引用本文： 王群, 葉梅毅, 孫楊, 陳濤, 王芳, 王方芳, 黃春華, 林蕾. 三種表型試驗篩選產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的臨床效能評價. 華西醫學, 2023, 38(8): 1148-1153. doi: 10.7507/1002-0179.202301113 復制
肺炎克雷伯菌作為臨床常見機會致病菌，可引起呼吸道、泌尿道和血流感染[1]。碳青霉烯類是目前治療肺炎克雷伯菌感染最常用的抗菌藥物[2]。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP）在世界范圍內的檢出率呈逐年上升趨勢，并且感染病原菌對碳青霉烯耐藥是院內患者死亡的獨立危險因素，美國疾病預防與控制中心將 CRKP 列為對人類健康的“緊急威脅”[3]。快速而準確地檢出 CRKP 對于感染防控具有關鍵作用，改良 Hodge 試驗（modified Hodge test, MHT）、改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method, mCIM）和 EDTA-碳青霉烯滅活試驗（EDTA-carbapenem inactivation method, eCIM）均為美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推薦的表型確證試驗，但 3 種試驗的檢測效能尚無系統性的報道。因此，本研究采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）擴增碳青霉烯耐藥基因作為金標準，探討 MHT、mCIM 和 eCIM 試驗三者對產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的臨床篩選能力，為感染防控和指導臨床合理用藥提供理論支持。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株來源
選擇成都地區 5 家三級綜合醫院，包括四川省中醫院、新都區人民醫院、天府新區人民醫院、彭州市人民醫院和大邑縣人民醫院，該 5 家醫院分別坐落于不同方向，覆蓋整個市區范圍。收集以上 5 家醫院 2019 年 1 月—2021 年 12 月臨床分離的 CRKP 菌株，隨機收集同時期分離的碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem sensitive Klebsiella pneumoniae, CSKP）作為對照組，排除來源于同一患者相同部位的重復菌株。本研究已通過大邑縣人民醫院醫學倫理委員會審批。
1.1.2 質量控制（質控）菌株
肺炎克雷伯菌 ATCC BAA1705（產 KPC-2 酶）、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA 1706（不產酶）、大腸埃希菌 ATCC25922。
1.1.3 主要試劑與儀器
恒溫培養箱（北京中興偉業儀器有限公司）、VITEK-2 細菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司）、PCR 擴增儀（西安天隆科技有限公司）、凝膠成像儀（北京君意東方電泳設備有限公司）、水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、PCR 反應液 、DNA Marker（上海生工生物工程有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 菌株鑒定及藥物敏感性試驗（藥敏）試驗
采用 Vitek 2-Compact 全自動細菌鑒定儀及配套藥敏卡 AST-GN13 對細菌進行鑒定和藥敏試驗，藥敏試驗結果判讀嚴格參照 2021 年 CLSI 的 M100-S31 文件推薦的標準[4]，儀器法檢出的碳青霉烯耐藥株均采用亞胺培南紙片擴散法復查加以驗證。
1.2.2 碳青霉烯酶表型檢測
① MHT 試驗。將待測和質控菌株接種于血平板，35℃培養 18～24 h，采用大腸埃希菌（ATCC 25922）制備 1.5×108 cfu/mL 菌懸液，再用無菌生理鹽水按 1∶10 稀釋。用棉簽將菌懸液均勻涂布于水解酪蛋白培養基（MH 培養基）上，后將美羅培南紙片貼于平板中央，挑取 3～5 個 CRKP 或質控菌株菌落，垂直于紙片從邊緣開始劃線，直至平板邊緣。孵育 16～20 h 后觀察大腸埃希菌生長情況。若大腸埃希菌出現向內的增強性生長，則 MHT 試驗陽性。
② mCIM 試驗。用 1 μL 接種環刮取待測和質控菌株于 2 mL 胰酪大豆胨液體培養基（trypticase soy broth, TSB）營養肉湯中，漩渦震蕩混勻 15 s 后。將一張美羅培南藥敏紙片浸沒于菌懸液中，（35±2）℃孵育（4±0.25）h。在孵育結束前 15～20 min 時，制備 1.5×108 cfu/mL 大腸埃希菌（ATCC 25922）菌懸液，并用無菌棉簽均勻涂布于 MH 培養基上。用 10 μL 接種環將美羅培南紙片取出，然后貼于 MH 培養基上，（35±2）℃培養 18～24 h 后量取抑菌圈直徑。結果判斷：若美羅培南抑菌圈直徑為 6～15 mm 或直徑為 16～18 mm，但抑菌圈內有散在菌落，則結果陽性；若美羅培南抑菌圈直徑≥19 mm，則結果陰性；若抑菌圈直徑 16～18 mm 而無散在菌落，則為中性。
③ eCIM 試驗。用 1 μL 接種環刮取滿環純菌落于第 2 支 2 mL TSB 肉湯中，加入 0.5 mol/L 的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）溶液 20 μL，其余步驟同 mCIM 試驗，mCIM 與 eCIM 試驗同時進行。mCIM 和 eCIM 肉湯管中的美羅培南紙片貼于同一 MH 培養基上，（35±2）℃培養 18～24 h 后量取抑菌圈直徑。與 mCIM 結果相比，抑菌圈直徑相差≥5 mm，則金屬酶陽性；抑菌圈直徑相差≤4 mm，則金屬酶陰性；當 mCIM 結果陰性時，不解釋 eCIM 結果。
1.2.3 碳青霉烯酶基因型檢測
參考已有文獻[5-6]，利用煮沸法制備細菌 DNA 模板，采用 PCR 擴增碳青霉烯耐藥基因，包括 A 類（blaKPC、blaGES）[5]、B 類（blaNDM、blaVIM、blaIMP）[6]和 D 類（blaOXA）[6]，碳青霉烯耐藥基因引物序列見表1。擴增陽性產物委托上海生工生物進行純化測序后將測序結果提交 Blast 數據庫進行比對分析。
表1
碳青霉烯耐藥基因引物序列及 PCR 產物長度
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析。靈敏度比較采用χ2 檢驗。以 PCR 檢測出耐藥基因作為金標準，計算 MHT 試驗、mCIM 試驗與 eCIM 試驗的一致率和 Kappa 值。Kappa 值<0.4，表明一致性程度差；Kappa 值在 0.41～0.74，表明一致性程度尚可；Kappa 值≥0.75，表明一致性程度較好[7]。單側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 菌株鑒定及藥敏結果
共分離 CRKP 160 株，CSKP 120 株。CRKP 與 CSKP 菌株標本來源分布見表2。兩者標本來源均以痰液居多，其次為血液和尿液。
表2
CRKP 與 CSKP 菌株標本來源分布
體外藥敏結果顯示，160 株 CRKP 對第二、三代頭孢菌素（頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢他啶和頭孢噻肟）和酶抑制劑類（氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦）耐藥率接近 100%，對環丙沙星和左氧氟沙星耐藥率分別為 95.63%（153/160）和 87.50%（140/160）。對氨基糖苷類耐藥率相對較低，但呈逐年上升趨勢；其中，阿米卡星 2019 年為 37.70%，2020 年為 49.25%，2021 年為 83.87%；慶大霉素 2019 年為 28.24%，2020 年為 42.35%，2021 年為 80.65%。妥布霉素 2019 年為 73.77%，2020 年為 79.41%，2021 年為 83.87%。120 株 CSKP 對所試驗的抗菌藥物耐藥率均明顯低于 CRKP，其中 CSKP 對三代頭孢菌素（頭孢曲松、頭孢他啶）耐藥率<50%，對酶抑制劑（氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦）、氨曲南和環丙沙星耐藥率<30%，對氨基糖苷類（慶大霉素、阿米卡星）耐藥率低于 20%。
2.2 碳青霉烯耐藥基因檢測結果
CRKP 菌株 PCR 擴增產物電泳結果見圖1。在 160 株 CRKP 中，有 156 株檢出碳青霉烯耐藥基因，其中絲氨酸酶 113 株，金屬酶 42 株，1 株同時攜帶絲氨酸和金屬酶，未檢出 D 類酶。經測序比對，其中 105 株（65.63%）攜帶 blaKPC-2，41 株（25.63%）攜帶 blaNDM-1，8 株（5.0%）攜帶 blaKPC-19，1 株（0.63%）攜帶 blaIMP-1，1 株（0.63%）同時攜帶 blaKPC-2 和 blaNDM-1。120 株 CSKP 均未檢出耐藥基因。
圖1
CRKP 菌株碳青霉烯耐藥基因 PCR 電泳圖
a. 46～60 號菌株
2.3 碳青霉烯酶表型篩選試驗結果
在 156 株攜帶碳青霉烯耐藥基因的 CRKP 中，MHT 陽性 114 株，靈敏度為 73.08%（114/156）；陰性 42 株，均為攜帶 blaNDM 或 blaIMP 基因菌株；mCIM 陽性 152 株，靈敏度為 97.44%（152/156），明顯高于 MHT（χ2=34.907，P<0.001）。41 株攜帶 blaNDM-1 的菌株 eCIM 均顯示為陽性；1 株攜帶 blaIMP 基因的菌株，eCIM 顯示為陰性，1 株同時攜帶 blaKPC-1 和 blaNDM-1 基因的菌株，eCIM 為陰性。eCIM 靈敏度為 95.35%（41/43）。
在 120 株 CSKP 中，MHT 陽性 4 株，mCIM 陽性 2 株，eCIM 均陰性。以 PCR 結果為金標準，MHT 和 mCIM 試驗特異度分別為 96.67%（116/120）和 98.33%（118/120）。eCIM 試驗用于檢測金屬酶的特異度為 100%（120/120）。部分菌株 MHT、mCIM 和 eCIM 試驗結果見圖2、3 和表3。
圖2
部分菌株 MHT 試驗結果
3、4、5、6、99、100 為菌株編號；1705 為產 KPC-2 酶的陽性質控菌株；1706 為不產酶的陰性質控菌株；MHT：改良 Hodge 試驗
圖3
部分菌株 mCIM 和 eCIM 試驗結果
a. mCIM；b. eCIM。54、103、104、105 為菌株編號；θ表示陰性質控菌株 mCIM 試驗；θe 表示陰性質控菌株 eCIM 試驗；+表示陽性質控菌株 mCIM 試驗；+e 表示陽性質控菌株 eCIM 試驗；54 表示 54 號菌株 mCIM 試驗，54e 表示 54 號菌株 eCIM 試驗，103、103e、104、104e 以此類推；mCIM：改良碳青霉烯滅活試驗；eCIM：EDTA-碳青霉烯滅活試驗
表3
碳青霉烯酶表型試驗結果（株）
2.4 表型篩選試驗與 PCR 檢測結果一致性比較
與 PCR 檢測結果相比，MHT 試驗的 Kappa 值為 0.673，mCIM 試驗的 Kappa 值為 0.956，eCIM 試驗檢測金屬酶的 Kappa 值為 0.968。見表4。
表4
表型篩選試驗結果與 PCR 結果對比分析
3 討論
肺炎克雷伯菌作為院內感染和社區獲得性感染的重要機會致病菌，普遍存在于自然界中，可引起多種感染，包括血流感染、尿路感染、手術部位感染和肺炎等[8]。碳青霉烯類抗菌藥物是治療產超廣譜 β 內酰胺酶肺炎克雷伯菌嚴重感染的一線藥物，然而自 1996 年第 1 株產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌分離以來，碳青霉烯耐藥株迅速增加，CHINET 數據顯示，肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從 2005 年 3.0%和 2.9%分別上升至 2022 年 24.4%和 23.1%，上升幅度高達 8 倍[9]。全國耐藥監測網（CARSS）數據顯示，四川省分離的肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從 2014 年的 1.7%和 2.5%增長為 2017 年的 4.5%和 5.7%[10-11]。雖然四川省 CRKP 分離率在全國較低，但有明顯上升趨勢。2018 年全國細菌耐藥監測網（CARSS）數據顯示，全國 1429 家醫院分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的平均耐藥率為 10.1%，部分地區甚至超過 20%[12]。因此，探究如何快速而準確地檢出 CRKP，在指導臨床醫生合理用藥和感染的防控具有重要意義。
2009 年，CLSI 推薦使用 MHT 試驗對產碳青霉烯酶腸桿菌目細菌進行表型初篩。MHT 試驗操作簡單、耗時短，對產 A 類和 D 類酶 CRKP 的檢出具有較高的靈敏度和特異度[13]。本研究結果顯示，MHT 試驗靈敏度和特異度分別為 73.08%（114/156）和 96.67%（116/120），MHT 試驗結果與 PCR 檢測結果一致性低，Kappa 值為 0.673。有研究顯示 MHT 試驗對檢測亞胺培南水解β-內酰胺酶（imipenem hydrolyzes β lactaminases, IMP） 具有較高的靈敏度和特異性，但對新德里金屬 ?-內酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase, NDM）靈敏度僅為 50%[14]，本研究中產 NDM 酶的 41 株 CRKP，MHT 均為陰性，表明 MHT 試驗檢測金屬酶的靈敏度低，易產生假陰性，僅推薦用于流行病學篩查, 不作為臨床常規篩查方法。
2017 年 CLSI 推薦 mCIM 作為檢測碳青霉烯酶新方法，利用細菌產生的碳青霉烯酶對抗菌藥物的水解作用原理。相關報道顯示，mCIM 檢測 A 類、B 類和 D 類碳青霉烯酶的靈敏度和特異度均＞99%，與 PCR 檢測結果一致性高，Kappa>0.95[15]。本研究結果顯示，mCIM 試驗篩查碳青霉烯酶的靈敏度和特異度分別為 97.44%（152/156）和 98.33%（118/120），與 PCR 檢測結果一致性高，Kappa 值為 0.956，表明 mCIM 是一種可靠的碳青霉烯表型初篩方法。
由于 MHT 試驗檢測局限性，2018 年 CLSI 將 eCIM 納入藥敏試驗標準，其原理是基于金屬酶發揮催化活性必須依賴鋅離子存在，而 EDTA 可絡合鋅離子，達到抑制金屬酶的作用[16]。eCIM 與 mCIM 聯合檢測可有效區分產絲氨酸酶和金屬酶的碳青霉烯耐藥的腸桿菌菌株。有研究發現 eCIM 試驗檢測金屬酶的靈敏度和特異度為 93.5%和 94.6%，檢測絲氨酸酶的靈敏度和特異度為 92.6%和 95.8%[17]。本研究結果顯示，eCIM 試驗從 CRKP 中篩選絲氨酸酶和金屬酶的靈敏度為 95.35%，特異度為 100%，Kappa 值為 0.968，與 PCR 檢測結果一致性高。但本研究中有 1 株產 IMP 酶菌株，eCIM 出現假陰性。據報道，在 EDTA 濃度為 0.1 mmol/L 時，eCIM 篩查 IMP 酶結果為陰性，而將 EDTA 濃度增高至 5 mmol/L 時，eCIM 為陽性[18]，本研究中 eCIM 檢測 IMP 酶時產生假陰性的原因有待進一步探討。此外，本研究中有 1 株同時產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶和 NDM 酶的 CRKP，mCIM 陽性，但 eCIM 結果顯示為陰性，表明 eCIM 不能區分同時產絲氨酸酶和金屬酶的菌株。
綜上所述，MHT、mCIM 和 eCIM 試驗在篩查產碳青霉烯酶菌株方面各有利弊。MHT 操作簡單，但結果判斷易受主觀因素影響，檢測金屬酶易產生假陰性。mCIM 和 eCIM 試驗敏感性和特異性較高，二者聯合可篩選碳青霉烯耐藥株，區分產金屬酶或絲氨酸酶 CRKP 菌株，但當菌株同時產絲氨酸酶和金屬酶時，則不能進行區分，此時需增加絲氨酸酶抑制劑，來提高檢測性能。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
肺炎克雷伯菌作為臨床常見機會致病菌，可引起呼吸道、泌尿道和血流感染[1]。碳青霉烯類是目前治療肺炎克雷伯菌感染最常用的抗菌藥物[2]。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP）在世界范圍內的檢出率呈逐年上升趨勢，并且感染病原菌對碳青霉烯耐藥是院內患者死亡的獨立危險因素，美國疾病預防與控制中心將 CRKP 列為對人類健康的“緊急威脅”[3]。快速而準確地檢出 CRKP 對于感染防控具有關鍵作用，改良 Hodge 試驗（modified Hodge test, MHT）、改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method, mCIM）和 EDTA-碳青霉烯滅活試驗（EDTA-carbapenem inactivation method, eCIM）均為美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推薦的表型確證試驗，但 3 種試驗的檢測效能尚無系統性的報道。因此，本研究采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）擴增碳青霉烯耐藥基因作為金標準，探討 MHT、mCIM 和 eCIM 試驗三者對產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的臨床篩選能力，為感染防控和指導臨床合理用藥提供理論支持。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株來源
選擇成都地區 5 家三級綜合醫院，包括四川省中醫院、新都區人民醫院、天府新區人民醫院、彭州市人民醫院和大邑縣人民醫院，該 5 家醫院分別坐落于不同方向，覆蓋整個市區范圍。收集以上 5 家醫院 2019 年 1 月—2021 年 12 月臨床分離的 CRKP 菌株，隨機收集同時期分離的碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem sensitive Klebsiella pneumoniae, CSKP）作為對照組，排除來源于同一患者相同部位的重復菌株。本研究已通過大邑縣人民醫院醫學倫理委員會審批。
1.1.2 質量控制（質控）菌株
肺炎克雷伯菌 ATCC BAA1705（產 KPC-2 酶）、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA 1706（不產酶）、大腸埃希菌 ATCC25922。
1.1.3 主要試劑與儀器
恒溫培養箱（北京中興偉業儀器有限公司）、VITEK-2 細菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司）、PCR 擴增儀（西安天隆科技有限公司）、凝膠成像儀（北京君意東方電泳設備有限公司）、水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、PCR 反應液 、DNA Marker（上海生工生物工程有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 菌株鑒定及藥物敏感性試驗（藥敏）試驗
采用 Vitek 2-Compact 全自動細菌鑒定儀及配套藥敏卡 AST-GN13 對細菌進行鑒定和藥敏試驗，藥敏試驗結果判讀嚴格參照 2021 年 CLSI 的 M100-S31 文件推薦的標準[4]，儀器法檢出的碳青霉烯耐藥株均采用亞胺培南紙片擴散法復查加以驗證。
1.2.2 碳青霉烯酶表型檢測
① MHT 試驗。將待測和質控菌株接種于血平板，35℃培養 18～24 h，采用大腸埃希菌（ATCC 25922）制備 1.5×108 cfu/mL 菌懸液，再用無菌生理鹽水按 1∶10 稀釋。用棉簽將菌懸液均勻涂布于水解酪蛋白培養基（MH 培養基）上，后將美羅培南紙片貼于平板中央，挑取 3～5 個 CRKP 或質控菌株菌落，垂直于紙片從邊緣開始劃線，直至平板邊緣。孵育 16～20 h 后觀察大腸埃希菌生長情況。若大腸埃希菌出現向內的增強性生長，則 MHT 試驗陽性。
② mCIM 試驗。用 1 μL 接種環刮取待測和質控菌株于 2 mL 胰酪大豆胨液體培養基（trypticase soy broth, TSB）營養肉湯中，漩渦震蕩混勻 15 s 后。將一張美羅培南藥敏紙片浸沒于菌懸液中，（35±2）℃孵育（4±0.25）h。在孵育結束前 15～20 min 時，制備 1.5×108 cfu/mL 大腸埃希菌（ATCC 25922）菌懸液，并用無菌棉簽均勻涂布于 MH 培養基上。用 10 μL 接種環將美羅培南紙片取出，然后貼于 MH 培養基上，（35±2）℃培養 18～24 h 后量取抑菌圈直徑。結果判斷：若美羅培南抑菌圈直徑為 6～15 mm 或直徑為 16～18 mm，但抑菌圈內有散在菌落，則結果陽性；若美羅培南抑菌圈直徑≥19 mm，則結果陰性；若抑菌圈直徑 16～18 mm 而無散在菌落，則為中性。
③ eCIM 試驗。用 1 μL 接種環刮取滿環純菌落于第 2 支 2 mL TSB 肉湯中，加入 0.5 mol/L 的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）溶液 20 μL，其余步驟同 mCIM 試驗，mCIM 與 eCIM 試驗同時進行。mCIM 和 eCIM 肉湯管中的美羅培南紙片貼于同一 MH 培養基上，（35±2）℃培養 18～24 h 后量取抑菌圈直徑。與 mCIM 結果相比，抑菌圈直徑相差≥5 mm，則金屬酶陽性；抑菌圈直徑相差≤4 mm，則金屬酶陰性；當 mCIM 結果陰性時，不解釋 eCIM 結果。
1.2.3 碳青霉烯酶基因型檢測
參考已有文獻[5-6]，利用煮沸法制備細菌 DNA 模板，采用 PCR 擴增碳青霉烯耐藥基因，包括 A 類（blaKPC、blaGES）[5]、B 類（blaNDM、blaVIM、blaIMP）[6]和 D 類（blaOXA）[6]，碳青霉烯耐藥基因引物序列見表1。擴增陽性產物委托上海生工生物進行純化測序后將測序結果提交 Blast 數據庫進行比對分析。
表1
碳青霉烯耐藥基因引物序列及 PCR 產物長度
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析。靈敏度比較采用χ2 檢驗。以 PCR 檢測出耐藥基因作為金標準，計算 MHT 試驗、mCIM 試驗與 eCIM 試驗的一致率和 Kappa 值。Kappa 值<0.4，表明一致性程度差；Kappa 值在 0.41～0.74，表明一致性程度尚可；Kappa 值≥0.75，表明一致性程度較好[7]。單側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 菌株鑒定及藥敏結果
共分離 CRKP 160 株，CSKP 120 株。CRKP 與 CSKP 菌株標本來源分布見表2。兩者標本來源均以痰液居多，其次為血液和尿液。
表2
CRKP 與 CSKP 菌株標本來源分布
體外藥敏結果顯示，160 株 CRKP 對第二、三代頭孢菌素（頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢他啶和頭孢噻肟）和酶抑制劑類（氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦）耐藥率接近 100%，對環丙沙星和左氧氟沙星耐藥率分別為 95.63%（153/160）和 87.50%（140/160）。對氨基糖苷類耐藥率相對較低，但呈逐年上升趨勢；其中，阿米卡星 2019 年為 37.70%，2020 年為 49.25%，2021 年為 83.87%；慶大霉素 2019 年為 28.24%，2020 年為 42.35%，2021 年為 80.65%。妥布霉素 2019 年為 73.77%，2020 年為 79.41%，2021 年為 83.87%。120 株 CSKP 對所試驗的抗菌藥物耐藥率均明顯低于 CRKP，其中 CSKP 對三代頭孢菌素（頭孢曲松、頭孢他啶）耐藥率<50%，對酶抑制劑（氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦）、氨曲南和環丙沙星耐藥率<30%，對氨基糖苷類（慶大霉素、阿米卡星）耐藥率低于 20%。
2.2 碳青霉烯耐藥基因檢測結果
CRKP 菌株 PCR 擴增產物電泳結果見圖1。在 160 株 CRKP 中，有 156 株檢出碳青霉烯耐藥基因，其中絲氨酸酶 113 株，金屬酶 42 株，1 株同時攜帶絲氨酸和金屬酶，未檢出 D 類酶。經測序比對，其中 105 株（65.63%）攜帶 blaKPC-2，41 株（25.63%）攜帶 blaNDM-1，8 株（5.0%）攜帶 blaKPC-19，1 株（0.63%）攜帶 blaIMP-1，1 株（0.63%）同時攜帶 blaKPC-2 和 blaNDM-1。120 株 CSKP 均未檢出耐藥基因。
圖1
CRKP 菌株碳青霉烯耐藥基因 PCR 電泳圖
a. 46～60 號菌株
2.3 碳青霉烯酶表型篩選試驗結果
在 156 株攜帶碳青霉烯耐藥基因的 CRKP 中，MHT 陽性 114 株，靈敏度為 73.08%（114/156）；陰性 42 株，均為攜帶 blaNDM 或 blaIMP 基因菌株；mCIM 陽性 152 株，靈敏度為 97.44%（152/156），明顯高于 MHT（χ2=34.907，P<0.001）。41 株攜帶 blaNDM-1 的菌株 eCIM 均顯示為陽性；1 株攜帶 blaIMP 基因的菌株，eCIM 顯示為陰性，1 株同時攜帶 blaKPC-1 和 blaNDM-1 基因的菌株，eCIM 為陰性。eCIM 靈敏度為 95.35%（41/43）。
在 120 株 CSKP 中，MHT 陽性 4 株，mCIM 陽性 2 株，eCIM 均陰性。以 PCR 結果為金標準，MHT 和 mCIM 試驗特異度分別為 96.67%（116/120）和 98.33%（118/120）。eCIM 試驗用于檢測金屬酶的特異度為 100%（120/120）。部分菌株 MHT、mCIM 和 eCIM 試驗結果見圖2、3 和表3。
圖2
部分菌株 MHT 試驗結果
3、4、5、6、99、100 為菌株編號；1705 為產 KPC-2 酶的陽性質控菌株；1706 為不產酶的陰性質控菌株；MHT：改良 Hodge 試驗
圖3
部分菌株 mCIM 和 eCIM 試驗結果
a. mCIM；b. eCIM。54、103、104、105 為菌株編號；θ表示陰性質控菌株 mCIM 試驗；θe 表示陰性質控菌株 eCIM 試驗；+表示陽性質控菌株 mCIM 試驗；+e 表示陽性質控菌株 eCIM 試驗；54 表示 54 號菌株 mCIM 試驗，54e 表示 54 號菌株 eCIM 試驗，103、103e、104、104e 以此類推；mCIM：改良碳青霉烯滅活試驗；eCIM：EDTA-碳青霉烯滅活試驗
表3
碳青霉烯酶表型試驗結果（株）
2.4 表型篩選試驗與 PCR 檢測結果一致性比較
與 PCR 檢測結果相比，MHT 試驗的 Kappa 值為 0.673，mCIM 試驗的 Kappa 值為 0.956，eCIM 試驗檢測金屬酶的 Kappa 值為 0.968。見表4。
表4
表型篩選試驗結果與 PCR 結果對比分析
3 討論
肺炎克雷伯菌作為院內感染和社區獲得性感染的重要機會致病菌，普遍存在于自然界中，可引起多種感染，包括血流感染、尿路感染、手術部位感染和肺炎等[8]。碳青霉烯類抗菌藥物是治療產超廣譜 β 內酰胺酶肺炎克雷伯菌嚴重感染的一線藥物，然而自 1996 年第 1 株產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌分離以來，碳青霉烯耐藥株迅速增加，CHINET 數據顯示，肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從 2005 年 3.0%和 2.9%分別上升至 2022 年 24.4%和 23.1%，上升幅度高達 8 倍[9]。全國耐藥監測網（CARSS）數據顯示，四川省分離的肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從 2014 年的 1.7%和 2.5%增長為 2017 年的 4.5%和 5.7%[10-11]。雖然四川省 CRKP 分離率在全國較低，但有明顯上升趨勢。2018 年全國細菌耐藥監測網（CARSS）數據顯示，全國 1429 家醫院分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的平均耐藥率為 10.1%，部分地區甚至超過 20%[12]。因此，探究如何快速而準確地檢出 CRKP，在指導臨床醫生合理用藥和感染的防控具有重要意義。
2009 年，CLSI 推薦使用 MHT 試驗對產碳青霉烯酶腸桿菌目細菌進行表型初篩。MHT 試驗操作簡單、耗時短，對產 A 類和 D 類酶 CRKP 的檢出具有較高的靈敏度和特異度[13]。本研究結果顯示，MHT 試驗靈敏度和特異度分別為 73.08%（114/156）和 96.67%（116/120），MHT 試驗結果與 PCR 檢測結果一致性低，Kappa 值為 0.673。有研究顯示 MHT 試驗對檢測亞胺培南水解β-內酰胺酶（imipenem hydrolyzes β lactaminases, IMP） 具有較高的靈敏度和特異性，但對新德里金屬 ?-內酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase, NDM）靈敏度僅為 50%[14]，本研究中產 NDM 酶的 41 株 CRKP，MHT 均為陰性，表明 MHT 試驗檢測金屬酶的靈敏度低，易產生假陰性，僅推薦用于流行病學篩查, 不作為臨床常規篩查方法。
2017 年 CLSI 推薦 mCIM 作為檢測碳青霉烯酶新方法，利用細菌產生的碳青霉烯酶對抗菌藥物的水解作用原理。相關報道顯示，mCIM 檢測 A 類、B 類和 D 類碳青霉烯酶的靈敏度和特異度均＞99%，與 PCR 檢測結果一致性高，Kappa>0.95[15]。本研究結果顯示，mCIM 試驗篩查碳青霉烯酶的靈敏度和特異度分別為 97.44%（152/156）和 98.33%（118/120），與 PCR 檢測結果一致性高，Kappa 值為 0.956，表明 mCIM 是一種可靠的碳青霉烯表型初篩方法。
由于 MHT 試驗檢測局限性，2018 年 CLSI 將 eCIM 納入藥敏試驗標準，其原理是基于金屬酶發揮催化活性必須依賴鋅離子存在，而 EDTA 可絡合鋅離子，達到抑制金屬酶的作用[16]。eCIM 與 mCIM 聯合檢測可有效區分產絲氨酸酶和金屬酶的碳青霉烯耐藥的腸桿菌菌株。有研究發現 eCIM 試驗檢測金屬酶的靈敏度和特異度為 93.5%和 94.6%，檢測絲氨酸酶的靈敏度和特異度為 92.6%和 95.8%[17]。本研究結果顯示，eCIM 試驗從 CRKP 中篩選絲氨酸酶和金屬酶的靈敏度為 95.35%，特異度為 100%，Kappa 值為 0.968，與 PCR 檢測結果一致性高。但本研究中有 1 株產 IMP 酶菌株，eCIM 出現假陰性。據報道，在 EDTA 濃度為 0.1 mmol/L 時，eCIM 篩查 IMP 酶結果為陰性，而將 EDTA 濃度增高至 5 mmol/L 時，eCIM 為陽性[18]，本研究中 eCIM 檢測 IMP 酶時產生假陰性的原因有待進一步探討。此外，本研究中有 1 株同時產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶和 NDM 酶的 CRKP，mCIM 陽性，但 eCIM 結果顯示為陰性，表明 eCIM 不能區分同時產絲氨酸酶和金屬酶的菌株。
綜上所述，MHT、mCIM 和 eCIM 試驗在篩查產碳青霉烯酶菌株方面各有利弊。MHT 操作簡單，但結果判斷易受主觀因素影響，檢測金屬酶易產生假陰性。mCIM 和 eCIM 試驗敏感性和特異性較高，二者聯合可篩選碳青霉烯耐藥株，區分產金屬酶或絲氨酸酶 CRKP 菌株，但當菌株同時產絲氨酸酶和金屬酶時，則不能進行區分，此時需增加絲氨酸酶抑制劑，來提高檢測性能。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
