近年來，隨著社會的飛速發展以及人們生活水平的迅速提高，人們飲食習慣及方式不斷發生改變，肥胖人數急劇增多[1]。而肥胖會造成體內的脂肪分布異常和/或脂肪因子調控失調，從而導致脂質代謝異常，進而誘發代謝綜合征、2 型糖尿病和心血管疾病等一系列慢性疾病，嚴重影響人們的生活質量[2-3]。瞬時受體電位香草酸亞型 4（transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4）屬于瞬時感受器家族成員之一，是一種非選擇性鈣離子（Ca2+）通道蛋白[4]。TRPV4 通道廣泛分布于多種類型的細胞中，包括脂肪細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞等，通過對 Ca2+的調節，在脂肪的生成、分解和調節脂質穩態過程中發揮重要作用[5-7]。而其活性易受多種刺激因素影響，包括滲透壓、機械刺激以及內源性和外源性化合物等[8]，在被特異性激活后可參與調節肥胖、代謝性疾病和高血壓等機體多種生理或病理過程[9-10]。GSK1016790A 是一種小分子 TRPV4 特異性激動劑，在野生型 TRPV4 動物模型中其被發現可上調 TRPV4 mRNA 在細胞或組織中的表達水平[11]。雖然目前很多文獻報道激活 TRPV4 通道對脂肪細胞內源性調控具有一定影響，但其明確機制目前尚不完全清楚。代謝組學是一種從分子水平對代謝終端產物進行研究的系統生物學方法，目前廣泛應用于生物體內源性小分子代謝物含量變化和相關代謝通路的研究[12-13]。通過代謝組學獲得大量代謝特征、分析代謝數據、篩選出差異代謝物并明確代謝途徑對探究代謝物與生理病理變化之間的相互關系和藥物治療機制具有較好指導意義。因此本研究通過使用 TRPV4 激動劑 GSK1016790A 探討 TRPV4 通道蛋白活性增強對成熟脂肪細胞脂質代謝的影響，為肥胖及其相關代謝綜合征的發生發展研究提供新思路。
1 材料與方法
1.1 細胞
小鼠 3T3-L1 前脂肪細胞系（小鼠胚胎成纖維細胞）：購于上海蓋寧生物科技有限公司。
1.2 主要試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
GSK1016790A、牛胰島素（美國 MedChemExpress 公司）；Dulbecco 改良 Eagle 培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM）、青鏈霉素、胰蛋白酶（美國 Gibco 公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（美國 Sigma 公司）；cell counting kit-8（CCK-8）試劑盒（美國 Zeta Life 公司）；甘油三酯檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RNAiso Plus、TB Green? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus)（日本 Takara 公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2.2 主要儀器
UPLC I-Class Plus 超高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；Q Exactive 高分辨質譜儀、實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）儀（美國 Thermo 公司）；Infinite E Plex 酶標儀（美國 Bio-Tek 公司）；Maxi Vacbeta 冷凍真空濃縮儀（中國香港 GeneCompany 公司）；Olympus DP71 顯微照相系統（日本 Olympus 公司）。
1.3 方法
1.3.1 細胞培養
將復蘇好的 3T3-L1 前脂肪細胞培養于 T25 培養瓶中，培養液為含有 10% 胎牛血清和 1% 青鏈霉素的 DMEM 完全培養液，放入溫度 37℃、二氧化碳含量 5%、相對濕度 100% 的培養箱中培養。觀察細胞狀態，當細胞量達到 90% 時進行傳代。
1.3.2 CCK-8 法檢測細胞活力
將 3T3-L1 前脂肪細胞接種于 96 孔板中培養。將 10 mmol/L 的 GSK1016790A 溶液取適量溶于完全培養基中配制成終濃度為 0.1、1、10 μmol/L 的溶液干預細胞 48 h，同時設只用完全培養基培養的 3T3-L1 前脂肪細胞作為空白組。加入預配好的 CCK-8 試劑 110 μL，孵育約 1 h 后在酶標儀上 450 nm 波長處測量吸光度值，將各組吸光度值與對照組比較，確定最適宜的干預濃度。細胞活力（%）=（A實驗組?A空白組）/（A對照組?A空白組）×100%，其中 A 表示吸光度值。
1.3.3 細胞誘導分化
實驗共分為 3 組，即空白組（3T3-L1 前脂肪細胞）、對照組（成熟脂肪細胞）和 GSK 組（成熟脂肪細胞+GSK1016790A）。
對照組和 GSK 組細胞的誘導分化：將 3T3-L1 前脂肪細胞以 1×105 個/mL 密度接種在六孔板。生長至完全匯合（即出現接觸抑制）后 2 d 后開始誘導分化（即誘導分化 0 d），加入誘導培養基（含 10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素混合液、胰島素 10 mg/L、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 0.5 mmol/L、地塞米松 1.0 μmol/L 的 DMEM 培養基），2 d 后換成分化培養基（含 10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素混合液、胰島素 10 mg/L 的 DMEM 培養基），繼續培養 2 d，隨后換為完全培養基（含 10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素混合液的 DMEM 培養基），2 d 換液 1 次，繼續培養 4 d，誘導分化第 8 天后即為分化完成，細胞由 3T3-L1 前脂肪細胞轉變為成熟脂肪細胞。其中 GSK 組在誘導培養基、分化培養基和完全培養基中均加入 GSK1016790A。
1.3.4 油紅 O 染色
棄去六孔板內培養基；每孔加入 2 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）輕輕沖洗 2 次；然后用 2 mL 4% 多聚甲醛避光固定細胞 30 min，棄去固定液加超純水清洗 2 次；用 60% 異丙醇浸洗 5 min 后加入油紅 O 溶液避光放置 37℃培養箱中染色 30 min；棄去染色液用超純水洗 2～5 次，直至無多余染液。染色后成熟脂肪細胞內脂質呈紅色，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。
1.3.5 實時熒光定量 PCR 檢測 TRPV4 表達水平
應用 RNAiso Plus 提取細胞總 RNA，超微量分光光度計檢測總 RNA 的濃度。逆轉錄合成第 1 鏈，以此為模板進行擴增，β-actin 作為內參基因。TRPV4 正向引物序列：5’-ATGGCAGATCCTGGTGATGG-3’；反向引物序列：5’-GGAACTTCATACGCAGGTTTGG-3’。Β-actin 正向引物序列：5’-GCTTCTAGGCGGACTGTTAC-3’；反向引物序列：5’-CCATGCCAATGTTGTCTCTT-3’。PCR 反應程序第 1 步：預變性 95°C 30 s；第 2 步：變性 95°C 5 s，退火 60°C 30 s，循環 40 次；第 3 步：熔解曲線階段。采用 2?ΔΔCt 法進行相對定量分析，ΔΔCt=ΔCt 實驗?ΔCt 對照，ΔCt=CT 目的?CT 內參。熔解曲線單峰表示無引物二聚體等的非特異性擴增。
1.3.6 甘油三酯含量測定
收集各組細胞至離心管中，加入 200 μL PBS 后冰水浴條件下破碎細胞制備勻漿；依據甘油三酯檢測試劑盒說明書要求配制相應的工作液并在 96 孔板中進行點樣 2.5 μL，每孔中加入 250 μL 工作液后，37℃孵育 10 min，通過酶標儀在波長 546 nm 測吸光度，同時測定蛋白含量進行校正。甘油三酯含量（mmol/gprot）=（A樣本?A空白）/（A標準?A 空白）×C標準/Cprot，其中 A 表示吸光度值，C標準為標準品濃度 2.26 mmol/L，Cprot 為待測樣本勻漿蛋白濃度 gprot/L（prot 指蛋白）。
1.3.7 非靶向代謝組學檢測
① 色譜條件：BEH C18 色譜柱：正離子模式流動相為含 0.1% 甲酸的水溶液（A 液）和含 0.1% 甲酸的甲醇（B 液），負離子模式流動相為含 10 mmol/L 甲酸銨的水溶液（A 液）和含 10 mmol/L 甲酸銨的 95% 甲醇（B 液）。梯度洗脫：第 0～1 分鐘，2% B 液；第 1～9 分鐘，2%→98% B 液；第 9～12 分鐘，98% B 液；第 12～12.1 分鐘，98%→2% B 液；第 12.1～15 分鐘，2% B 液。流速為 0.35 mL/min，柱溫 45°C，進樣量為 5 μL。
② 質譜條件：利用 Q Exactive 質譜儀進行一級、二級質譜數據采集。質譜掃描質核比范圍為 70～1050，一級分辨率為 70000，自動增益控制為 3×106，最大注入時間為 100 ms。按照母離子強度，選擇排名前三的離子進行碎裂，采集二級信息，二級分辨率為 17500，自動增益控制為 1×105，最大注入時間為 50 ms，碎裂能量設置為 20、40、60 eV。離子源參數設置：鞘氣流速為 40，輔助氣流速為 10，噴霧電壓正離子模式為 3.80，負離子模式為 3.20，離子傳輸管溫度為 320℃，輔助氣加熱溫度為 350℃。
③ 細胞樣本收集：在六孔板中按照上述 1.3.3 進行干預，每種處理組 6 個平行組別；干預完成的細胞（確保每孔的細胞至少有 1×106 個）；用 PBS 清洗細胞 3 次后，每孔加入 1 mL PBS 將細胞吹打下后轉移到 2 mL 的離心管中。1000×g 4℃離心 10 min 棄上清液收集沉淀細胞；液氮速凍 15 min，存于?80℃冰箱保存備用。
④ 提取細胞代謝物：稱取 25 mg 細胞沉淀加入 2 mL 加厚離心管中，同時加入 2 顆小磁珠；每個樣品同時加入 10 μL 內標；向樣本中加 800 μL 沉淀劑（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1），50 Hz 研磨 5 min；將研磨好的樣本放置于–20℃沉淀 2 h；將樣品放入離心機中離心（25000×g 4℃，15 min），每個樣品各取 600 μL 加入新的離心管中，冷凍抽干；向抽干后的樣品中加入 120 μL 50% 甲醇，振蕩直至完全溶解；25000×g 4℃離心 15 min，取上清液置于新的離心管中；每個樣本取 10 μL 混合成質量控制（質控）樣本，用于評估超高效液相色譜-質譜聯用分析過程的穩定性和重復性。分別將正、負離子模式下所有的質控樣本的基峰色譜圖進行譜圖疊加比較，各色譜峰的響應強度和保留時間重疊度越高，則說明方法穩定性越好；計算每個代謝物在質控樣本中的定量值的變異系數（coefficient of variation, CV），CV 越小表示定量結果的重復性越好。
⑤ 代謝物離子峰提取和代謝物鑒定：將質譜的下機數據導入 Compound Discoverer 3.3 軟件，結合 mzCloud 數據庫和 ChemSpider 在線數據庫進行質譜數據分析后，得到包含代謝物峰面積和鑒定結果等信息的數據矩陣，之后對該表格進一步進行信息分析處理。
1.4 統計學方法
1.4.1 細胞實驗數據
使用 SPSS 25.0 軟件進行統計分析，用 GraphPad Prism 8.0 軟件繪制統計圖。兩組間比較采用兩獨立樣本 t 檢驗（正態分布）或 Wilcoxon 秩和檢驗（非正態分布）；多組間比較采用單因素方差分析（正態分布）或 Kruskal-Wallis H 秩和檢驗（非正態分布），差異有統計學意義則進一步采用最小顯著差異 t 檢驗（正態分布）或“Kruskal-Wallis One-way ANOVA （k samples）”中的“All pariwise”（非正態分布）進行兩兩比較。雙側檢驗水準 α=0.05。
1.4.2 代謝組學數據
對峰面積歸一化后導入 R 4.0.4 metaX 軟件包進行多元統計分析。采用主成分分析與正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA），對比京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）和人類代謝組數據庫（Human Metabolome Database, HMDB）等數據庫，對代謝物進行指認，通過變量權重值≥1、差異變化倍數≥1.2 或≤0.83、P<0.05 這 3 個條件篩選得到差異代謝物，篩查出潛在的代謝標志物；采用 MetaboAnalyst 5.0 在線分析平臺可視化潛在的代謝標志物，并對差異代謝物進行通路富集分析。
2 結果
2.1 CCK-8 法測定藥物對 3T3-L1 細胞增殖的影響
通過 CCK-8 法測定觀察 3T3-L1 細胞在不同濃度激動劑（GSK1016790A）干預下的細胞存活率，為后續代謝組給藥濃度提供參考。結果顯示，與對照組相比，在前脂肪細胞上 0.1 μmol/L 的 GSK1016790A 作用 48 h，細胞存活率沒有顯著改變（P>0.05），見圖1。因此后續篩選 GSK1016790A 0.1 μmol/L 這個濃度作為細胞的作用劑量。
圖1
不同濃度 GSK1016790A 對 3T3-L1 細胞干預 48 h 后存活率的影響
GSK10 μM：GSK1016790A 10 μmol/L 組；GSK1 μM：GSK1016790A 1 μmol/L 組；GSK0.1 μM：GSK1016790A 0.1 μmol/L 組；*與對照組相比，
2.2 油紅 O 染色鑒定成熟脂肪細胞
油紅 O 染色后可見含有明亮橘紅色脂滴的成熟脂肪細胞在視野中占 90% 以上，與對照組（圖2a）相比，加入 TRPV4 激動劑 GSK1016790A 的 GSK 組脂滴顯著增多（圖2b）。
圖2
倒置顯微鏡下鑒定成熟脂肪細胞（油紅 O 染色 ×400）
a. 對照組，為正常成熟脂肪細胞；b. GSK 組，脂肪細胞脂滴顯著增多
2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 TRPV4 表達水平
采用實時熒光定量 PCR 法檢測 TRPV4 mRNA 表達水平。結果表明，與成熟脂肪細胞相比，空白組 TRPV4 mRNA 表達水平顯著降低（P<0.001），而 GSK 組則明顯上調（P<0.01），見圖3a。
圖3
GSK1016790A 干預后脂肪細胞中 TRPV4 mRNA 及甘油三酯表達水平
a.
2.4 成熟脂肪細胞中甘油三酯水平檢測
各組細胞誘導分化 14 d 后檢測細胞中甘油三酯水平，結果表明，相比于對照組，GSK 組細胞中甘油三酯水平顯著上升（P<0.05），見圖3b。
2.5 代謝組學檢測 GSK1016790A 對成熟脂肪細胞內源性代謝的影響
2.5.1 方法穩定性和重復性評價
各色譜峰的響應強度和保留時間重疊度高，說明儀器檢測過程的穩定性良好，數據質量可靠。CV≤30% 的代謝物數量占代謝物總數的比值為 80%，表明儀器分析系統重復性較好，數據可以用于后續分析。
2.5.2 代謝物的分類和功能注釋
參照 KEGG 數據庫，對鑒定到的代謝物進行分類注釋和功能注釋，以了解不同代謝物的功能特性，確定代謝物參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。圖4a 顯示了本實驗鑒定到的代謝物種類，主要包括脂類 265 種，氨基酸、肽及類似物 102 種和碳水化合物 39 種等。圖4b 顯示了本研究篩選到的 12 個代謝通路大類，主要包括氨基酸代謝通路、脂質代謝通路、碳水化合物代謝通路、核苷酸代謝通路和能量代謝通路等。其中氨基酸代謝通路上富集到 61 個代謝物，脂質代謝通路上富集到 58 個代謝物，碳水化合物代謝通路上富集到 39 個代謝物，核苷酸代謝通路上富集到 38 個代謝物。
圖4
代謝物分類和功能注釋圖
a. 代謝物分類條形圖，沒有分類信息的鑒定結果不參與統計；b. 代謝物通路分類條形圖
2.5.3 多元統計分析
首先對全部樣本采用主成分分析，從總體上初步了解組間的差異程度，結果顯示空白組、對照組和 GSK 組分別聚集在左右兩側，表明其代謝圖譜存在明顯的差異。然后進行兩兩組之間主成分分析，可以看出在空白組和對照組、GSK 組和對照組數據分散在不同區域，說明有較好的組間差異性和組內聚集性（圖5）。
圖5
代謝物主成分分析圖
a. 總體主成分分析圖；b. 對照組和空白組主成分得分圖；c. GSK 組和對照組主成分得分圖。各組樣本量均為
進一步采用 OPLS-DA 分析結果顯示，空白組與對照組、對照組與 GSK 組代謝物可顯著地分開。模型評價參數如下：空白組比對照組：R2Y=0.995，Q2=0.976；GSK 組比對照組 R2Y=0.989，Q2=0.969，表明模型具有較好的解釋和預測能力。采用置換檢驗進行驗證，對 OPLS-DA 模型進行 200 次響應置換檢驗后空白組比對照組模型的截距R2=0.75，Q2=0.49；GSK 組比對照組模型截距R2=0.75，Q2=0.42。置換檢驗圖發現 R2、Q2 均小于右端，前者在后者之上，表明模型有效可靠，未產生過擬合現象（圖6）。
圖6
各組正交偏最小二乘法分析模型得分圖及置換檢驗圖
a、b. 對照組與空白組比較；c、d. GSK 組與對照組比較。a、c 為正交偏最小二乘法分析模型得分圖，Orthogonal T score 表示正交成分得分值，T score 表示成分得分值；b、d 為置換檢驗圖，Value 表示預測誤差，Cor 表示相關系數，Intercepts 表示截距，
2.5.4 差異代謝物的篩選和分析
空白組和對照組共鑒定出 595 種差異代謝物，其中 374 種上調，221 種下調；GSK 組和對照組共鑒定出 430 種差異代謝物，其中 272 種上調，158 種下調。利用火山圖對差異代謝物進行可視化展示（圖7）。
圖7
各組差異代謝物火山圖
a. 對照組與空白組比較；b. GSK 組與對照組比較。Fold Change：差異變化倍數；
將兩組差異代謝物取交集，并結合 HMDB 和 KEGG 數據庫，找出了 TRPV4 激動劑 GSK1016790A 干預后出現顯著性變化的差異代謝物（表1）。共 45 種代謝物，其中 2-amino-1,3,4-octadecanetriol（2-氨基-1,3,4-十八烷三醇）、linoleic acid（亞油酸）、sphingosine（鞘氨醇）、sphinganine（鞘氨酸）、butabarbital（丁巴比妥）、2-(14,15-epoxyeicosatrienoyl) glycerol 等 36 種代謝物含量在誘導為成熟脂肪細胞后上升，TRPV4 激動劑給藥后繼續上升；sn-glycerol 3-phosphate（甘油-3-磷酸酰基轉移酶）、uridine（尿苷）、guanine（鳥嘌呤）、adenosine（腺苷）、4-{[3-(hydroxymethyl)phenyl]amino}-n-(isopropylcarbamoyl)-3-pyridinesulfonamide、pyrogallol-2-o-glucuronide 等 9 種代謝物含量在誘導為成熟脂肪細胞后下降，TRPV4 激動劑給藥后繼續下降。
表1
GSK1016790A 干預后顯著變化的代謝物
2.5.5 代謝通路分析
基于 TRPV4 激動劑 GSK1016790A 干預后變化的代謝物進行代謝通路分析，以 P<0.05 為條件共篩選出 13 條代謝通路，包括鞘脂信號傳導通路、鞘脂代謝通路、ABC 轉運蛋白通路、不飽和脂肪酸的生物合成通路、嘌呤代謝通路、環磷酸鳥苷-環磷酸鳥苷依賴的蛋白激酶信號通路、皮質醇合成和分泌通路、卵巢類固醇合成通路、環磷酸腺苷信號通路、亞油酸代謝通路、甘油脂代謝通路、神經活性配體-受體相互作用通路和甘油磷脂代謝通路。將匹配到的代謝通路繪制氣泡圖進行可視化展示（圖8）。其中影響較顯著的是鞘脂代謝通路和不飽和脂肪酸的生物合成通路。
圖8
GSK1016790A 干預代謝通路富集分析氣泡圖
富集因子=當前通路中包含的目標代謝物數/當前通路中所有代謝物；圓點大小代表注釋到該通路的差異代謝物數目；cGMP：環磷酸鳥苷；PKG：cGMP 依賴的蛋白激酶；cAMP：環磷酸腺苷
3 討論
肥胖是由機體脂質代謝功能異常導致脂肪細胞脂肪生成過多的一種慢性代謝性疾病，而 TRPV4 也已被證實可通過調節活性對脂肪細胞內源性調控產生一定影響，但其代謝機制較為復雜，關于 TRPV4 通道蛋白活性改變對脂肪細胞脂肪代謝的具體調控作用機制還未見相關報道。因此本研究應用代謝組學技術，從分子水平探討 TRPV4 特異性激動劑處理后對脂肪細胞分化期間發生的具體代謝變化的影響，識別 TRPV4 通道蛋白活性改變影響的關鍵差異代謝物和代謝通路，以期為探究 TRPV4 通道蛋白活性改變對脂肪細胞脂質代謝的調控作用提供思路，同時，為預防和治療肥胖及其相關代謝綜合征提供理論依據。
本研究首先利用 3T3-L1 前脂肪細胞誘導成熟脂肪細胞模型，油紅 O 染色后可見對照組的成熟脂肪細胞內有明顯脂滴生成，表明模型誘導成功；進一步在誘導全過程中加入 TRPV4 激動劑（GSK 組）促使 TRPV4 mRNA 表達水平顯著上調（P<0.01），誘導完成后觀察 GSK 組脂滴生成明顯增多且甘油三酯含量顯著上調（P<0.05）。這表明激活 TRPV4 通道蛋白活性可以促進脂肪細胞的脂肪生成。
而為了進一步探討 TRPV4 通道蛋白調節脂肪細胞脂質代謝的作用途徑，本研究應用非靶向代謝組學對脂肪細胞樣本進行分析，并對差異代謝物進行鑒定。首先對總體數據進行主成分分析，發現不同處理組之間均存在差異。為了進一步區分不同組的差異代謝物，構建了 OPLS-DA 模型，從 OPLS-DA 得分圖中可以看出空白組和對照組、對照組和 GSK 組兩組之間的代謝物均能明顯分離。結合對模型的驗證結果，各組之間構建的模型效果都比較好，均未產生過擬合現象，可以很好地說明不同組之間的代謝物存在差異。通過對鑒定到的代謝物進行分析發現 GSK1016790A 給藥后成熟脂肪細胞中共有 45 個內源性代謝物發生顯著變化，將數據導入 KEGG 數據庫共鑒定出包括鞘脂代謝和不飽和脂肪酸的生物合成等 13 條代謝通路。
差異代謝物鞘氨酸、鞘氨醇和 2-氨基-1,3,4-十八烷三醇參與鞘脂代謝。鞘脂是一類以鞘氨醇為骨架的復雜化合物，包括鞘氨醇、神經酰胺和鞘磷脂等[14]。研究表明，鞘脂代謝異常與肥胖和胰島素抵抗病理過程密切相關[15-16]。Samad 等[17]利用高脂食物誘導的肥胖小鼠模型發現總脂肪鞘磷脂和神經酰胺水平降低但鞘氨醇水平增加，表明鞘脂會通過水解轉化為神經酰胺，神經酰胺再通過神經酰胺酶的作用進一步代謝為鞘氨醇。而本研究通過代謝組學技術發現 GSK1016790A 給藥后鞘氨醇水平顯著增加，亦證明 TRPV4 激動劑可通過調控鞘脂代謝來干預脂肪細胞脂質代謝。
差異代謝物亞油酸等參與不飽和脂肪酸的生物合成通路。亞油酸是一種具有多種生物活性的多不飽和脂肪酸，是過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferators-activate receptor γ, PPARγ）激動劑。PPARγ 參與調節 3T3-L1 前脂肪細胞生長分化與脂質生成[18-20]。當 PPARγ 被激活時可以通過活化脂肪細胞中乙酰輔酶 A、葡萄糖轉運體 4 等促進脂肪細胞中甘油三酯合成增加，導致脂肪細胞體積增大[21-22]。與空白組相比，對照組亞油酸表達水平顯著上調；與對照組相比，GSK 組亞油酸表達水平繼續上調。這提示 TRPV4 激動劑參與調控不飽和脂肪酸的生物合成和亞油酸代謝來促進脂肪生成，引起肥胖。
綜上所述，通過分析差異代謝物以及相關代謝通路，結合其生物學意義，我們推測 GSK1016790A 可能通過激活 TRPV4 通道蛋白活性促進脂肪細胞內脂肪生成，同時參與調節不飽和脂肪酸的生物合成通路和鞘脂代謝通路等代謝途徑，影響脂肪細胞脂質代謝。本研究結果進一步闡明了 TRPV4 通道活性增強對脂質代謝的調控作用及其相關機制，有望為肥胖及其相關代謝綜合征的發生發展研究提供新思路。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
近年來，隨著社會的飛速發展以及人們生活水平的迅速提高，人們飲食習慣及方式不斷發生改變，肥胖人數急劇增多[1]。而肥胖會造成體內的脂肪分布異常和/或脂肪因子調控失調，從而導致脂質代謝異常，進而誘發代謝綜合征、2 型糖尿病和心血管疾病等一系列慢性疾病，嚴重影響人們的生活質量[2-3]。瞬時受體電位香草酸亞型 4（transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4）屬于瞬時感受器家族成員之一，是一種非選擇性鈣離子（Ca2+）通道蛋白[4]。TRPV4 通道廣泛分布于多種類型的細胞中，包括脂肪細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞等，通過對 Ca2+的調節，在脂肪的生成、分解和調節脂質穩態過程中發揮重要作用[5-7]。而其活性易受多種刺激因素影響，包括滲透壓、機械刺激以及內源性和外源性化合物等[8]，在被特異性激活后可參與調節肥胖、代謝性疾病和高血壓等機體多種生理或病理過程[9-10]。GSK1016790A 是一種小分子 TRPV4 特異性激動劑，在野生型 TRPV4 動物模型中其被發現可上調 TRPV4 mRNA 在細胞或組織中的表達水平[11]。雖然目前很多文獻報道激活 TRPV4 通道對脂肪細胞內源性調控具有一定影響，但其明確機制目前尚不完全清楚。代謝組學是一種從分子水平對代謝終端產物進行研究的系統生物學方法，目前廣泛應用于生物體內源性小分子代謝物含量變化和相關代謝通路的研究[12-13]。通過代謝組學獲得大量代謝特征、分析代謝數據、篩選出差異代謝物并明確代謝途徑對探究代謝物與生理病理變化之間的相互關系和藥物治療機制具有較好指導意義。因此本研究通過使用 TRPV4 激動劑 GSK1016790A 探討 TRPV4 通道蛋白活性增強對成熟脂肪細胞脂質代謝的影響，為肥胖及其相關代謝綜合征的發生發展研究提供新思路。
1 材料與方法
1.1 細胞
小鼠 3T3-L1 前脂肪細胞系（小鼠胚胎成纖維細胞）：購于上海蓋寧生物科技有限公司。
1.2 主要試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
GSK1016790A、牛胰島素（美國 MedChemExpress 公司）；Dulbecco 改良 Eagle 培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM）、青鏈霉素、胰蛋白酶（美國 Gibco 公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（美國 Sigma 公司）；cell counting kit-8（CCK-8）試劑盒（美國 Zeta Life 公司）；甘油三酯檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RNAiso Plus、TB Green? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus)（日本 Takara 公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2.2 主要儀器
UPLC I-Class Plus 超高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；Q Exactive 高分辨質譜儀、實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）儀（美國 Thermo 公司）；Infinite E Plex 酶標儀（美國 Bio-Tek 公司）；Maxi Vacbeta 冷凍真空濃縮儀（中國香港 GeneCompany 公司）；Olympus DP71 顯微照相系統（日本 Olympus 公司）。
1.3 方法
1.3.1 細胞培養
將復蘇好的 3T3-L1 前脂肪細胞培養于 T25 培養瓶中，培養液為含有 10% 胎牛血清和 1% 青鏈霉素的 DMEM 完全培養液，放入溫度 37℃、二氧化碳含量 5%、相對濕度 100% 的培養箱中培養。觀察細胞狀態，當細胞量達到 90% 時進行傳代。
1.3.2 CCK-8 法檢測細胞活力
將 3T3-L1 前脂肪細胞接種于 96 孔板中培養。將 10 mmol/L 的 GSK1016790A 溶液取適量溶于完全培養基中配制成終濃度為 0.1、1、10 μmol/L 的溶液干預細胞 48 h，同時設只用完全培養基培養的 3T3-L1 前脂肪細胞作為空白組。加入預配好的 CCK-8 試劑 110 μL，孵育約 1 h 后在酶標儀上 450 nm 波長處測量吸光度值，將各組吸光度值與對照組比較，確定最適宜的干預濃度。細胞活力（%）=（A實驗組?A空白組）/（A對照組?A空白組）×100%，其中 A 表示吸光度值。
1.3.3 細胞誘導分化
實驗共分為 3 組，即空白組（3T3-L1 前脂肪細胞）、對照組（成熟脂肪細胞）和 GSK 組（成熟脂肪細胞+GSK1016790A）。
對照組和 GSK 組細胞的誘導分化：將 3T3-L1 前脂肪細胞以 1×105 個/mL 密度接種在六孔板。生長至完全匯合（即出現接觸抑制）后 2 d 后開始誘導分化（即誘導分化 0 d），加入誘導培養基（含 10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素混合液、胰島素 10 mg/L、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 0.5 mmol/L、地塞米松 1.0 μmol/L 的 DMEM 培養基），2 d 后換成分化培養基（含 10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素混合液、胰島素 10 mg/L 的 DMEM 培養基），繼續培養 2 d，隨后換為完全培養基（含 10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素混合液的 DMEM 培養基），2 d 換液 1 次，繼續培養 4 d，誘導分化第 8 天后即為分化完成，細胞由 3T3-L1 前脂肪細胞轉變為成熟脂肪細胞。其中 GSK 組在誘導培養基、分化培養基和完全培養基中均加入 GSK1016790A。
1.3.4 油紅 O 染色
棄去六孔板內培養基；每孔加入 2 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）輕輕沖洗 2 次；然后用 2 mL 4% 多聚甲醛避光固定細胞 30 min，棄去固定液加超純水清洗 2 次；用 60% 異丙醇浸洗 5 min 后加入油紅 O 溶液避光放置 37℃培養箱中染色 30 min；棄去染色液用超純水洗 2～5 次，直至無多余染液。染色后成熟脂肪細胞內脂質呈紅色，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。
1.3.5 實時熒光定量 PCR 檢測 TRPV4 表達水平
應用 RNAiso Plus 提取細胞總 RNA，超微量分光光度計檢測總 RNA 的濃度。逆轉錄合成第 1 鏈，以此為模板進行擴增，β-actin 作為內參基因。TRPV4 正向引物序列：5’-ATGGCAGATCCTGGTGATGG-3’；反向引物序列：5’-GGAACTTCATACGCAGGTTTGG-3’。Β-actin 正向引物序列：5’-GCTTCTAGGCGGACTGTTAC-3’；反向引物序列：5’-CCATGCCAATGTTGTCTCTT-3’。PCR 反應程序第 1 步：預變性 95°C 30 s；第 2 步：變性 95°C 5 s，退火 60°C 30 s，循環 40 次；第 3 步：熔解曲線階段。采用 2?ΔΔCt 法進行相對定量分析，ΔΔCt=ΔCt 實驗?ΔCt 對照，ΔCt=CT 目的?CT 內參。熔解曲線單峰表示無引物二聚體等的非特異性擴增。
1.3.6 甘油三酯含量測定
收集各組細胞至離心管中，加入 200 μL PBS 后冰水浴條件下破碎細胞制備勻漿；依據甘油三酯檢測試劑盒說明書要求配制相應的工作液并在 96 孔板中進行點樣 2.5 μL，每孔中加入 250 μL 工作液后，37℃孵育 10 min，通過酶標儀在波長 546 nm 測吸光度，同時測定蛋白含量進行校正。甘油三酯含量（mmol/gprot）=（A樣本?A空白）/（A標準?A 空白）×C標準/Cprot，其中 A 表示吸光度值，C標準為標準品濃度 2.26 mmol/L，Cprot 為待測樣本勻漿蛋白濃度 gprot/L（prot 指蛋白）。
1.3.7 非靶向代謝組學檢測
① 色譜條件：BEH C18 色譜柱：正離子模式流動相為含 0.1% 甲酸的水溶液（A 液）和含 0.1% 甲酸的甲醇（B 液），負離子模式流動相為含 10 mmol/L 甲酸銨的水溶液（A 液）和含 10 mmol/L 甲酸銨的 95% 甲醇（B 液）。梯度洗脫：第 0～1 分鐘，2% B 液；第 1～9 分鐘，2%→98% B 液；第 9～12 分鐘，98% B 液；第 12～12.1 分鐘，98%→2% B 液；第 12.1～15 分鐘，2% B 液。流速為 0.35 mL/min，柱溫 45°C，進樣量為 5 μL。
② 質譜條件：利用 Q Exactive 質譜儀進行一級、二級質譜數據采集。質譜掃描質核比范圍為 70～1050，一級分辨率為 70000，自動增益控制為 3×106，最大注入時間為 100 ms。按照母離子強度，選擇排名前三的離子進行碎裂，采集二級信息，二級分辨率為 17500，自動增益控制為 1×105，最大注入時間為 50 ms，碎裂能量設置為 20、40、60 eV。離子源參數設置：鞘氣流速為 40，輔助氣流速為 10，噴霧電壓正離子模式為 3.80，負離子模式為 3.20，離子傳輸管溫度為 320℃，輔助氣加熱溫度為 350℃。
③ 細胞樣本收集：在六孔板中按照上述 1.3.3 進行干預，每種處理組 6 個平行組別；干預完成的細胞（確保每孔的細胞至少有 1×106 個）；用 PBS 清洗細胞 3 次后，每孔加入 1 mL PBS 將細胞吹打下后轉移到 2 mL 的離心管中。1000×g 4℃離心 10 min 棄上清液收集沉淀細胞；液氮速凍 15 min，存于?80℃冰箱保存備用。
④ 提取細胞代謝物：稱取 25 mg 細胞沉淀加入 2 mL 加厚離心管中，同時加入 2 顆小磁珠；每個樣品同時加入 10 μL 內標；向樣本中加 800 μL 沉淀劑（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1），50 Hz 研磨 5 min；將研磨好的樣本放置于–20℃沉淀 2 h；將樣品放入離心機中離心（25000×g 4℃，15 min），每個樣品各取 600 μL 加入新的離心管中，冷凍抽干；向抽干后的樣品中加入 120 μL 50% 甲醇，振蕩直至完全溶解；25000×g 4℃離心 15 min，取上清液置于新的離心管中；每個樣本取 10 μL 混合成質量控制（質控）樣本，用于評估超高效液相色譜-質譜聯用分析過程的穩定性和重復性。分別將正、負離子模式下所有的質控樣本的基峰色譜圖進行譜圖疊加比較，各色譜峰的響應強度和保留時間重疊度越高，則說明方法穩定性越好；計算每個代謝物在質控樣本中的定量值的變異系數（coefficient of variation, CV），CV 越小表示定量結果的重復性越好。
⑤ 代謝物離子峰提取和代謝物鑒定：將質譜的下機數據導入 Compound Discoverer 3.3 軟件，結合 mzCloud 數據庫和 ChemSpider 在線數據庫進行質譜數據分析后，得到包含代謝物峰面積和鑒定結果等信息的數據矩陣，之后對該表格進一步進行信息分析處理。
1.4 統計學方法
1.4.1 細胞實驗數據
使用 SPSS 25.0 軟件進行統計分析，用 GraphPad Prism 8.0 軟件繪制統計圖。兩組間比較采用兩獨立樣本 t 檢驗（正態分布）或 Wilcoxon 秩和檢驗（非正態分布）；多組間比較采用單因素方差分析（正態分布）或 Kruskal-Wallis H 秩和檢驗（非正態分布），差異有統計學意義則進一步采用最小顯著差異 t 檢驗（正態分布）或“Kruskal-Wallis One-way ANOVA （k samples）”中的“All pariwise”（非正態分布）進行兩兩比較。雙側檢驗水準 α=0.05。
1.4.2 代謝組學數據
對峰面積歸一化后導入 R 4.0.4 metaX 軟件包進行多元統計分析。采用主成分分析與正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA），對比京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）和人類代謝組數據庫（Human Metabolome Database, HMDB）等數據庫，對代謝物進行指認，通過變量權重值≥1、差異變化倍數≥1.2 或≤0.83、P<0.05 這 3 個條件篩選得到差異代謝物，篩查出潛在的代謝標志物；采用 MetaboAnalyst 5.0 在線分析平臺可視化潛在的代謝標志物，并對差異代謝物進行通路富集分析。
2 結果
2.1 CCK-8 法測定藥物對 3T3-L1 細胞增殖的影響
通過 CCK-8 法測定觀察 3T3-L1 細胞在不同濃度激動劑（GSK1016790A）干預下的細胞存活率，為后續代謝組給藥濃度提供參考。結果顯示，與對照組相比，在前脂肪細胞上 0.1 μmol/L 的 GSK1016790A 作用 48 h，細胞存活率沒有顯著改變（P>0.05），見圖1。因此后續篩選 GSK1016790A 0.1 μmol/L 這個濃度作為細胞的作用劑量。
圖1
不同濃度 GSK1016790A 對 3T3-L1 細胞干預 48 h 后存活率的影響
GSK10 μM：GSK1016790A 10 μmol/L 組；GSK1 μM：GSK1016790A 1 μmol/L 組；GSK0.1 μM：GSK1016790A 0.1 μmol/L 組；*與對照組相比，
2.2 油紅 O 染色鑒定成熟脂肪細胞
油紅 O 染色后可見含有明亮橘紅色脂滴的成熟脂肪細胞在視野中占 90% 以上，與對照組（圖2a）相比，加入 TRPV4 激動劑 GSK1016790A 的 GSK 組脂滴顯著增多（圖2b）。
圖2
倒置顯微鏡下鑒定成熟脂肪細胞（油紅 O 染色 ×400）
a. 對照組，為正常成熟脂肪細胞；b. GSK 組，脂肪細胞脂滴顯著增多
2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 TRPV4 表達水平
采用實時熒光定量 PCR 法檢測 TRPV4 mRNA 表達水平。結果表明，與成熟脂肪細胞相比，空白組 TRPV4 mRNA 表達水平顯著降低（P<0.001），而 GSK 組則明顯上調（P<0.01），見圖3a。
圖3
GSK1016790A 干預后脂肪細胞中 TRPV4 mRNA 及甘油三酯表達水平
a.
2.4 成熟脂肪細胞中甘油三酯水平檢測
各組細胞誘導分化 14 d 后檢測細胞中甘油三酯水平，結果表明，相比于對照組，GSK 組細胞中甘油三酯水平顯著上升（P<0.05），見圖3b。
2.5 代謝組學檢測 GSK1016790A 對成熟脂肪細胞內源性代謝的影響
2.5.1 方法穩定性和重復性評價
各色譜峰的響應強度和保留時間重疊度高，說明儀器檢測過程的穩定性良好，數據質量可靠。CV≤30% 的代謝物數量占代謝物總數的比值為 80%，表明儀器分析系統重復性較好，數據可以用于后續分析。
2.5.2 代謝物的分類和功能注釋
參照 KEGG 數據庫，對鑒定到的代謝物進行分類注釋和功能注釋，以了解不同代謝物的功能特性，確定代謝物參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。圖4a 顯示了本實驗鑒定到的代謝物種類，主要包括脂類 265 種，氨基酸、肽及類似物 102 種和碳水化合物 39 種等。圖4b 顯示了本研究篩選到的 12 個代謝通路大類，主要包括氨基酸代謝通路、脂質代謝通路、碳水化合物代謝通路、核苷酸代謝通路和能量代謝通路等。其中氨基酸代謝通路上富集到 61 個代謝物，脂質代謝通路上富集到 58 個代謝物，碳水化合物代謝通路上富集到 39 個代謝物，核苷酸代謝通路上富集到 38 個代謝物。
圖4
代謝物分類和功能注釋圖
a. 代謝物分類條形圖，沒有分類信息的鑒定結果不參與統計；b. 代謝物通路分類條形圖
2.5.3 多元統計分析
首先對全部樣本采用主成分分析，從總體上初步了解組間的差異程度，結果顯示空白組、對照組和 GSK 組分別聚集在左右兩側，表明其代謝圖譜存在明顯的差異。然后進行兩兩組之間主成分分析，可以看出在空白組和對照組、GSK 組和對照組數據分散在不同區域，說明有較好的組間差異性和組內聚集性（圖5）。
圖5
代謝物主成分分析圖
a. 總體主成分分析圖；b. 對照組和空白組主成分得分圖；c. GSK 組和對照組主成分得分圖。各組樣本量均為
進一步采用 OPLS-DA 分析結果顯示，空白組與對照組、對照組與 GSK 組代謝物可顯著地分開。模型評價參數如下：空白組比對照組：R2Y=0.995，Q2=0.976；GSK 組比對照組 R2Y=0.989，Q2=0.969，表明模型具有較好的解釋和預測能力。采用置換檢驗進行驗證，對 OPLS-DA 模型進行 200 次響應置換檢驗后空白組比對照組模型的截距R2=0.75，Q2=0.49；GSK 組比對照組模型截距R2=0.75，Q2=0.42。置換檢驗圖發現 R2、Q2 均小于右端，前者在后者之上，表明模型有效可靠，未產生過擬合現象（圖6）。
圖6
各組正交偏最小二乘法分析模型得分圖及置換檢驗圖
a、b. 對照組與空白組比較；c、d. GSK 組與對照組比較。a、c 為正交偏最小二乘法分析模型得分圖，Orthogonal T score 表示正交成分得分值，T score 表示成分得分值；b、d 為置換檢驗圖，Value 表示預測誤差，Cor 表示相關系數，Intercepts 表示截距，
2.5.4 差異代謝物的篩選和分析
空白組和對照組共鑒定出 595 種差異代謝物，其中 374 種上調，221 種下調；GSK 組和對照組共鑒定出 430 種差異代謝物，其中 272 種上調，158 種下調。利用火山圖對差異代謝物進行可視化展示（圖7）。
圖7
各組差異代謝物火山圖
a. 對照組與空白組比較；b. GSK 組與對照組比較。Fold Change：差異變化倍數；
將兩組差異代謝物取交集，并結合 HMDB 和 KEGG 數據庫，找出了 TRPV4 激動劑 GSK1016790A 干預后出現顯著性變化的差異代謝物（表1）。共 45 種代謝物，其中 2-amino-1,3,4-octadecanetriol（2-氨基-1,3,4-十八烷三醇）、linoleic acid（亞油酸）、sphingosine（鞘氨醇）、sphinganine（鞘氨酸）、butabarbital（丁巴比妥）、2-(14,15-epoxyeicosatrienoyl) glycerol 等 36 種代謝物含量在誘導為成熟脂肪細胞后上升，TRPV4 激動劑給藥后繼續上升；sn-glycerol 3-phosphate（甘油-3-磷酸酰基轉移酶）、uridine（尿苷）、guanine（鳥嘌呤）、adenosine（腺苷）、4-{[3-(hydroxymethyl)phenyl]amino}-n-(isopropylcarbamoyl)-3-pyridinesulfonamide、pyrogallol-2-o-glucuronide 等 9 種代謝物含量在誘導為成熟脂肪細胞后下降，TRPV4 激動劑給藥后繼續下降。
表1
GSK1016790A 干預后顯著變化的代謝物
2.5.5 代謝通路分析
基于 TRPV4 激動劑 GSK1016790A 干預后變化的代謝物進行代謝通路分析，以 P<0.05 為條件共篩選出 13 條代謝通路，包括鞘脂信號傳導通路、鞘脂代謝通路、ABC 轉運蛋白通路、不飽和脂肪酸的生物合成通路、嘌呤代謝通路、環磷酸鳥苷-環磷酸鳥苷依賴的蛋白激酶信號通路、皮質醇合成和分泌通路、卵巢類固醇合成通路、環磷酸腺苷信號通路、亞油酸代謝通路、甘油脂代謝通路、神經活性配體-受體相互作用通路和甘油磷脂代謝通路。將匹配到的代謝通路繪制氣泡圖進行可視化展示（圖8）。其中影響較顯著的是鞘脂代謝通路和不飽和脂肪酸的生物合成通路。
圖8
GSK1016790A 干預代謝通路富集分析氣泡圖
富集因子=當前通路中包含的目標代謝物數/當前通路中所有代謝物；圓點大小代表注釋到該通路的差異代謝物數目；cGMP：環磷酸鳥苷；PKG：cGMP 依賴的蛋白激酶；cAMP：環磷酸腺苷
3 討論
肥胖是由機體脂質代謝功能異常導致脂肪細胞脂肪生成過多的一種慢性代謝性疾病，而 TRPV4 也已被證實可通過調節活性對脂肪細胞內源性調控產生一定影響，但其代謝機制較為復雜，關于 TRPV4 通道蛋白活性改變對脂肪細胞脂肪代謝的具體調控作用機制還未見相關報道。因此本研究應用代謝組學技術，從分子水平探討 TRPV4 特異性激動劑處理后對脂肪細胞分化期間發生的具體代謝變化的影響，識別 TRPV4 通道蛋白活性改變影響的關鍵差異代謝物和代謝通路，以期為探究 TRPV4 通道蛋白活性改變對脂肪細胞脂質代謝的調控作用提供思路，同時，為預防和治療肥胖及其相關代謝綜合征提供理論依據。
本研究首先利用 3T3-L1 前脂肪細胞誘導成熟脂肪細胞模型，油紅 O 染色后可見對照組的成熟脂肪細胞內有明顯脂滴生成，表明模型誘導成功；進一步在誘導全過程中加入 TRPV4 激動劑（GSK 組）促使 TRPV4 mRNA 表達水平顯著上調（P<0.01），誘導完成后觀察 GSK 組脂滴生成明顯增多且甘油三酯含量顯著上調（P<0.05）。這表明激活 TRPV4 通道蛋白活性可以促進脂肪細胞的脂肪生成。
而為了進一步探討 TRPV4 通道蛋白調節脂肪細胞脂質代謝的作用途徑，本研究應用非靶向代謝組學對脂肪細胞樣本進行分析，并對差異代謝物進行鑒定。首先對總體數據進行主成分分析，發現不同處理組之間均存在差異。為了進一步區分不同組的差異代謝物，構建了 OPLS-DA 模型，從 OPLS-DA 得分圖中可以看出空白組和對照組、對照組和 GSK 組兩組之間的代謝物均能明顯分離。結合對模型的驗證結果，各組之間構建的模型效果都比較好，均未產生過擬合現象，可以很好地說明不同組之間的代謝物存在差異。通過對鑒定到的代謝物進行分析發現 GSK1016790A 給藥后成熟脂肪細胞中共有 45 個內源性代謝物發生顯著變化，將數據導入 KEGG 數據庫共鑒定出包括鞘脂代謝和不飽和脂肪酸的生物合成等 13 條代謝通路。
差異代謝物鞘氨酸、鞘氨醇和 2-氨基-1,3,4-十八烷三醇參與鞘脂代謝。鞘脂是一類以鞘氨醇為骨架的復雜化合物，包括鞘氨醇、神經酰胺和鞘磷脂等[14]。研究表明，鞘脂代謝異常與肥胖和胰島素抵抗病理過程密切相關[15-16]。Samad 等[17]利用高脂食物誘導的肥胖小鼠模型發現總脂肪鞘磷脂和神經酰胺水平降低但鞘氨醇水平增加，表明鞘脂會通過水解轉化為神經酰胺，神經酰胺再通過神經酰胺酶的作用進一步代謝為鞘氨醇。而本研究通過代謝組學技術發現 GSK1016790A 給藥后鞘氨醇水平顯著增加，亦證明 TRPV4 激動劑可通過調控鞘脂代謝來干預脂肪細胞脂質代謝。
差異代謝物亞油酸等參與不飽和脂肪酸的生物合成通路。亞油酸是一種具有多種生物活性的多不飽和脂肪酸，是過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferators-activate receptor γ, PPARγ）激動劑。PPARγ 參與調節 3T3-L1 前脂肪細胞生長分化與脂質生成[18-20]。當 PPARγ 被激活時可以通過活化脂肪細胞中乙酰輔酶 A、葡萄糖轉運體 4 等促進脂肪細胞中甘油三酯合成增加，導致脂肪細胞體積增大[21-22]。與空白組相比，對照組亞油酸表達水平顯著上調；與對照組相比，GSK 組亞油酸表達水平繼續上調。這提示 TRPV4 激動劑參與調控不飽和脂肪酸的生物合成和亞油酸代謝來促進脂肪生成，引起肥胖。
綜上所述，通過分析差異代謝物以及相關代謝通路，結合其生物學意義，我們推測 GSK1016790A 可能通過激活 TRPV4 通道蛋白活性促進脂肪細胞內脂肪生成，同時參與調節不飽和脂肪酸的生物合成通路和鞘脂代謝通路等代謝途徑，影響脂肪細胞脂質代謝。本研究結果進一步闡明了 TRPV4 通道活性增強對脂質代謝的調控作用及其相關機制，有望為肥胖及其相關代謝綜合征的發生發展研究提供新思路。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
