常組織中啟動子 CpG 島的基因組高度甲基化，而在正常細胞癌變過程中 CpG 島甲基化水平降低，進而磷酸化依賴性轉錄因子參與激活 Claudin 18.2 的轉錄[20]。這提示啟動子 CpG 島的甲基化水平改變可能導致了 Claudin 18.2 在癌組織和正常組織之間的明顯差異性。Yamaguchi 等[21]研究表明胎牛血清或 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯可上調 Claudin 18.2 的表達。在胰腺癌細胞系中，這種上調被蛋白激酶 C 抑制劑控制；蛋白激酶 C 信號通路的激活明顯參與了 Claudin 18.2 的轉錄；并且通過序列分析發現，其他幾個共同序列 GATA 和 SOX 轉錄因子位于人類 Claudin 18.2 啟動子的近端區域，為探明 Claudin 18.2 的調節機制提供新的方向[22]。
對 Claudin 18.2 的檢測技術除了免疫組織化學分析外，更多新型檢測方式正在研發中。目前研發出的超靈敏分子信標技術能快速識別 Claudin 18.2 RNA，在多個模型細胞驗證了其分辨率和選擇性，表明了分子信標可以區分 Claudin 18.2 在多個模型細胞中的表達。此外，超靈敏分子信標技術還成功地應用于外周循環腫瘤細胞分析。Claudin 18.2 在外周循環腫瘤細胞和免疫組織化學染色中的表達一致性為 100%（陰性：3 例 vs. 3 例；陽性：7 例 vs. 7 例）[23]。Wang 等[24]將一種新的 Claudin18.2 交叉反應特異性抗體用放射性核素 124I 標記，人工合成一種新型的成像劑 124I-18B10 探針；臨床前研究結果表明，124I-18B10 抗體探針顯示對 Claudin18.2 存在高度特異性；在 Claudin18.2 陽性腫瘤的荷瘤小鼠中，腫瘤組織中出現了 124I-18B10 抗體探針的聚集，而正常組織中沒有富集；同時用 18F-氟脫氧葡萄糖制作的 Claudin 18.2 納米探針也展開了研究。上述研究對檢測 Claudin18.2 的表達，并且確定腫瘤部位，提出了有效的輔助工具。
2 Claudin18.2 在各種惡性實體瘤中的表達情況及研究現狀
2.1 胃癌/食管癌
2.1.1 Claudin 18.2 在胃癌中的表達
目前胃癌是當今世界上第 5 大最常見的癌癥[25]。化療比最佳支持治療延長的總生存期（overall survival, OS）僅約 6.7 個月[26]。靶向治療逐漸在臨床治療中擁有著重要地位。如單克隆抗體曲妥珠單抗已批準可作為抗人表皮生長因子受體 2 陽性轉移性胃癌的一線治療[27]。但靶向治療的中位 OS（median OS, mOS）僅為 10～16 個月，2 年內 OS 很少超過 10%[28]。目前治療方案的較少生存獲益和二次耐藥使人們迫切需要開發新的靶向藥物[29]。
Claudin 18.2 作為一種高度選擇性的蛋白，僅局限表達于正常胃黏膜。在細胞惡性轉化時，細胞極性的改變使 Claudin 18.2 暴露于細胞表面，在胃腺癌及其轉移癌都有一定比例的保留[6]。Baek 等[30]的研究發現，74.4%的胃癌患者出現 Claudin 18.2 的表達，其中強陽性表達率高達 29.4%，且 Claudin 18.2 在正常組織中的有限表達可以減少不良事件的發生，使該分子可以作為安全、有效的靶點[31]。
Claudin 18.2 在胃癌中的表達分布與病理特征相關。Claudin 18.2 在彌漫性組織學亞型和高級別（G3）腫瘤中的表達顯著[32]。而在 Hong 等[33]的研究中發現腸型胃癌較彌漫型胃癌有更高的陽性率（P=0.026）。故 Claudin 18.2 的表達可能不能決定胃癌亞型。此外有研究發現 Claudin 18.2 的表達與人類表皮生長因子受體 2 表達、黏蛋白表型、EB 病毒狀態、整合素αvβ5、上皮細胞黏附分子胞外區和溶菌酶水平相關[31，34]。一項最新研究在產甲胎蛋白胃癌中發現了 Claudin 18.2 的表達，陽性表達率為 21.6%，低于常規胃癌組織中的 38.5%；且 Claudin 18.2 的表達與患者術前血清甲胎蛋白水平呈負相關，這種負相關展示了產甲胎蛋白胃癌的逆向分化，同時意味著這種胃癌需要特殊的治療方案[35]。
在預后方面，最新的一項 Meta 分析中表明，從已發表的數據來看，如果獲得 Claudin 18.2 表達的最佳臨界值，就可能達到有效的靶向治療效果[36]。目前已發表研究尚未發現 Claudin 18.2 表達與 TNM 分期、Lauren 分級和 OS 之間的相關性[31，36]。Claudin 18.2 與患者預后可能需要進一步研究。
2.1.2 Claudin 18.2 在食管癌中的表達
Sahin 等[20]的研究發現，在食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, EAC）組織中 Claudin 18.2 的表達率為 78%（17/22），強陽性表達率為 50%（11/22）。Moentenich 等[37]進一步證實了 Claudin 18.2 在 EAC 組織中高表達，表達率為 18.4%（89/485）；同時發現 Claudin18.2 在 EAC 原發灶和相應的淋巴結轉移灶中的表達無統計學差異。這提示在 Claudin 18.2 在轉移性食管癌靶向治療中的意義。
2.1.3 治療
佐妥昔單抗是一種對 Claudin 18.2 具有高度特異性的新型免疫球蛋白 G1 型單克隆抗體[38]，可與腫瘤細胞表面的 Claudin 18.2 的細胞外環特異性結合。研究證實佐妥昔單抗通過多種免疫機制介導細胞殺傷，從而激活抗體依賴的細胞毒和補體依賴的細胞毒和可溶性免疫效應[39]。此外，佐妥昔單抗還可能影響 Claudin 18.2 在癌細胞中的生物學功能，產生抗增殖和促進細胞凋亡作用。前期多個Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗對其臨床療效及安全性進行了評估，佐妥昔單抗有關于胃及胃食管結合部癌的試驗已經推進到第Ⅲ期。一項人體臨床試驗在 15 例晚期胃癌或胃食管癌的成年患者中進行，結果表明佐妥昔單抗在所有劑量下的耐受性均良好[38]。另一項Ⅰ期研究探討了佐妥昔單抗聯合唑來膦酸和白細胞介素 2 對化療難治性 Claudin 18.2 陽性胃 EAC 患者的安全性；其結果顯示 mOS 為 40 周，中位無進展生存期（median progression free survival, mPFS）為 12.7 周；治療相關不良反應包括惡心和嘔吐，主要為 1～3 級，無不良事件導致研究中止；15 例患者中有 13 例經歷了 1 次以上的治療相關不良反應，其中胃腸道疾病最為常見[40]。在一項Ⅱa 期臨床試驗中，該研究評估了佐妥昔單抗對 54 例難治性晚期或轉移性 Claudin18.2 陽性胃腺癌患者的療效和安全性[41]。其結果顯示 mPFS 提高到 14.5 周，應答的中位持續時間延長至 24.6 周；在獲得臨床獲益的 10 例患者中，9 例（90%）患者 70%的腫瘤細胞中 Claudin 18.2 表達為中至高水平[41]。這提示 Claudin 18.2 的高表達水平與較好的療效相關。另一項Ⅱb 期研究（FAST）評估了佐妥昔單抗與一線表柔比星、奧沙利鉑和卡培他濱（epirubicin hydrochloride+oxaliplatin+capecitabine tablets, EOX）化療對晚期/復發性胃癌/賁門腺癌患者的療效[42]。FAST 研究顯示，佐妥昔單抗聯合 EOX 和單用 EOX 的 mPFS 分別為 7.5 個月和 5.3 個月［危險比=0.44，95%置信區間（confidence internal, CI）（0.29，0.67）］；佐妥昔單抗聯合 EOX 組的 OS 為 13.2 個月，而單用 EOX 組為 8.4 個月［危險比=0.56，95%CI（0.40，0.79）］，聯合治療組客觀緩解率（objective response rate, ORR）更高（39% vs. 25%；P=0.022）；兩組報告最多的不良事件仍是胃腸道毒性（惡心和嘔吐），主要為輕至中等強度，這與先前單藥佐妥昔單抗的報道一致，提示聯合治療并不會增加額外毒性[42]。Osemitamab（TST001）是第 2 代靶向 CLDN18.2 的人源化抗體。臨床前研究表明，無論 Claudin18.2 表達水平如何，TST001 在相同劑量下均比佐妥昔單抗具有更強的抗腫瘤活性[43]。據目前研究成果看來，Claudin 18.2 單克隆抗體的研究前景十分可觀。
靶向 Claudin 18.2 的嵌合抗原受體 T（chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy, CAR-T）細胞療法，目前處于Ⅰ期臨床試驗研究階段。通過開發含有 Claudin 18.2 特異性單鏈可變片段的人源化抗體 hu8E5 和 hu8E5-2I，使用特異性單鏈可變片段作為靶向部分開發 Claudin 18.2 特異性 CAR-T 細胞。其結果顯示 Claudin 18.2 特異性 CAR-T 細胞均能有效抑制小鼠移植瘤細胞株的腫瘤生長（P<0.001），且對小鼠正常胃組織無明顯的損傷，展現出良好抗腫瘤活性和安全性[44]。可能是由于嵌合抗原受體結合表位在正常組織微環境中暴露有限。CT041 是世界首個靶向 CLDN18.2 的 CAR-T 細胞藥物。在Ⅰ期臨床試驗[45]中，CT041 用于既往治療失敗的 Claudin18.2 陽性消化系統癌癥患者，招募了 37 例消化系統癌癥患者，其中胃癌 28 例、胰腺癌 5 例、其他癌癥類型 4 例。其中期分析結果報道顯示所有癌種患者的 ORR 和疾病控制率（disease control rate, DCR）分別為 48.6%和 73.0%；其中胃癌患者的 ORR 和 DCR 分別達到 57.1%和 75.0%；94.6%的患者發生 1 級或 2 級細胞因子釋放綜合征；這項結果初步表明，CT041 在 Claudin 18.2 陽性的消化系統癌癥患者中具有良好的耐受性，CT041 有潛力成為晚期胃癌患者的重要治療方式。
雙特異性抗體藥物和抗體藥物偶聯物（antibody-drug conjugate, ADC）靶向 Claudin 18.2 的研發也在不斷進行。在 Zhu 等[46]的研究中，ADC 與白細胞分化抗原 3（cluster of differentiation 3, CD3）雙特異性抗體都存在體外細胞毒性，并可以控制胰腺癌和胃癌患者源性異種移植腫瘤的增殖。在大鼠探索性毒性研究中，ADC 耐受劑量高達 10 mg/kg，并持續 18 d，未觀察到 ADC 相關的臨床毒性體征；在對耐受性的進一步評價中，CD3 雙特異性抗體（0.34 mg/kg）給藥 4 周后在人源化免疫缺陷小鼠胃內并未產生明顯的毒性現象，兩者都具有良好的耐受性與安全性[46]。AMG 910 為半衰期延長抗 Claudin18.2×抗 CD3 雙特異性 T 細胞接合劑分子，是首個進入臨床階段的 Claudin 18.2 雙抗，目前正在全球處于胃癌或胃食管交界處癌的Ⅰ期臨床階段。此外目前 Claudin18.2/CD47 雙抗、Claudin 18.2/PD-L1 雙抗、Claudin 18.2/4-1BB 雙抗等雙抗藥物也在研發中。世界首例 Claudin 18.2 ADC 藥物 CMG901，于 2022 年 4 月，被美國食品和藥物管理局批準用于治療復發/難治性胃癌及賁門腺癌。其他療法包括納米抗體、融合蛋白、三特異性抗體等目前也處于臨床前階段或早期臨床階段。部分正開展的靶向 Claudin 18.2 臨床試驗見表1。
表1
在美國臨床試驗注冊庫注冊的藥物臨床試驗
2.2 胰腺癌
2.2.1 Claudin 18.2 在胰腺癌中的表達情況
胰腺癌在全球范圍內癌癥發病率中排名第 14 位，在癌癥死亡率中排名第 7 位[47]。全世界胰腺癌患者的 5 年生存率約為 6%，是實體瘤中預后較差的腫瘤之一[48]。其中胰腺導管腺癌及其變異型占所有胰腺腫瘤的 80%以上。目前胰腺癌術后 2 年復發率高達約 75%[49]，且 80%～85%的腫瘤患者初診時已是不可手術狀態[50]，晚期胰腺癌患者 mOS 不足 1 年[51]。目前胰腺癌治療策略的局限性不能滿足臨床需求，亟待新靶點新療法為患者帶來新的治療選擇。早有研究發現[52]Claudin18 在胰腺導管腫瘤中的普遍表達，且較黏蛋白 5AC 和黏蛋白 6 這 2 種標志物表達率更高（96.9% vs. 81.3% vs. 84.4%），在腫瘤區域的分布范圍更廣。W?ll 等[53]的研究進一步發現了 Claudin 18.2 在胰腺癌變過程中被異常激活，約 60%的原代胰腺癌細胞表達 Claudin 18.2，其中絕大多數表現出強陽性；而且 Claudin 18.2 的激活和高表達強度與淋巴結陽性的發生率呈正相關。
2.2.2 治療
Türeci 等[54]采用非臨床胰腺癌模型發現抗體依賴的細胞毒和補體依賴的細胞毒的幅度與細胞表面 Claudin 18.2 水平直接相關。化療藥物吉西他濱通過上調 Claudin 18.2 的表達水平和增強唑倍他濱誘導的細胞毒性作用，來減緩腫瘤生長、改善生存期并減少轉移發生。其研究了人胰腺癌細胞系的小鼠異種移植瘤，及對吉西他濱耐藥的腫瘤，發現佐妥昔單抗能夠抑制癌細胞生長，提高存活率，減少轉移率。這項研究結果驗證了 Claudin 18.2 作為胰腺癌的靶向生物標志物的有效性。目前一項評估佐妥昔單抗聯合白蛋白紫杉醇和吉西他濱（Nab-P+GEM）一線治療 Claudin18.2 陽性轉移性胰腺腺癌患者的有效性和安全性的Ⅱ期、開放性、隨機研究（NCT03816163）正在進行，有望能為晚期胰腺癌患者帶來新的治療方案[51]。一項 Claudin 18.2 CAR-T 細胞治療晚期胃癌和胰腺癌的Ⅰ期試驗中報道了 11 例可評估患者（包括 7 例胃癌和 5 例胰腺癌），經 CT041 治療后 DCR 高達 75%；觀察到的不良反應多與細胞因子釋放綜合征相關，均為 1 級和 2 級[55]。以上研究結果表明了 Claudin18.2 靶向藥物在胰腺癌治療中的安全性和耐受性方面均表現優異。
2.3 卵巢癌
Claudin 18.2 在原發性及轉移性卵巢癌中均有不同比例的陽性表達。目前相關研究通過免疫組織化學法發現原發性卵巢癌中出現 Claudin 18.2 的強陽性表達，表達率為 10%（4/42），表達水平明顯低于胃組織；但在胃癌轉移到卵巢的患者及原發灶來源不明的轉移灶中出現 Claudin 18.2 的顯著陽性（69% vs. 50%），這意味著部分轉移的晚期癌癥患者也可能從 Claudin18.2 靶向治療中獲益；同時 Claudin 18.2 與卵巢癌組織學亞型也有相關性，研究中僅在黏液性卵巢癌中發現 Claudin 18.2 的表達，而非漿液性卵巢癌[20]。一項Ⅰ期臨床試驗（NCT05472857）研究正研究 Claudin 18.2 CAR-T 細胞療法在 Claudin 18.2 過表達的晚期實體瘤中的安全性及有效性，該研究入組了胃癌、胰腺癌、晚期卵巢癌、胃食管交界處腺癌 4 種腫瘤病種，目前結果尚未公布。
2.4 結直腸癌
目前研究發現 Claudin 18.2 在結直腸癌的陽性表達率為 0.9%～12.5%[34]。而有最新研究發現，Claudin 18.2 在炎癥相關結直腸癌中呈高表達，且發現 Claudin 18.2 表達陽性的患者比 Claudin 18.2 陰性的患者更易發生淋巴結轉移[16]。這些發現表明，某些高表達 Claudin 18.2 的結直腸癌病例可能是佐妥昔單抗治療的候選對象，并由此推測 Claudin 18.2 的高表達可能與黏膜的持續炎癥和反復損傷有關。Claudin 18.2 不僅可能成為潛在的治療靶點，而且其表達情況與胃表型結直腸癌預后可能也有一定相關性。有研究證實 Claudin 18 表達陽性的患者預后明顯差于表達陰性的患者（P=0.0106）[56]。
2.5 肺癌
肺癌是目前惡性腫瘤中最常見的死亡原因，非小細胞肺癌占肺癌的 85%[57]。3.7%的非小細胞肺癌細胞具有 Claudin 18.2 蛋白高表達，在正常肺組織中呈陰性表達。有研究發現 Claudin 18.2 在腺癌、早期腫瘤和低 Ki-67 增殖指數的腫瘤中呈高表達[58]。這表明 Claudin 18.2 的高表達可能與低侵襲性的非小細胞肺癌相關。其中 78%的 Claudin 6 陽性肺腺癌同時伴有甲狀腺轉錄因子-1 的陽性表達，但只有 15%的 Claudin 18.2 陽性腫瘤同時出現甲狀腺轉錄因子-1 陽性。Claudin 18.2 陽性腫瘤在甲狀腺轉錄因子-1 陰性的腺癌中豐富，這提示 Claudin18 的異構體特異性表達可能描繪特定的亞型。然而目前相關研究較少，可能需要更深入、更全面的研究來闡明相關機制。
2.6 乳腺癌
Sahin 等[20]研究發現 Claudin 18.2 在正常乳腺組織中不表達，6%（1/16）的乳腺癌出現 Claudin 18.2 表達陽性。然而 T?kés 等[59]在 18 例乳腺浸潤性導管癌中發現 Claudin 18 的表達與正常乳腺組織相比顯著下調。可推測抗體的差異導致了矛盾的研究結果。
3 不足與展望
靶向治療由首次提出至今已經得到飛速發展，但臨床應用經驗仍然不足。目前 Claudin 18.2 的研究仍存有部分局限性。首先，在韓國人群的研究中，14.1%的胃癌患者觀察到 Claudin 18.2 的表達，與 Baek 等[30]的報告不一致。這導致結果相互矛盾的原因有 3 個方面[30，33]：第一，患者臨床病理特征的異質性導致 Claudin 18.2 表達率的不同。第二，檢測 Claudin 18.2 的抗體試劑未統一。Arnold 等[60]在研究中明確了 2 種不同的 Claudin 18.2 特異性單克隆抗體 EPR 19202 和 43- 14 A 的差異，并表明 43-14A 的靈敏度更高。第三，缺乏明確的陽性率判定標準。使用特異性更高的抗體篩選人群，可能會降低判讀臨界值。其次，Claudin 18.2 陽性胃癌有較高的 CD8+ T 細胞、CD4+ T 細胞和效應 T 細胞的比率和有效評分[44]，這種獨特的免疫微環境對靶向治療的影響尚不明確，需要進一步研究抗體結合后癌細胞的動力學。
4 小結
尋找新的、有效的靶點，拓展靶向治療適應證是提高癌癥患者療效的關鍵。Claudin 18.2 在多種腫瘤組織中過表達，但在周圍組織中不表達或低水平表達。Claudin 18.2 在腫瘤中高度選擇性和穩定表達的特點使 Claudin 18.2 成為抗腫瘤藥物的熱門分子靶點。雖然目前世界范圍內尚未有靶向 Claudin 18.2 的藥物被批準臨床應用，但目前臨床前研究和臨床研究揭示了 Claudin 18.2 靶向藥物治療具有較高安全性、耐受性及抗腫瘤活性，展示了 Claudin 18.2 是一個極具潛力和價值的有效靶點。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
