引用本文： 李紅艷, 毛安瓊, 劉婷, 彭明慧, 張敏, 張英. 過氧化氫誘導慢性氧化應激參與小膠質細胞衰老的作用及機制. 華西醫學, 2023, 38(8): 1188-1194. doi: 10.7507/1002-0179.202302081 復制
衰老是與年齡有關疾病的最大危險因素[1]，例如神經退行性疾病[2-3]。衰老相關的神經退行性疾病療效不佳，帶來巨大的社會負擔和個人負擔[4]。因此，研究中樞神經系統衰老機制及延緩中樞神經系統細胞衰老防治策略尤為重要。小膠質細胞是中樞神經系統的常駐免疫細胞，具有炎癥調節、突觸連接等多種功能[5]，對維持腦穩態十分重要[6]。人腦中衰老的小膠質細胞限制了小膠質細胞在應激下的增殖能力[7]，影響小膠質細胞發揮作用，使其分化偏向于促炎表型而遠離抗炎表型[8]。因此，衰老大腦中發生的進行性腦炎癥狀態和小膠質細胞衰老可能具有相關性[6]。此外，神經炎癥與神經退行性疾病有關，而小膠質細胞是中樞神經系統炎癥反應的關鍵調節因子之一[9]。因此，研究小膠質細胞衰老對于對抗衰老腦組織中持續的慢性炎癥具有重要意義。但目前針對于小膠質細胞的衰老模型尚無系統性研究。
體外衰老細胞模型的構建分為復制性衰老和誘導型衰老，復制性衰老為通過多次反復傳代使細胞進入生長停滯狀態，本質為端粒被逐漸侵蝕[10]，復制性衰老往往需要反復傳代，耗費的時間較長[11]；誘導型衰老是指通過藥物誘導劑誘導細胞衰老，其中過氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）是最常用的誘導劑[11]，用于誘導多種細胞的衰老[12-13]。因此，本研究通過 H2O2 誘導建立 BV2 小膠質細胞體外細胞衰老模型，以為研究小膠質細胞衰老機制及其所參與的衰老、神經退行性疾病提供體外細胞衰老實驗模型。
1 材料與方法
1.1 主要材料和儀器
主要材料包括：BV2 小膠質細胞系（ATCC 細胞庫）；添加 F12 的杜皮克氏改良伊格爾氏培養基（Dulbeccos modified Eagle’s medium/F12, DMEM/F12）（美國 GIBCO 公司）、胎牛血清（美國 GIBCO 公司）；青霉素-鏈霉素溶液（中國碧云天公司）；CCK8（cell counting kit-8）試劑（中國愛必信公司）；衰老相關的β半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）染色試劑盒（中國索萊寶公司）；Trizol 裂解液、逆轉錄試劑、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）擴增試劑（日本寶生物公司）。基因引物由成都擎科生物公司合成。
主要儀器包括：Synergy2 多功能酶標儀（美國伯騰公司）、尼康倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）、PCR 儀（中國賽默飛世爾科技公司）、Roche 熒光定量 PCR 儀（美國羅氏 LightCycler480 公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 連續多次傳代構建 BV2 小膠質細胞系復制性衰老模型
選用 10 代以內的小膠質細胞，接種于 25 mL 培養瓶中，培養皿中含 5 mL DMEM/F12 完全培養基（MEM/F12，10% 胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素溶液）。待細胞生長至 80%濃度即進行傳代，將細胞連續傳代至 20 代。
1.2.2 H2O2 誘導慢性氧化應激構建細胞衰老模型
選用 10 代以內的小膠質細胞，接種于 25 mL 培養瓶中，培養皿中含 5 mL DMEM/F12 完全培養基（DMEM/F12，10% 胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素溶液）。將其隨機分為 4 組：對照組（不做任何處理），H2O2-50 μmol/L 組（完全培養基中加入 50 μmol/L H2O2），H2O2-100 μmol/L 組（完全培養基中加入 100 μmol/L H2O2），H2O2-200 μmol/L 組（完全培養基中加入 200 μmol/L H2O2）。4 組細胞均處理 8 d，每 2 天換 1 次含 H2O2 的完全培養基。
1.2.3 CCK8 檢測 BV2 小膠質細胞增殖活力
收集 4 組細胞，以 1 ×104 個/cm2 接種于 96 孔板，每孔 100 μL，待完全貼壁后 H2O2 組繼續使用 H2O2 溶液誘導 2 d 后取出 96 孔板，每孔加入 10 μL CCK8 試劑，放入 CO2 培養箱培養 2 h 后，用酶標儀測定各孔在 490 nm 處的吸光度，并記錄實驗孔吸光度、對照組吸光度、空白孔吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=［（實驗孔吸光度–空白孔吸光度）/（對照組吸光度–空白孔吸光度）］×100%。
1.2.4 SA-β-gal 染色
將細胞以 3×104 個/cm2 接種于 24 孔板， 細胞完全貼壁后模型組使用 H2O2 溶液誘導 8 d，進行 SA-β-gal 染色。步驟如下：① 吸出 24 孔板里的培養液，使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）清洗 2 次；② 吸出孔里的清洗液，每孔加入 500 μL 固定液，室溫固定孵育 15 min；③ 吸出固定液，每孔加入 500 μL PBS 洗滌 3 min，共洗滌 3 次；④ 洗滌后，按照說明書中提示比例［β半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-gal）染色液 A 10 μL，β-gal 染色液 B 10 μL，β-gal 染色液 C 930 μL，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）溶液 50 μL］配制染色工作液，每個孔加入 500 μL 染色工作液，用保鮮膜封閉放置于 37℃烘箱過夜；⑤ 在光學顯微鏡下觀察，衰老的細胞呈藍色。隨機選擇 3 個重復孔的視野進行細胞計數，并計算染色陽性率。SA-β-gal 染色陽性率（%）=（藍染細胞數/總細胞數）×100%。
1.2.5 RNA 提取與基因表達分析
將細胞以 1×105 個/cm2 接種于 6 孔板，細胞完全貼壁后模型組使用 H2O2 溶液誘導 8 d 后進行 RNA 的提取。具體操作如下：每孔加入 1 mL Trizol 進行充分裂解后，加入 200 μL 三氯甲烷，劇烈震蕩 15 s 后冰上孵育 5 min，4℃ 12 000 rpm 離心 15 min，離心半徑 3 cm。離心結束后溶液共分為 3 層，RNA 位于最上層的上清中，小心吸取上清液，加入 1 mL 異丙醇，冰上孵育 10 min 后再次 4℃ 12 000 rpm 離心 15 min，離心半徑 3 cm，離心結束后可見 RNA 沉淀位于離心管底部。吸去上清后以 75%乙醇（使用無酶水配置）洗滌后小心吸出乙醇以并將離心管倒扣干燥，待 RNA 沉淀干燥后用無酶水溶解 RNA 沉淀。使用 Nanadrop 測定 RNA 的濃度，并調整總 RNA 使其濃度均為 1 000 ng/μL 左右，并使用瓊脂糖凝膠檢測 RNA 的完整性。將所提取的 RNA 反轉錄為 cDNA，通過實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）檢測細胞衰老基因（p16、p21、p53）及衰老相關分泌表型（senescence associated secretory phenotype, SASP）基因［白細胞介素-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、轉化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）、基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9, MMP9）］的表達情況。所用引物序列見表1。
表1
qRT-PCR 引物序列
1.3 統計學方法
以上實驗均重復至少 3 次，使用 Graphpad Prism 軟件進行統計學分析與制圖。若計量資料服從或近似服從正態分布，采用均數±標準差表示，組間比較使用單因素方差分析，多組間兩兩比較使用 LSD 檢驗；若計量資料不服從正態分布，采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間差異比較使用 Kruskal-Wallis 檢驗。計數資料采用頻數和百分比表示，組間比較采用 Fisher 精確檢驗。計量資料的效應量采用均數差（mean difference, MD），并計算 95%置信區間（confidence interval, CI）。因 10 代以內的細胞增殖能力無較大區別，故選取 8 代細胞作為 10 代以內的代表細胞。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BV2 小膠質細胞系復制性衰老模型構建
在誘導過程中，H2O2-200 μmol/L 對 BV2 小膠質細胞損傷較大，未到 8 d 細胞減少，因此未進行后續檢測。因此，本研究最終收集對照組、H2O2-50 μmol/L 組和 H2O2-100 μmol/L 組細胞。
不同代數 BV2 小膠質細胞 SA-β-gal 染色結果見圖1。如圖1 所示，20 代 BV2 小膠質細胞與 8 代 BV2 小膠質細胞均無明顯著色。
圖1
不同代數 BV2 小膠質細胞 SA-β-gal 染色（×100）
a. 8 代 BV2 小膠質細胞；b. 20 代 BV2 小膠質細胞。SA-β-gal：衰老相關的β半乳糖苷酶
2.2 細胞增殖能力比較
各組細胞存活率的比較和組間的多重比較結果見表2、3。由表2、3 可見，3 組的細胞存活率比較，差異有統計學意義（F=46.176，P<0.001）；組間多重比較顯示，與對照組比較，H2O2-50 μmol/L 對于 BV2 小膠質細胞增殖并無明顯抑制（P=0.944），但 H2O2-100 μmol/L 可抑制 BV2 小膠質細胞的增殖（P<0.001）。
表2
各組細胞存活率和 SA-β-gal 染色陽性率的比較（x±s，%）
表3
各組組間細胞存活率和 SA-β-gal 染色陽性率的多重比較（%）
2.3 衰老相關 SA-β-gal 染色比較
各組 SA-β-gal 染色見圖2。由圖2 可見，H2O2-50 μmol/L 組、H2O2-100 μmol/L 組細胞均有明顯藍染。各組細胞 SA-β-gal 染色陽性率的比較和組間的多重比較結果見表2、3。由表2、3 可見，3 組的 SA-β-gal 染色陽性率比較，差異有統計學意義（F=553.1，P<0.001）；其中 H2O2-100 μmol/L 組 SA-β-gal 染色陽性率均高于 H2O2-50 μmol/L 組和對照組（P<0.001），H2O2-50 μmol/L 組亦高于對照組（P<0.001）。
圖2
不同組間 SA-β-gal 染色（n=3，×100）
a. 對照組；b. H2O2-50 μmol/L 組；c. H2O2-100 μmol/L 組。衰老細胞呈藍色，非衰老細胞不著色；SA-β-gal：衰老相關的β半乳糖苷酶
2.4 不同濃度 H2O2 誘導 BV2 小膠質細胞衰老相關周期蛋白的表達
各組衰老相關周期蛋白 mRNA 表達差異的比較和組間的多重比較結果見表4、5。3 組間的 p16、p21、p53 比較，差異均有統計學意義（F=88.68、68.62、1 419.00，P<0.001）。組間多重比較顯示，應用 H2O2 均可使 p16、p21、p53 mRNA 水平明顯升高，其中，H2O2-100 μmol/L 相較于 H2O2-50 μmol/L 誘導可使 p16、p21、p53 mRNA 水平升高更明顯（P<0.001）。
表4
各組衰老相關周期蛋白和分泌表型 mRNA 表達差異的比較（n=3，x±s）
表5
各組組間衰老相關周期蛋白和分泌表型 mRNA 表達差異的多重比較（n=3）
2.5 不同濃度 H2O2 誘導 BV2 小膠質細胞衰老相關分泌表型的表達
各組衰老相關分泌表型 mRNA 表達差異的比較和組間的多重比較結果見表4、5。3 組間的 IL-1β、TGF-β、MMP9 比較，差異均有統計學意義（F=483.7、817.4、75.62，P<0.001）。組間多重比較顯示，應用 H2O2 均可使 IL-1β、TGF-β、MMP9 mRNA 上調（P<0.05），但 H2O2-100 μmol/L 相較于 H2O2-50 μmol/L 誘導可使 IL-1β、TGF-β、MMP9 mRNA 上調更明顯（P<0.001）。
3 討論
細胞衰老是一個旨在通過誘導組織重塑來消除不需要的細胞的過程[13]。通常，衰老細胞具有許多穩定特征，包括由 DNA 損傷反應或應激觸發的持久的生長停滯，抗增殖分子的表達（如 p16INK4a），損傷傳感信號通路的激活（如 p38MAPK 和 NF-κB），以及衰老相關分泌表型分子的表達變化[14-17]。越來越多的證據表明，衰老細胞隨著衰老和神經退行性疾病在神經系統中積累，并可使人易患神經退行性疾病或可能加重其病程[18]。細胞衰老主要分為 2 種，其一為復制性衰老[19]，即正常的體細胞在有限的分裂次數后，總是進入不可逆的生長停滯和功能改變的狀態的過程；其二為應激誘導的過早衰老[20]，即細胞暴露于不同濃度的 DNA 損傷劑（如 H2O2）增殖減慢、顯示出衰老的跡象。
本研究首先通過采取復制性衰老構建 BV2 小膠質細胞系，但傳代至 20 代的 BV2 小膠質細胞并未呈現出明顯衰老跡象，因此選用誘導性衰老。衰老誘導劑包括 H2O2、輻射、高糖、藥物等，其中 H2O2 是最常用的誘導劑，通常可在幾天內完成衰老模型構建，并對多種細胞有效[11]。因此使用 H2O2 建立氧化應激誘導細胞衰老模型可能為更好選擇。
在既往研究中，H2O2 誘導衰老模型針對于不同的細胞采取的劑量和時間具有差別，但 H2O2 作用時間都較短，一般為 2 h[21-22]。但本課題組前期在構建神經元細胞衰老模型實驗研究中發現，H2O2 短期高劑量誘導與長期低劑量誘導會導致 Nrf2 信號通路下游基因 HO-1、NQO-1 相反的表達，因此采取更接近自然環境機體衰老的 H2O2 低劑量、長期誘導。在劑量選擇方面，本研究綜合文獻考慮，采用了 50、100、200 μmol/L 3 個劑量。但在誘導過程中發現 200 μmol/L 對 BV2 小膠質細胞損傷較大，未到 8 d 細胞即所剩無幾，因此未進行后續檢測。盡管 CCK8 實驗發現，H2O2-50 μmol/L 似乎不能明顯抑制 BV2 細胞增殖，但在其他檢測方法中，H2O2-50 μmol/L 誘導的 BV2 小膠質細胞中衰老標志物表達明顯上調，但上調程度不如 H2O2-100 μmol/L 明顯。綜合以上實驗結果，H2O2-100 μmol/L 誘導 BV2 細胞 8 d 可成功構建 BV2 小膠質細胞衰老模型。
有文獻建議，體外細胞衰老的鑒定至少需要驗證 3 個不同的特征[23]。在本實驗中，通過檢測 4 個不同衰老特征用于驗證細胞衰老模型是否構建成功，并探究 H2O2 誘導慢性氧化應激導致 BV2 小膠質細胞衰老的可能機制。早在 1995 年，SA-β-gal 染色就被發現在不同年齡的人類供體的皮膚樣本中，真皮成纖維細胞和表皮角質形成細胞中該標志物的年齡依賴性增加，證明 SA-β-gal 可能存在并隨著體內年齡的增長而積累[24]，因此 SA-β-gal 廣泛應用于細胞衰老的測定。在本實驗中，H2O2 的長期慢性誘導均可使細胞變藍、SA-β-gal 陽性細胞率增高，表明 H2O2 可誘導 BV2 小膠質細胞呈現衰老表型，其中 H2O2-100 μmol/L 的陽性細胞率更高，表明 100 μmol/L 可能為誘導衰老更有效的劑量。
CCK8 普遍用于檢測細胞增殖活性，以對照組為參照，H2O2 組細胞增殖越慢，計算所得的細胞存活率就越低。本實驗結果可見，H2O2-100 μmol/L 組細胞存活率明顯下調，即明顯抑制細胞增殖，表明 H2O2 可能通過顯著抑制 BV2 小膠質細胞增殖使其進入衰老狀態。p16INK4a 是一種周期蛋白激酶抑制劑，已被證明在老年嚙齒動物、靈長類動物和人類的組織中增加[25-26]，因此它被認為是代表衰老的生物標志物。細胞衰老有 2 種最主要的機制，p53-p21-pRb 通路和 p16-pRb 通路[27-28]。DNA 和其他類型的大分子損傷最終通過激活 p53/p21 和 p16/RB 腫瘤抑制通路導致增殖停止[29]，p21 和 p16 通過抑制周期蛋白依賴激酶 CDK4、CDK6、CDK2 而阻礙細胞周期進程[30]。本實驗表明，H2O2 構建的誘導性細胞衰老均可使 p16、p21、p53 mRNA 上調，其中 H2O2-100 μmol/L 組較 H2O2-50 μmol/L 組上調更明顯，表明 H2O2 可通過激活 p16、p21、p53 介導的損傷通路阻礙細胞周期，從而影響細胞正常復制。
SASP 是指衰老細胞表達和分泌各種細胞外調節劑（包括細胞因子、趨化因子、蛋白酶、生長因子和生物活性脂質）的能力[31]。在本實驗中，選取 IL-1β、TGF-β、MMP9 用于檢測 SASP。IL-1β是一種致炎細胞因子，可用于檢測細胞衰老與誘導細胞衰老[32-33]。TGF-β是一種關鍵的促纖維化因子，具有抑制增殖作用[34]，在衰老組織中與衰老細胞中表達上調[35]。MMP9 是一種基質金屬蛋白酶，是眼部衰老和視網膜病變的前瞻性生物標志物[36]，是一種衰老相關生物標志物。在測定 SASP 分子的表達水平實驗中，H2O2 長時間誘導均可使 BV2 小膠質細胞中 IL-1β、TGF-β、MMP9 表達上調，提示 H2O2 誘導的慢性氧化應激可能通過激活促炎通路、促進纖維化及降解基底膜，從而促進細胞衰老。其中 100 μmol/L H2O2 組上調更明顯，表明劑量較高可能誘導衰老越明顯。
目前針對于 BV2 小膠質細胞構建的衰老模型并無系統性研究，但小膠質細胞在機體衰老過程中發揮重要作用，可能與中樞神經系統長期處于促炎狀態有關[37]。本實驗通過 H2O2 誘導 BV2 小膠質細胞構建細胞衰老模型，可為衰老及衰老相關的神經退行性疾病的研究提供實驗模型，并為 H2O2 誘導慢性氧化應激導致 BV2 小膠質細胞衰老的機制提供了實驗依據。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
衰老是與年齡有關疾病的最大危險因素[1]，例如神經退行性疾病[2-3]。衰老相關的神經退行性疾病療效不佳，帶來巨大的社會負擔和個人負擔[4]。因此，研究中樞神經系統衰老機制及延緩中樞神經系統細胞衰老防治策略尤為重要。小膠質細胞是中樞神經系統的常駐免疫細胞，具有炎癥調節、突觸連接等多種功能[5]，對維持腦穩態十分重要[6]。人腦中衰老的小膠質細胞限制了小膠質細胞在應激下的增殖能力[7]，影響小膠質細胞發揮作用，使其分化偏向于促炎表型而遠離抗炎表型[8]。因此，衰老大腦中發生的進行性腦炎癥狀態和小膠質細胞衰老可能具有相關性[6]。此外，神經炎癥與神經退行性疾病有關，而小膠質細胞是中樞神經系統炎癥反應的關鍵調節因子之一[9]。因此，研究小膠質細胞衰老對于對抗衰老腦組織中持續的慢性炎癥具有重要意義。但目前針對于小膠質細胞的衰老模型尚無系統性研究。
體外衰老細胞模型的構建分為復制性衰老和誘導型衰老，復制性衰老為通過多次反復傳代使細胞進入生長停滯狀態，本質為端粒被逐漸侵蝕[10]，復制性衰老往往需要反復傳代，耗費的時間較長[11]；誘導型衰老是指通過藥物誘導劑誘導細胞衰老，其中過氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）是最常用的誘導劑[11]，用于誘導多種細胞的衰老[12-13]。因此，本研究通過 H2O2 誘導建立 BV2 小膠質細胞體外細胞衰老模型，以為研究小膠質細胞衰老機制及其所參與的衰老、神經退行性疾病提供體外細胞衰老實驗模型。
1 材料與方法
1.1 主要材料和儀器
主要材料包括：BV2 小膠質細胞系（ATCC 細胞庫）；添加 F12 的杜皮克氏改良伊格爾氏培養基（Dulbeccos modified Eagle’s medium/F12, DMEM/F12）（美國 GIBCO 公司）、胎牛血清（美國 GIBCO 公司）；青霉素-鏈霉素溶液（中國碧云天公司）；CCK8（cell counting kit-8）試劑（中國愛必信公司）；衰老相關的β半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）染色試劑盒（中國索萊寶公司）；Trizol 裂解液、逆轉錄試劑、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）擴增試劑（日本寶生物公司）。基因引物由成都擎科生物公司合成。
主要儀器包括：Synergy2 多功能酶標儀（美國伯騰公司）、尼康倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）、PCR 儀（中國賽默飛世爾科技公司）、Roche 熒光定量 PCR 儀（美國羅氏 LightCycler480 公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 連續多次傳代構建 BV2 小膠質細胞系復制性衰老模型
選用 10 代以內的小膠質細胞，接種于 25 mL 培養瓶中，培養皿中含 5 mL DMEM/F12 完全培養基（MEM/F12，10% 胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素溶液）。待細胞生長至 80%濃度即進行傳代，將細胞連續傳代至 20 代。
1.2.2 H2O2 誘導慢性氧化應激構建細胞衰老模型
選用 10 代以內的小膠質細胞，接種于 25 mL 培養瓶中，培養皿中含 5 mL DMEM/F12 完全培養基（DMEM/F12，10% 胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素溶液）。將其隨機分為 4 組：對照組（不做任何處理），H2O2-50 μmol/L 組（完全培養基中加入 50 μmol/L H2O2），H2O2-100 μmol/L 組（完全培養基中加入 100 μmol/L H2O2），H2O2-200 μmol/L 組（完全培養基中加入 200 μmol/L H2O2）。4 組細胞均處理 8 d，每 2 天換 1 次含 H2O2 的完全培養基。
1.2.3 CCK8 檢測 BV2 小膠質細胞增殖活力
收集 4 組細胞，以 1 ×104 個/cm2 接種于 96 孔板，每孔 100 μL，待完全貼壁后 H2O2 組繼續使用 H2O2 溶液誘導 2 d 后取出 96 孔板，每孔加入 10 μL CCK8 試劑，放入 CO2 培養箱培養 2 h 后，用酶標儀測定各孔在 490 nm 處的吸光度，并記錄實驗孔吸光度、對照組吸光度、空白孔吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=［（實驗孔吸光度–空白孔吸光度）/（對照組吸光度–空白孔吸光度）］×100%。
1.2.4 SA-β-gal 染色
將細胞以 3×104 個/cm2 接種于 24 孔板， 細胞完全貼壁后模型組使用 H2O2 溶液誘導 8 d，進行 SA-β-gal 染色。步驟如下：① 吸出 24 孔板里的培養液，使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）清洗 2 次；② 吸出孔里的清洗液，每孔加入 500 μL 固定液，室溫固定孵育 15 min；③ 吸出固定液，每孔加入 500 μL PBS 洗滌 3 min，共洗滌 3 次；④ 洗滌后，按照說明書中提示比例［β半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-gal）染色液 A 10 μL，β-gal 染色液 B 10 μL，β-gal 染色液 C 930 μL，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）溶液 50 μL］配制染色工作液，每個孔加入 500 μL 染色工作液，用保鮮膜封閉放置于 37℃烘箱過夜；⑤ 在光學顯微鏡下觀察，衰老的細胞呈藍色。隨機選擇 3 個重復孔的視野進行細胞計數，并計算染色陽性率。SA-β-gal 染色陽性率（%）=（藍染細胞數/總細胞數）×100%。
1.2.5 RNA 提取與基因表達分析
將細胞以 1×105 個/cm2 接種于 6 孔板，細胞完全貼壁后模型組使用 H2O2 溶液誘導 8 d 后進行 RNA 的提取。具體操作如下：每孔加入 1 mL Trizol 進行充分裂解后，加入 200 μL 三氯甲烷，劇烈震蕩 15 s 后冰上孵育 5 min，4℃ 12 000 rpm 離心 15 min，離心半徑 3 cm。離心結束后溶液共分為 3 層，RNA 位于最上層的上清中，小心吸取上清液，加入 1 mL 異丙醇，冰上孵育 10 min 后再次 4℃ 12 000 rpm 離心 15 min，離心半徑 3 cm，離心結束后可見 RNA 沉淀位于離心管底部。吸去上清后以 75%乙醇（使用無酶水配置）洗滌后小心吸出乙醇以并將離心管倒扣干燥，待 RNA 沉淀干燥后用無酶水溶解 RNA 沉淀。使用 Nanadrop 測定 RNA 的濃度，并調整總 RNA 使其濃度均為 1 000 ng/μL 左右，并使用瓊脂糖凝膠檢測 RNA 的完整性。將所提取的 RNA 反轉錄為 cDNA，通過實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）檢測細胞衰老基因（p16、p21、p53）及衰老相關分泌表型（senescence associated secretory phenotype, SASP）基因［白細胞介素-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、轉化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）、基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9, MMP9）］的表達情況。所用引物序列見表1。
表1
qRT-PCR 引物序列
1.3 統計學方法
以上實驗均重復至少 3 次，使用 Graphpad Prism 軟件進行統計學分析與制圖。若計量資料服從或近似服從正態分布，采用均數±標準差表示，組間比較使用單因素方差分析，多組間兩兩比較使用 LSD 檢驗；若計量資料不服從正態分布，采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間差異比較使用 Kruskal-Wallis 檢驗。計數資料采用頻數和百分比表示，組間比較采用 Fisher 精確檢驗。計量資料的效應量采用均數差（mean difference, MD），并計算 95%置信區間（confidence interval, CI）。因 10 代以內的細胞增殖能力無較大區別，故選取 8 代細胞作為 10 代以內的代表細胞。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BV2 小膠質細胞系復制性衰老模型構建
在誘導過程中，H2O2-200 μmol/L 對 BV2 小膠質細胞損傷較大，未到 8 d 細胞減少，因此未進行后續檢測。因此，本研究最終收集對照組、H2O2-50 μmol/L 組和 H2O2-100 μmol/L 組細胞。
不同代數 BV2 小膠質細胞 SA-β-gal 染色結果見圖1。如圖1 所示，20 代 BV2 小膠質細胞與 8 代 BV2 小膠質細胞均無明顯著色。
圖1
不同代數 BV2 小膠質細胞 SA-β-gal 染色（×100）
a. 8 代 BV2 小膠質細胞；b. 20 代 BV2 小膠質細胞。SA-β-gal：衰老相關的β半乳糖苷酶
2.2 細胞增殖能力比較
各組細胞存活率的比較和組間的多重比較結果見表2、3。由表2、3 可見，3 組的細胞存活率比較，差異有統計學意義（F=46.176，P<0.001）；組間多重比較顯示，與對照組比較，H2O2-50 μmol/L 對于 BV2 小膠質細胞增殖并無明顯抑制（P=0.944），但 H2O2-100 μmol/L 可抑制 BV2 小膠質細胞的增殖（P<0.001）。
表2
各組細胞存活率和 SA-β-gal 染色陽性率的比較（x±s，%）
表3
各組組間細胞存活率和 SA-β-gal 染色陽性率的多重比較（%）
2.3 衰老相關 SA-β-gal 染色比較
各組 SA-β-gal 染色見圖2。由圖2 可見，H2O2-50 μmol/L 組、H2O2-100 μmol/L 組細胞均有明顯藍染。各組細胞 SA-β-gal 染色陽性率的比較和組間的多重比較結果見表2、3。由表2、3 可見，3 組的 SA-β-gal 染色陽性率比較，差異有統計學意義（F=553.1，P<0.001）；其中 H2O2-100 μmol/L 組 SA-β-gal 染色陽性率均高于 H2O2-50 μmol/L 組和對照組（P<0.001），H2O2-50 μmol/L 組亦高于對照組（P<0.001）。
圖2
不同組間 SA-β-gal 染色（n=3，×100）
a. 對照組；b. H2O2-50 μmol/L 組；c. H2O2-100 μmol/L 組。衰老細胞呈藍色，非衰老細胞不著色；SA-β-gal：衰老相關的β半乳糖苷酶
2.4 不同濃度 H2O2 誘導 BV2 小膠質細胞衰老相關周期蛋白的表達
各組衰老相關周期蛋白 mRNA 表達差異的比較和組間的多重比較結果見表4、5。3 組間的 p16、p21、p53 比較，差異均有統計學意義（F=88.68、68.62、1 419.00，P<0.001）。組間多重比較顯示，應用 H2O2 均可使 p16、p21、p53 mRNA 水平明顯升高，其中，H2O2-100 μmol/L 相較于 H2O2-50 μmol/L 誘導可使 p16、p21、p53 mRNA 水平升高更明顯（P<0.001）。
表4
各組衰老相關周期蛋白和分泌表型 mRNA 表達差異的比較（n=3，x±s）
表5
各組組間衰老相關周期蛋白和分泌表型 mRNA 表達差異的多重比較（n=3）
2.5 不同濃度 H2O2 誘導 BV2 小膠質細胞衰老相關分泌表型的表達
各組衰老相關分泌表型 mRNA 表達差異的比較和組間的多重比較結果見表4、5。3 組間的 IL-1β、TGF-β、MMP9 比較，差異均有統計學意義（F=483.7、817.4、75.62，P<0.001）。組間多重比較顯示，應用 H2O2 均可使 IL-1β、TGF-β、MMP9 mRNA 上調（P<0.05），但 H2O2-100 μmol/L 相較于 H2O2-50 μmol/L 誘導可使 IL-1β、TGF-β、MMP9 mRNA 上調更明顯（P<0.001）。
3 討論
細胞衰老是一個旨在通過誘導組織重塑來消除不需要的細胞的過程[13]。通常，衰老細胞具有許多穩定特征，包括由 DNA 損傷反應或應激觸發的持久的生長停滯，抗增殖分子的表達（如 p16INK4a），損傷傳感信號通路的激活（如 p38MAPK 和 NF-κB），以及衰老相關分泌表型分子的表達變化[14-17]。越來越多的證據表明，衰老細胞隨著衰老和神經退行性疾病在神經系統中積累，并可使人易患神經退行性疾病或可能加重其病程[18]。細胞衰老主要分為 2 種，其一為復制性衰老[19]，即正常的體細胞在有限的分裂次數后，總是進入不可逆的生長停滯和功能改變的狀態的過程；其二為應激誘導的過早衰老[20]，即細胞暴露于不同濃度的 DNA 損傷劑（如 H2O2）增殖減慢、顯示出衰老的跡象。
本研究首先通過采取復制性衰老構建 BV2 小膠質細胞系，但傳代至 20 代的 BV2 小膠質細胞并未呈現出明顯衰老跡象，因此選用誘導性衰老。衰老誘導劑包括 H2O2、輻射、高糖、藥物等，其中 H2O2 是最常用的誘導劑，通常可在幾天內完成衰老模型構建，并對多種細胞有效[11]。因此使用 H2O2 建立氧化應激誘導細胞衰老模型可能為更好選擇。
在既往研究中，H2O2 誘導衰老模型針對于不同的細胞采取的劑量和時間具有差別，但 H2O2 作用時間都較短，一般為 2 h[21-22]。但本課題組前期在構建神經元細胞衰老模型實驗研究中發現，H2O2 短期高劑量誘導與長期低劑量誘導會導致 Nrf2 信號通路下游基因 HO-1、NQO-1 相反的表達，因此采取更接近自然環境機體衰老的 H2O2 低劑量、長期誘導。在劑量選擇方面，本研究綜合文獻考慮，采用了 50、100、200 μmol/L 3 個劑量。但在誘導過程中發現 200 μmol/L 對 BV2 小膠質細胞損傷較大，未到 8 d 細胞即所剩無幾，因此未進行后續檢測。盡管 CCK8 實驗發現，H2O2-50 μmol/L 似乎不能明顯抑制 BV2 細胞增殖，但在其他檢測方法中，H2O2-50 μmol/L 誘導的 BV2 小膠質細胞中衰老標志物表達明顯上調，但上調程度不如 H2O2-100 μmol/L 明顯。綜合以上實驗結果，H2O2-100 μmol/L 誘導 BV2 細胞 8 d 可成功構建 BV2 小膠質細胞衰老模型。
有文獻建議，體外細胞衰老的鑒定至少需要驗證 3 個不同的特征[23]。在本實驗中，通過檢測 4 個不同衰老特征用于驗證細胞衰老模型是否構建成功，并探究 H2O2 誘導慢性氧化應激導致 BV2 小膠質細胞衰老的可能機制。早在 1995 年，SA-β-gal 染色就被發現在不同年齡的人類供體的皮膚樣本中，真皮成纖維細胞和表皮角質形成細胞中該標志物的年齡依賴性增加，證明 SA-β-gal 可能存在并隨著體內年齡的增長而積累[24]，因此 SA-β-gal 廣泛應用于細胞衰老的測定。在本實驗中，H2O2 的長期慢性誘導均可使細胞變藍、SA-β-gal 陽性細胞率增高，表明 H2O2 可誘導 BV2 小膠質細胞呈現衰老表型，其中 H2O2-100 μmol/L 的陽性細胞率更高，表明 100 μmol/L 可能為誘導衰老更有效的劑量。
CCK8 普遍用于檢測細胞增殖活性，以對照組為參照，H2O2 組細胞增殖越慢，計算所得的細胞存活率就越低。本實驗結果可見，H2O2-100 μmol/L 組細胞存活率明顯下調，即明顯抑制細胞增殖，表明 H2O2 可能通過顯著抑制 BV2 小膠質細胞增殖使其進入衰老狀態。p16INK4a 是一種周期蛋白激酶抑制劑，已被證明在老年嚙齒動物、靈長類動物和人類的組織中增加[25-26]，因此它被認為是代表衰老的生物標志物。細胞衰老有 2 種最主要的機制，p53-p21-pRb 通路和 p16-pRb 通路[27-28]。DNA 和其他類型的大分子損傷最終通過激活 p53/p21 和 p16/RB 腫瘤抑制通路導致增殖停止[29]，p21 和 p16 通過抑制周期蛋白依賴激酶 CDK4、CDK6、CDK2 而阻礙細胞周期進程[30]。本實驗表明，H2O2 構建的誘導性細胞衰老均可使 p16、p21、p53 mRNA 上調，其中 H2O2-100 μmol/L 組較 H2O2-50 μmol/L 組上調更明顯，表明 H2O2 可通過激活 p16、p21、p53 介導的損傷通路阻礙細胞周期，從而影響細胞正常復制。
SASP 是指衰老細胞表達和分泌各種細胞外調節劑（包括細胞因子、趨化因子、蛋白酶、生長因子和生物活性脂質）的能力[31]。在本實驗中，選取 IL-1β、TGF-β、MMP9 用于檢測 SASP。IL-1β是一種致炎細胞因子，可用于檢測細胞衰老與誘導細胞衰老[32-33]。TGF-β是一種關鍵的促纖維化因子，具有抑制增殖作用[34]，在衰老組織中與衰老細胞中表達上調[35]。MMP9 是一種基質金屬蛋白酶，是眼部衰老和視網膜病變的前瞻性生物標志物[36]，是一種衰老相關生物標志物。在測定 SASP 分子的表達水平實驗中，H2O2 長時間誘導均可使 BV2 小膠質細胞中 IL-1β、TGF-β、MMP9 表達上調，提示 H2O2 誘導的慢性氧化應激可能通過激活促炎通路、促進纖維化及降解基底膜，從而促進細胞衰老。其中 100 μmol/L H2O2 組上調更明顯，表明劑量較高可能誘導衰老越明顯。
目前針對于 BV2 小膠質細胞構建的衰老模型并無系統性研究，但小膠質細胞在機體衰老過程中發揮重要作用，可能與中樞神經系統長期處于促炎狀態有關[37]。本實驗通過 H2O2 誘導 BV2 小膠質細胞構建細胞衰老模型，可為衰老及衰老相關的神經退行性疾病的研究提供實驗模型，并為 H2O2 誘導慢性氧化應激導致 BV2 小膠質細胞衰老的機制提供了實驗依據。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
