近年來，病原宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術在臨床感染領域的應用越來越廣泛。在臨床需求的推動下，mNGS 技術也在不斷地優化和發展。從手工操作到自動化流程，從單純定性檢測到定量監控，從感染鑒別到“感染+腫瘤”多維診斷都取得了一定的研究成果。當然，該技術在臨床應用中還存在一定的局限性，如目前國內 mNGS 檢測相關試劑眾多，但尚未建立系統完整的質量管理控制和評價體系，尚需進一步研究。該文就近年來病原宏基因組測序技術的發展、應用以及 mNGS 檢測的標準化和規范化流程進行了總結，以期為病原 mNGS 測序更好地輔助臨床感染診斷提供參考。
引用本文： 張江峰, 馬冰, 楚亞菲, 許俊紅, 徐文博, 王山梅, 曹雪芳, 陳曉曦, 李軼. 病原宏基因組測序技術及其在臨床感染輔助診斷中的應用研究. 華西醫學, 2022, 37(8): 1134-1139. doi: 10.7507/1002-0179.202206107 復制
宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術無需培養和預先假設，可直接對臨床樣本中的核酸物質進行高通量測序以獲得海量序列數據，通過與微生物序列數據庫進行比對分析，獲得標本中微生物的物種和豐度信息[1-2]。與傳統臨床微生物實驗室病原學檢測方法相比，mNGS 可全面覆蓋上萬種病原體，無偏向性快速鑒定細菌、真菌、病毒和寄生蟲等各類病原微生物，包括難以檢測的病原體和新發病原體，尤其對于厭氧菌和苛養菌的鑒定具有優勢[3]。國內外研究證據顯示，病原 mNGS 檢測在中樞神經系統感染、呼吸道感染、血流感染以及局灶感染等領域的臨床研究展現出良好的應用前景，已成為臨床微生物檢測的重要技術補充[1-3]。本文對近年來病原宏基因組測序技術的發展、應用及 mNGS 檢測的標準化和規范化流程進行了總結，以期為病原 mNGS 測序技術更好地為臨床感染輔助診斷提供參考。
1 mNGS 新技術的發展
近年來，mNGS 在關鍵技術層面不斷發展和突破，實現了從傳統的手工操作到自動化流程，從定性結果到定量分析，從快速到極速，從感染到感染與腫瘤雙重分析，從血漿游離 DNA 測序到血流感染相關高敏 mNGS 測序。
1.1 從手工操作到自動化流程
mNGS 作為一種無需培養和預設的病原學檢測技術，已有證據表明其可提高臨床感染性疾病病原學的診斷率[2]。但繁瑣的濕實驗流程導致 mNGS 檢測周期較長，且對實驗室空間、設備及操作人員需求較大，因而限制了 mNGS 在醫療機構的本地化開展。源于“一網打盡”的特性，mNGS 不僅會檢測到樣品中的微生物核酸，還會檢測到容器、環境和試劑中的微生物核酸，增加結果判讀的難度。此外，大多數手工操作的測序平臺需要在 18～72 h 內才能完成從樣本接收到出具 mNGS 報告的流程[2]。因此，提高檢測時效性同時降低背景微生物干擾，對于 mNGS 在臨床上的應用以及醫療機構的本地化開展至關重要。相比手工操作，自動化流程對于提升 mNGS 檢測時效性、控制外源微生物污染、降低背景微生物干擾等具有巨大優勢，因而更有助于 mNGS 在臨床上的應用推廣。
mNGS 檢測流程有多種，其中基于 NGSmaster 和 PCR（polymerase chain reaction）-free 的檢測流程可以自動化完成核酸提取、文庫制備和純化的全流程，并可將 DNA 測序和 RNA 測序的報告時間分別縮短至 16 h 和 18.5 h[4]。一項針對該流程的檢測性能驗證研究表明，自動化流程相比手工操作能大幅降低外源微生物污染可能性，同時 PCR-free 不僅不影響 mNGS 的檢測性能，而且能縮短檢測周期，規避氣溶膠污染風險[4]。
1.2 從單純定性檢測到定量監控
mNGS 技術本身的局限之一是高背景標本導致檢測靈敏度降低[5]。高背景主要源于人類宿主或微生物菌群，在測序數據量等量的情況下，標本中人源核酸含量越高，mNGS 檢測到的人基因組序列數就越多，即檢測到的病原體序列數就越低，對于病原體的檢測靈敏度就越差，甚至導致致病病原體的漏檢或假陰性結果的發生[6]。mNGS 檢測到的微生物序列數受標本中微生物和人源細胞含量雙重影響，盡管去人源技術可在一定程度上提高 mNGS 的靈敏度，但同樣存在非特異性損失病原體的風險。為解決這一問題，一種新型測序技術—定量 mNGS（quality/quantity mNGS，Q-mNGS）應運而生，該技術通過在樣本中加入特異性分子內標（spike），對病原體含量和人源宿主含量進行相對定量，結合人源指數（Host index）和病原指數（Q index）判斷標本中人源含量高低以及溯源標本中的真實病原載量，協助臨床判斷個體感染差異，并評估患者抗感染療效[6]。
將基于分子內標的 mNGS 測序應用于臨床疑似肺炎患者的診斷，可以實現對標本中人源和病原含量進行定量檢測，結合選擇性去人源，對支氣管肺泡灌洗液樣本的診斷陽性率可達 93.04%，特異度達 93.33%，表明該方法可以有效提升疑似肺炎感染患者的診斷率[6]。此外，一項針對感染新生兒的臨床研究顯示，基于內標定量的 mNGS 可對傳統病原學陰性的感染新生兒進行病原體鑒定并指導抗生素治療，通過定量分析還可以輔助臨床進行療效監控[7]。
1.3 從快速 mNGS 到極速精準 mNGS
盡管牛津納米孔測序平臺最快可在 6 h 內完成測序和實時檢測分析，但相較于 Illumina 二代測序方法，依然存在測序深度較低、數據產出較低和測序錯誤率較高等不足[8]。因此，在保證測序結果準確的同時，如何進一步提升 mNGS 的檢測時效性，成為了病原 mNGS 測序行業的探索重點。國內有研究團隊通過創新性地對測序接頭進行改進，通過結合自動化建庫設備和生物信息實時分析流程，開發了一套快速 mNGS 檢測方案，基于 NextSeq 測序平臺，該流程將收樣到完成分析的周轉時間降低到 9.1～10.1 h，可在不影響測序質量的前提下對樣本進行快速、實時分析[9]。
針對 153 個下呼吸道標本的性能驗證試驗顯示，基于復合參考標準，36 bp（base pair）快速 mNGS 的病原體檢測能力達到了陽性符合率為 80.3%～96.8%，陰性符合率為 97.4%～100%[9]。基于改良的測序接頭和生物信息實時快速分析系統，極速 mNGS 檢測有望為疑難、危重、特殊感染患者的救治提供更及時、更精準、更全面的診療指導。
1.4 從感染鑒別到“感染+腫瘤”多維診斷
對疑似感染患者進行 mNGS 測序能夠幫助識別病原體，但惡性腫瘤患者與感染患者的部分臨床癥狀相似，通常難以鑒別，對此類患者進行常規 mNGS 檢測時，結果可能為陰性，無法及時獲取準確的診斷信息將導致不必要的抗生素治療、高昂的醫療費用以及不良的預后。腫瘤診斷的金標準通常是具有侵入性的活檢和病理染色，一般需要 3～7 d，在不考慮腫瘤時，可能并不選擇進行活檢[10]。染色體核型分析是染色體畸變的金標準，但該方法僅適用于外周血和骨髓，檢測周期長（4～7 d），分辨率低，且無法檢出 5 Mb 以下的染色體拷貝數變異（copy number variation，CNV）[10]。目前學界廣泛認為，染色體不穩定性是一種重要的腫瘤標志物[10-11]。一項前瞻性隊列研究表明，前列腺癌患者的尿液標本中存在大量 CNV 特征的脫落細胞[12]。還有研究顯示，mNGS 測序分析過程中獲得的大量人源基因組序列可用于檢測染色體 CNV，有助于診斷隱源性腫瘤[13]。
基于上述原理，國內有研究團隊利用該技術同時檢測肺活檢組織中的病原體和染色體不穩定性。結果表明，基于 Illumina 平臺的 mNGS 同時檢測到 38 例感染患者和 36 例癌癥患者，與病理檢查結果比較，mNGS 對于腫瘤診斷的臨床靈敏度為 83.7%，特異度為 97.6%[11]。有研究將 mNGS 應用于中樞神經系統惡性腫瘤患者的鑒別診斷，結果表明腦脊液 mNGS 檢測的靈敏度為 75%，特異度為 100%[14]。還有文獻報道了在抗感染治療仍無好轉的情況下，通過對人源核酸序列進行分析成功診斷 1 例下頜骨彌漫性大 B 細胞淋巴瘤病例，這表明 mNGS 不僅有助于快速進行病原學診斷，還有助于排除感染和診斷惡性腫瘤，對于疑似感染的患者鑒別診斷具有重要意義[15]。尤其是當常規方法和 mNGS 的病原學結果均為陰性時，CNV 分析提示的腫瘤信號能夠指導臨床進行病因學的鑒別診斷，以便及早啟動針對性治療，更好地改善患者預后[16]。任海濤等[17]的研究中，患者腦脊液 mNGS 未檢出可疑陽性微生物，但人源序列進行染色體拷貝數分析提示異常，該結果為排除感染性腦膜炎提供了證據，結合臨床表現和腦脊液細胞學最終確診肺癌腦轉移，靶向抗腫瘤治療后，患者癥狀明顯好轉。還有前瞻性多中心臨床研究顯示，Onco-mNGS 分析對腫瘤分期檢測的陽性百分比一致性和陰性百分比一致性分別為 66.7%和 98.3%[18]，初步證實了基于 mNGS 測序和 CNV 分析的 Onco-mNGS 同時檢測患者標本中病原體和腫瘤信號的可行性和臨床價值。
1.5 血流感染相關高敏 mNGS 測序
作為血流感染診斷的金標準，血培養的陽性率低，檢測病原范圍有限，且結果報告周期長，血液標本是病原 mNGS 測序最為廣泛的樣本類型之一，但在實際臨床應用中卻面臨著靈敏度受限的問題。全血中的病原體核酸通常以游離核酸（cell free DNA，cf-DNA）存在于血漿中或者以完整基因組存在于病原顆粒中，但由于傳統 mNGS 僅檢測血漿微生物游離核酸（microbial cf-DNA，mcf-DNA），因此存在較高的漏檢和假陰性的風險。為了評估肺泡包蟲病患者的治療效果，有研究開發了血漿蟲源性游離核酸（Em-cfDNA）的 mNGS 檢測，結果表明，Em-cfDNA 對肺泡包蟲病的診斷靈敏度和特異度分別為 100%和 90.9%，陽性預測值和陰性預測值均為 100%，并且該方法具有良好的術后效果監測價值[19]。也有測序公司創新性地將超多重引物靶向擴增技術或探針捕獲技術與 NGS 技術結合，改善了病原 mNGS 檢測的特異度與廣譜性，該技術協助醫生臨床快速診斷了 1 例血液透析患者中出現的黃曲霉所致感染性心內膜炎[20]。
2 mNGS 的標準化及規范化
2014 年，Wilson 等[21]首次利用 mNGS 測序技術成功診斷并治愈了 1 例聯合免疫缺陷病患者的鉤端螺旋體病，開啟了 mNGS 的臨床應用時代。近年來，基于高通量測序平臺的病原 mNGS 技術在各類感染性疾病領域的應用越來越廣泛。為了規范 mNGS 技術在臨床的應用，國內外專家陸續編寫發表了多篇 mNGS 檢測應用于感染疾病診斷的專家共識[22-38]。由于 mNGS 操作流程復雜，且其檢測性能受到包括微生物種類、人源宿主核酸含量、測序數據量等各種因素的顯著影響，因此在開展實驗室檢測和臨床應用前需要對其性能指標進行充分的驗證。目前，一些實驗室已經較為系統地完成了自建 mNGS 平臺的性能確認工作，有多篇研究論文公布了關于腦脊液、血漿、呼吸道標本 mNGS 測序相關的性能驗證數據[39-43]。
2.1 mNGS 臨床應用專家共識
2016 年，美國食品藥品監督管理局發布了 NGS 感染性疾病診斷設備草案，為基于高通量測序技術進行病原體、耐藥和毒力因子檢測的相關技術提供了科學指南[2]。此后，mNGS 被寫入了不同感染領域相關診斷和治療的指南共識，包括不同類型病原體的感染（利什曼原蟲感染[22]、念珠菌病[23]、中樞神經系統結核病[24]）、不同患者的感染（成人肺炎[25]、兒童呼吸道感染[26]）、不同臨床科室/領域的感染（急診[27]、重癥[28]）以及不同器官/系統的感染（移植術后感染[29]、危重患者血流感染[30]、神經外科中樞神經系統感染[31]、人工關節感染[32]）。
2020 年 11 月，針對所有感染性疾病的宏基因組學臨床應用專家共識正式發布，該共識首次針對不同感染癥候群，包括中樞神經系統感染、血流感染、局灶性感染、呼吸道感染的適用范圍給出了相應的推薦意見，為國內感染病原體宏基因組學檢測建立了標準規范[33]。隨后，檢驗領域陸續發布了涉及 mNGS 測序的臨床應用、技術流程、實驗室規范（質量管理、性能驗證）以及生物信息分析和結果解讀等方面的專家共識，為進一步推動該技術在感染病原體檢測領域的科學嚴謹、合規應用提供了強有力的指導意見[34-36]。經過不斷的技術優化、臨床應用研究與經驗積累，在臨床感染細分領域如中樞神經系統感染、新生兒感染也先后發布了促進病原 mNGS 規范化應用的共識文件[37-38]。
2.2 mNGS 流程的性能驗證
在中樞神經系統感染領域，國外 Miller 等[39]建立并驗證了一個用于綜合診斷腦膜炎和腦炎的腦脊液 mNGS 檢測技術平臺。研究人員將臨床樣本與無模板對照、陽性對照同時進行濕實驗和干實驗流程，建立了不同類型微生物的閾值標準，確定了該方法的檢出限、批間和批內重復性等。將該流程應用于已知微生物結果的腦脊液樣本的檢測，結果表明，與初始臨床試驗結果相比，mNGS 的靈敏度為 73%，特異度為 99%。該研究團隊的工作為今后臨床常規開展 mNGS 檢測提供了性能驗證模板。在血流感染領域，Karius 公司開發了一套基于 mcf-DNA 測序鑒定血漿微生物的工作流程，并評估了該方法的檢測限、精密度和特異度等性能指標，在評估該方法用于 350 例疑似膿毒癥患者感染病原體檢出情況時發現，mNGS 的陽性符合率達 84.8%～93.7%，同時與膿毒癥綜合參考標準相比，mNGS 的靈敏度達 92.9%[40]。Jing 等[41]采用 3 組對照（外部陰性質控、常規陰性樣本以及健康人群樣本）分別用于區分標本采集、樣品處理和人體正常菌群所產生的污染，最大限度地減少假陽性結果的干擾，同時根據臨床多種微生物學檢測結果、臨床用藥和診斷結果，將 mNGS 檢出的微生物的結果分為 definite、probable、possible 和 unlikely。結果表明，與血培養相比，mNGS 的靈敏度和特異度分別為 84.2%和 78.3%，而與臨床綜合判定結果相比，mNGS 的靈敏度和特異度分別為 87.1%和 80.2%，陽性預測值和陰性預測值分別為 77.9%和 88.6%。在呼吸道感染領域，為區分病原體和呼吸道共生菌，一項關于成人危重下呼吸道感染的 mNGS 測序研究開發了雙模型組合，在 24 例患者的獨立驗證隊列中進行測試時，2 種模型的準確度均達到 95.5%[42]。另一項前瞻性觀察性臨床研究評估了 mNGS 用于下呼吸道感染病原體鑒定的臨床可用性，結果表明以復合參考標準作為金標準，mNGS 檢測的靈敏度為 66.7%，特異度為 75.4%，陽性預測值為 78.5%，陰性預測值為 62.7%[43]。此外，Gu 等[8]還建立了針對感染患者多種體液樣本的 mNGS 檢測方案，并對該分析流程進行了性能確認和診斷效能評估。
2.3 mNGS 測序的質量評估
對于不同的 mNGS 試劑，其操作流程和測序平臺、檢測結果的假陽性等問題，均是 mNGS 檢測準確度和定量面臨的技術挑戰。2019 年，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所組織國內 17 家單位開展了病原 mNGS 檢測試劑質量評價聯合研究，通過對 mNGS 檢測的靈敏度、特異度、準確度及其相關影響因素進行深入探究和分析，初步建立了 mNGS 質量評價方法，并為 mNGS 的發展提出了技術性建議[44]。2021 年，國家衛生健康委臨床檢驗中心啟動了下呼吸道宏基因組檢測室間質評研究，該研究從檢測分析靈敏度、特異度、報告解讀及近源物種的鑒定等多方面考察了國內實驗室的 mNGS 檢測能力[45]。
mNGS 在臨床轉化與應用過程中因其技術流程高度復雜，因而需要建立標準化的實驗室和制定標準化的檢測方法，并在相關實驗室完成性能確認的情況下進行臨床應用。在病原 mNGS 技術全流程的驗證過程中，實驗室必須建立以下性能特征：準確度、精密度、分析靈敏度、分析特異度、可報告范圍、參考范圍以及定義測試性能所需的任何其他特征[46]，但目前國內尚未建立完整的質量管理控制和評價體系。
3 小結與展望
面對各種操作流程、報告解讀和周轉時間等方面的諸多挑戰，mNGS 技術不斷發展成熟，有望成為一種廣泛應用于臨床病原微生物鑒定的快速手段。技術流程的不斷優化提高了診斷的時效性和準確度。感染病原體的鑒別結合 CNV 分析能夠為臨床醫生提供更全面的診療依據，指導臨床開展精準治療。從 2016 年至今，隨著 mNGS 技術的不斷更新與越來越多的臨床應用，mNGS 檢測正在逐步走向規范化與自動化。未來，實驗流程的優化和方法學的成熟將實現為臨床提供更加智能化、自動化和個性化的 mNGS 測序服務，結合靶向 NGS 測序將為臨床提供更精準的感染性疾病分子診斷思路。隨著應用轉化研究的進一步深入和聚焦，mNGS 檢測技術應用相關質量評價方法和標準將會得到驗證和完善，最終建立一套嚴謹科學的質量評價方法和標準，從而推動 mNGS 檢測的規范化。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術無需培養和預先假設，可直接對臨床樣本中的核酸物質進行高通量測序以獲得海量序列數據，通過與微生物序列數據庫進行比對分析，獲得標本中微生物的物種和豐度信息[1-2]。與傳統臨床微生物實驗室病原學檢測方法相比，mNGS 可全面覆蓋上萬種病原體，無偏向性快速鑒定細菌、真菌、病毒和寄生蟲等各類病原微生物，包括難以檢測的病原體和新發病原體，尤其對于厭氧菌和苛養菌的鑒定具有優勢[3]。國內外研究證據顯示，病原 mNGS 檢測在中樞神經系統感染、呼吸道感染、血流感染以及局灶感染等領域的臨床研究展現出良好的應用前景，已成為臨床微生物檢測的重要技術補充[1-3]。本文對近年來病原宏基因組測序技術的發展、應用及 mNGS 檢測的標準化和規范化流程進行了總結，以期為病原 mNGS 測序技術更好地為臨床感染輔助診斷提供參考。
1 mNGS 新技術的發展
近年來，mNGS 在關鍵技術層面不斷發展和突破，實現了從傳統的手工操作到自動化流程，從定性結果到定量分析，從快速到極速，從感染到感染與腫瘤雙重分析，從血漿游離 DNA 測序到血流感染相關高敏 mNGS 測序。
1.1 從手工操作到自動化流程
mNGS 作為一種無需培養和預設的病原學檢測技術，已有證據表明其可提高臨床感染性疾病病原學的診斷率[2]。但繁瑣的濕實驗流程導致 mNGS 檢測周期較長，且對實驗室空間、設備及操作人員需求較大，因而限制了 mNGS 在醫療機構的本地化開展。源于“一網打盡”的特性，mNGS 不僅會檢測到樣品中的微生物核酸，還會檢測到容器、環境和試劑中的微生物核酸，增加結果判讀的難度。此外，大多數手工操作的測序平臺需要在 18～72 h 內才能完成從樣本接收到出具 mNGS 報告的流程[2]。因此，提高檢測時效性同時降低背景微生物干擾，對于 mNGS 在臨床上的應用以及醫療機構的本地化開展至關重要。相比手工操作，自動化流程對于提升 mNGS 檢測時效性、控制外源微生物污染、降低背景微生物干擾等具有巨大優勢，因而更有助于 mNGS 在臨床上的應用推廣。
mNGS 檢測流程有多種，其中基于 NGSmaster 和 PCR（polymerase chain reaction）-free 的檢測流程可以自動化完成核酸提取、文庫制備和純化的全流程，并可將 DNA 測序和 RNA 測序的報告時間分別縮短至 16 h 和 18.5 h[4]。一項針對該流程的檢測性能驗證研究表明，自動化流程相比手工操作能大幅降低外源微生物污染可能性，同時 PCR-free 不僅不影響 mNGS 的檢測性能，而且能縮短檢測周期，規避氣溶膠污染風險[4]。
1.2 從單純定性檢測到定量監控
mNGS 技術本身的局限之一是高背景標本導致檢測靈敏度降低[5]。高背景主要源于人類宿主或微生物菌群，在測序數據量等量的情況下，標本中人源核酸含量越高，mNGS 檢測到的人基因組序列數就越多，即檢測到的病原體序列數就越低，對于病原體的檢測靈敏度就越差，甚至導致致病病原體的漏檢或假陰性結果的發生[6]。mNGS 檢測到的微生物序列數受標本中微生物和人源細胞含量雙重影響，盡管去人源技術可在一定程度上提高 mNGS 的靈敏度，但同樣存在非特異性損失病原體的風險。為解決這一問題，一種新型測序技術—定量 mNGS（quality/quantity mNGS，Q-mNGS）應運而生，該技術通過在樣本中加入特異性分子內標（spike），對病原體含量和人源宿主含量進行相對定量，結合人源指數（Host index）和病原指數（Q index）判斷標本中人源含量高低以及溯源標本中的真實病原載量，協助臨床判斷個體感染差異，并評估患者抗感染療效[6]。
將基于分子內標的 mNGS 測序應用于臨床疑似肺炎患者的診斷，可以實現對標本中人源和病原含量進行定量檢測，結合選擇性去人源，對支氣管肺泡灌洗液樣本的診斷陽性率可達 93.04%，特異度達 93.33%，表明該方法可以有效提升疑似肺炎感染患者的診斷率[6]。此外，一項針對感染新生兒的臨床研究顯示，基于內標定量的 mNGS 可對傳統病原學陰性的感染新生兒進行病原體鑒定并指導抗生素治療，通過定量分析還可以輔助臨床進行療效監控[7]。
1.3 從快速 mNGS 到極速精準 mNGS
盡管牛津納米孔測序平臺最快可在 6 h 內完成測序和實時檢測分析，但相較于 Illumina 二代測序方法，依然存在測序深度較低、數據產出較低和測序錯誤率較高等不足[8]。因此，在保證測序結果準確的同時，如何進一步提升 mNGS 的檢測時效性，成為了病原 mNGS 測序行業的探索重點。國內有研究團隊通過創新性地對測序接頭進行改進，通過結合自動化建庫設備和生物信息實時分析流程，開發了一套快速 mNGS 檢測方案，基于 NextSeq 測序平臺，該流程將收樣到完成分析的周轉時間降低到 9.1～10.1 h，可在不影響測序質量的前提下對樣本進行快速、實時分析[9]。
針對 153 個下呼吸道標本的性能驗證試驗顯示，基于復合參考標準，36 bp（base pair）快速 mNGS 的病原體檢測能力達到了陽性符合率為 80.3%～96.8%，陰性符合率為 97.4%～100%[9]。基于改良的測序接頭和生物信息實時快速分析系統，極速 mNGS 檢測有望為疑難、危重、特殊感染患者的救治提供更及時、更精準、更全面的診療指導。
1.4 從感染鑒別到“感染+腫瘤”多維診斷
對疑似感染患者進行 mNGS 測序能夠幫助識別病原體，但惡性腫瘤患者與感染患者的部分臨床癥狀相似，通常難以鑒別，對此類患者進行常規 mNGS 檢測時，結果可能為陰性，無法及時獲取準確的診斷信息將導致不必要的抗生素治療、高昂的醫療費用以及不良的預后。腫瘤診斷的金標準通常是具有侵入性的活檢和病理染色，一般需要 3～7 d，在不考慮腫瘤時，可能并不選擇進行活檢[10]。染色體核型分析是染色體畸變的金標準，但該方法僅適用于外周血和骨髓，檢測周期長（4～7 d），分辨率低，且無法檢出 5 Mb 以下的染色體拷貝數變異（copy number variation，CNV）[10]。目前學界廣泛認為，染色體不穩定性是一種重要的腫瘤標志物[10-11]。一項前瞻性隊列研究表明，前列腺癌患者的尿液標本中存在大量 CNV 特征的脫落細胞[12]。還有研究顯示，mNGS 測序分析過程中獲得的大量人源基因組序列可用于檢測染色體 CNV，有助于診斷隱源性腫瘤[13]。
基于上述原理，國內有研究團隊利用該技術同時檢測肺活檢組織中的病原體和染色體不穩定性。結果表明，基于 Illumina 平臺的 mNGS 同時檢測到 38 例感染患者和 36 例癌癥患者，與病理檢查結果比較，mNGS 對于腫瘤診斷的臨床靈敏度為 83.7%，特異度為 97.6%[11]。有研究將 mNGS 應用于中樞神經系統惡性腫瘤患者的鑒別診斷，結果表明腦脊液 mNGS 檢測的靈敏度為 75%，特異度為 100%[14]。還有文獻報道了在抗感染治療仍無好轉的情況下，通過對人源核酸序列進行分析成功診斷 1 例下頜骨彌漫性大 B 細胞淋巴瘤病例，這表明 mNGS 不僅有助于快速進行病原學診斷，還有助于排除感染和診斷惡性腫瘤，對于疑似感染的患者鑒別診斷具有重要意義[15]。尤其是當常規方法和 mNGS 的病原學結果均為陰性時，CNV 分析提示的腫瘤信號能夠指導臨床進行病因學的鑒別診斷，以便及早啟動針對性治療，更好地改善患者預后[16]。任海濤等[17]的研究中，患者腦脊液 mNGS 未檢出可疑陽性微生物，但人源序列進行染色體拷貝數分析提示異常，該結果為排除感染性腦膜炎提供了證據，結合臨床表現和腦脊液細胞學最終確診肺癌腦轉移，靶向抗腫瘤治療后，患者癥狀明顯好轉。還有前瞻性多中心臨床研究顯示，Onco-mNGS 分析對腫瘤分期檢測的陽性百分比一致性和陰性百分比一致性分別為 66.7%和 98.3%[18]，初步證實了基于 mNGS 測序和 CNV 分析的 Onco-mNGS 同時檢測患者標本中病原體和腫瘤信號的可行性和臨床價值。
1.5 血流感染相關高敏 mNGS 測序
作為血流感染診斷的金標準，血培養的陽性率低，檢測病原范圍有限，且結果報告周期長，血液標本是病原 mNGS 測序最為廣泛的樣本類型之一，但在實際臨床應用中卻面臨著靈敏度受限的問題。全血中的病原體核酸通常以游離核酸（cell free DNA，cf-DNA）存在于血漿中或者以完整基因組存在于病原顆粒中，但由于傳統 mNGS 僅檢測血漿微生物游離核酸（microbial cf-DNA，mcf-DNA），因此存在較高的漏檢和假陰性的風險。為了評估肺泡包蟲病患者的治療效果，有研究開發了血漿蟲源性游離核酸（Em-cfDNA）的 mNGS 檢測，結果表明，Em-cfDNA 對肺泡包蟲病的診斷靈敏度和特異度分別為 100%和 90.9%，陽性預測值和陰性預測值均為 100%，并且該方法具有良好的術后效果監測價值[19]。也有測序公司創新性地將超多重引物靶向擴增技術或探針捕獲技術與 NGS 技術結合，改善了病原 mNGS 檢測的特異度與廣譜性，該技術協助醫生臨床快速診斷了 1 例血液透析患者中出現的黃曲霉所致感染性心內膜炎[20]。
2 mNGS 的標準化及規范化
2014 年，Wilson 等[21]首次利用 mNGS 測序技術成功診斷并治愈了 1 例聯合免疫缺陷病患者的鉤端螺旋體病，開啟了 mNGS 的臨床應用時代。近年來，基于高通量測序平臺的病原 mNGS 技術在各類感染性疾病領域的應用越來越廣泛。為了規范 mNGS 技術在臨床的應用，國內外專家陸續編寫發表了多篇 mNGS 檢測應用于感染疾病診斷的專家共識[22-38]。由于 mNGS 操作流程復雜，且其檢測性能受到包括微生物種類、人源宿主核酸含量、測序數據量等各種因素的顯著影響，因此在開展實驗室檢測和臨床應用前需要對其性能指標進行充分的驗證。目前，一些實驗室已經較為系統地完成了自建 mNGS 平臺的性能確認工作，有多篇研究論文公布了關于腦脊液、血漿、呼吸道標本 mNGS 測序相關的性能驗證數據[39-43]。
2.1 mNGS 臨床應用專家共識
2016 年，美國食品藥品監督管理局發布了 NGS 感染性疾病診斷設備草案，為基于高通量測序技術進行病原體、耐藥和毒力因子檢測的相關技術提供了科學指南[2]。此后，mNGS 被寫入了不同感染領域相關診斷和治療的指南共識，包括不同類型病原體的感染（利什曼原蟲感染[22]、念珠菌病[23]、中樞神經系統結核病[24]）、不同患者的感染（成人肺炎[25]、兒童呼吸道感染[26]）、不同臨床科室/領域的感染（急診[27]、重癥[28]）以及不同器官/系統的感染（移植術后感染[29]、危重患者血流感染[30]、神經外科中樞神經系統感染[31]、人工關節感染[32]）。
2020 年 11 月，針對所有感染性疾病的宏基因組學臨床應用專家共識正式發布，該共識首次針對不同感染癥候群，包括中樞神經系統感染、血流感染、局灶性感染、呼吸道感染的適用范圍給出了相應的推薦意見，為國內感染病原體宏基因組學檢測建立了標準規范[33]。隨后，檢驗領域陸續發布了涉及 mNGS 測序的臨床應用、技術流程、實驗室規范（質量管理、性能驗證）以及生物信息分析和結果解讀等方面的專家共識，為進一步推動該技術在感染病原體檢測領域的科學嚴謹、合規應用提供了強有力的指導意見[34-36]。經過不斷的技術優化、臨床應用研究與經驗積累，在臨床感染細分領域如中樞神經系統感染、新生兒感染也先后發布了促進病原 mNGS 規范化應用的共識文件[37-38]。
2.2 mNGS 流程的性能驗證
在中樞神經系統感染領域，國外 Miller 等[39]建立并驗證了一個用于綜合診斷腦膜炎和腦炎的腦脊液 mNGS 檢測技術平臺。研究人員將臨床樣本與無模板對照、陽性對照同時進行濕實驗和干實驗流程，建立了不同類型微生物的閾值標準，確定了該方法的檢出限、批間和批內重復性等。將該流程應用于已知微生物結果的腦脊液樣本的檢測，結果表明，與初始臨床試驗結果相比，mNGS 的靈敏度為 73%，特異度為 99%。該研究團隊的工作為今后臨床常規開展 mNGS 檢測提供了性能驗證模板。在血流感染領域，Karius 公司開發了一套基于 mcf-DNA 測序鑒定血漿微生物的工作流程，并評估了該方法的檢測限、精密度和特異度等性能指標，在評估該方法用于 350 例疑似膿毒癥患者感染病原體檢出情況時發現，mNGS 的陽性符合率達 84.8%～93.7%，同時與膿毒癥綜合參考標準相比，mNGS 的靈敏度達 92.9%[40]。Jing 等[41]采用 3 組對照（外部陰性質控、常規陰性樣本以及健康人群樣本）分別用于區分標本采集、樣品處理和人體正常菌群所產生的污染，最大限度地減少假陽性結果的干擾，同時根據臨床多種微生物學檢測結果、臨床用藥和診斷結果，將 mNGS 檢出的微生物的結果分為 definite、probable、possible 和 unlikely。結果表明，與血培養相比，mNGS 的靈敏度和特異度分別為 84.2%和 78.3%，而與臨床綜合判定結果相比，mNGS 的靈敏度和特異度分別為 87.1%和 80.2%，陽性預測值和陰性預測值分別為 77.9%和 88.6%。在呼吸道感染領域，為區分病原體和呼吸道共生菌，一項關于成人危重下呼吸道感染的 mNGS 測序研究開發了雙模型組合，在 24 例患者的獨立驗證隊列中進行測試時，2 種模型的準確度均達到 95.5%[42]。另一項前瞻性觀察性臨床研究評估了 mNGS 用于下呼吸道感染病原體鑒定的臨床可用性，結果表明以復合參考標準作為金標準，mNGS 檢測的靈敏度為 66.7%，特異度為 75.4%，陽性預測值為 78.5%，陰性預測值為 62.7%[43]。此外，Gu 等[8]還建立了針對感染患者多種體液樣本的 mNGS 檢測方案，并對該分析流程進行了性能確認和診斷效能評估。
2.3 mNGS 測序的質量評估
對于不同的 mNGS 試劑，其操作流程和測序平臺、檢測結果的假陽性等問題，均是 mNGS 檢測準確度和定量面臨的技術挑戰。2019 年，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所組織國內 17 家單位開展了病原 mNGS 檢測試劑質量評價聯合研究，通過對 mNGS 檢測的靈敏度、特異度、準確度及其相關影響因素進行深入探究和分析，初步建立了 mNGS 質量評價方法，并為 mNGS 的發展提出了技術性建議[44]。2021 年，國家衛生健康委臨床檢驗中心啟動了下呼吸道宏基因組檢測室間質評研究，該研究從檢測分析靈敏度、特異度、報告解讀及近源物種的鑒定等多方面考察了國內實驗室的 mNGS 檢測能力[45]。
mNGS 在臨床轉化與應用過程中因其技術流程高度復雜，因而需要建立標準化的實驗室和制定標準化的檢測方法，并在相關實驗室完成性能確認的情況下進行臨床應用。在病原 mNGS 技術全流程的驗證過程中，實驗室必須建立以下性能特征：準確度、精密度、分析靈敏度、分析特異度、可報告范圍、參考范圍以及定義測試性能所需的任何其他特征[46]，但目前國內尚未建立完整的質量管理控制和評價體系。
3 小結與展望
面對各種操作流程、報告解讀和周轉時間等方面的諸多挑戰，mNGS 技術不斷發展成熟，有望成為一種廣泛應用于臨床病原微生物鑒定的快速手段。技術流程的不斷優化提高了診斷的時效性和準確度。感染病原體的鑒別結合 CNV 分析能夠為臨床醫生提供更全面的診療依據，指導臨床開展精準治療。從 2016 年至今，隨著 mNGS 技術的不斷更新與越來越多的臨床應用，mNGS 檢測正在逐步走向規范化與自動化。未來，實驗流程的優化和方法學的成熟將實現為臨床提供更加智能化、自動化和個性化的 mNGS 測序服務，結合靶向 NGS 測序將為臨床提供更精準的感染性疾病分子診斷思路。隨著應用轉化研究的進一步深入和聚焦，mNGS 檢測技術應用相關質量評價方法和標準將會得到驗證和完善，最終建立一套嚴謹科學的質量評價方法和標準，從而推動 mNGS 檢測的規范化。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。