近年來，由于免疫抑制劑的廣泛使用，腫瘤、器官移植患者的增多，侵襲性真菌病，特別是肺真菌病的發病率逐年升高。除臨床表現、病史、影像學資料外，肺真菌病的診斷主要依賴實驗室病原學檢測。但真菌培養耗時長、靈敏度低，需要更多的檢測手段。近年來宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）的出現極大提高了肺部真菌感染的診斷率。相比之下，mNGS 能直接從各種臨床標本中快速、準確、全面識別真菌，尤其在鑒定非典型真菌的類群方面明顯優于傳統檢測方法，但在樣本留取、報告解讀及與傳統檢測方法相結合等方面也存在一些問題。值得肯定的是，隨著以上問題不斷深入探討和解決，mNGS 必將為肺部真菌感染的病原學診斷提供更有價值的信息。
引用本文： 武永莉, 魯炳懷. 實驗室傳統檢測與宏基因組二代測序在肺部真菌感染診斷中的應用價值. 華西醫學, 2022, 37(8): 1128-1133. doi: 10.7507/1002-0179.202206117 復制
近年來隨著實體器官移植、造血干細胞移植和腫瘤化學治療患者的增多，糖皮質激素與免疫抑制劑的廣泛使用，以及重癥病毒感染、嚴重肝腎疾病、糖尿病、血液系統腫瘤等影響免疫功能的疾病發病率升高，侵襲性真菌病，特別是肺部真菌感染逐年升高[1-2]。肺部真菌感染主要通過臨床癥狀、病史、影像學、實驗室病原學檢測等診斷，但由于其臨床表現并不特異，影像學診斷需要與肺結核、非結核分枝桿菌感染等進行鑒別，加之肺部真菌感染還可能伴有其他細菌或病毒的混合感染或繼發感染[3]，導致肺部真菌感染診斷困難[4]。宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）被用于多種臨床樣本的病原學檢測，極大提高了肺部真菌感染的診斷率，但在樣本留取、報告解讀及與傳統檢測方法相結合等方面尚存在一些問題[5-8]。本文將對 mNGS 用于肺部真菌感染診斷中常出現的問題進行評述。
1 肺部感染真菌的類別
可引起肺部真菌感染的病原體種類較多，比較常見的包括隱球菌屬、曲霉屬、毛霉屬、肺孢子菌屬等[9-10]。假絲酵母菌屬引起的肺部感染較為少見，其主要為真菌入血后播散到肺部所致，胸部 CT 常表現為肺臟多發性結節樣改變。其他致病性真菌包括組織胞漿菌、球孢子菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、馬爾尼菲藍狀菌等引起的肺部感染則更為少見。
2 真菌感染實驗室診斷方法
肺部真菌感染的實驗室診斷方法主要包括以下 3 類：① 病原學診斷方法，如涂片顯微鏡檢、分離培養；② 免疫學診斷方法；③ 分子生物學診斷方法。
2.1 病原學診斷方法
2.1.1 顯微鏡檢
顯微鏡檢法方便、快速，不需要特殊儀器設備，適合在各級實驗室開展，可在顯微鏡下直觀觀察病原菌與炎性細胞的關系，判斷是否有組織侵襲。顯微鏡檢法的不足之處在于：① 靈敏度相對較低，病原菌數量少時難以發現；② 需要工作人員有一定的臨床檢驗工作經驗；③ 該法難以鑒定到種，有一定的誤差率；④ 微生物實驗室制片過程中采用的染色手段與病理組織切片制片相比較為局限，影響檢出率。常見肺部感染真菌顯微鏡檢圖詳見圖1。
圖1
常見肺部感染真菌顯微鏡檢圖
a. 肺組織內新型隱球菌（銀染 ×400）；b. 支氣管鏡采集的下呼吸道分泌物中根霉屬（熒光染色 ×400）；c. 下呼吸道樣本中隱球菌屬（革蘭染色 ×1000）；d. 肺組織內曲霉屬（銀染 ×1000）；e. 肺組織內新型隱球菌（墨汁染色 ×400）；f. 支氣管肺泡灌洗液中曲霉屬（熒光染色 ×400）。圖片為作者拍攝
2.1.2 分離培養
部分真菌培養困難，如毛霉目（包括根霉屬、毛霉屬、橫梗霉屬、小克銀漢霉屬以及根毛霉屬等）。有時顯微鏡檢可見大量菌絲，但培養陽性率不高。特別是肺穿刺組織的樣本，由于微生物實驗室采用研磨的方法處理標本，常導致毛霉目真菌菌體被損壞，生長困難。而耶氏肺孢子菌在常見的培養肉湯、沙氏培養基、土豆培養基等均不生長。隱球菌屬與曲霉屬相對容易培養，但曲霉屬與毛霉目真菌在周圍環境中可見，也可以孢子形式被吸入呼吸道而定植，培養陽性不一定意味著感染[10]，因此，要特別注意區分培養陽性菌株的臨床價值。常見肺部感染真菌培養物詳見圖2。
圖2
常見肺部感染真菌培養物
a. 經皮穿刺肺組織沙氏培養基培養出普通裂褶菌；b. 下呼吸道樣本經血平皿培養出新型隱球菌；c. 沙氏培養基培養出煙曲霉。圖片為作者拍攝
2.2 免疫學診斷方法
肺部真菌感染常用的免疫學診斷試驗包括 1,3-β-D 葡聚糖試驗（G 試驗）、半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）抗原試驗、曲霉免疫球蛋白 G 抗體試驗、隱球菌莢膜多糖抗原試驗等。隱球菌莢膜多糖抗原試驗在診斷隱球菌感染中具有極重要價值，靈敏度為 55%～97.7% 不等，與檢測時間、研究納入人群及試劑有關[4, 11]。曲霉免疫球蛋白 G 抗體試驗在超敏反應性支氣管肺曲霉病與慢性肺曲霉病診斷中有較好的應用價值。G 試驗在肺孢子菌肺炎（pneumocystis pneumonia，PCP）診斷中，以>200 pg/mL 為截斷值，靈敏度與特異度可分別高達 94.8% 與 86.3%[4]。GM 試驗主要用來輔助診斷侵襲性肺曲霉病，但激素使用者較中性粒細胞缺乏者該試驗更容易出現假陰性。值得注意的是，GM 水平升高偶可見于鐮刀菌屬與莢膜組織胞漿菌感染的患者，臨床上應注意甄別。
2.3 分子生物學診斷方法
分子生物學診斷方法，即微生物核酸（DNA 或 RNA）分子鑒定。目前最常見的分子生物學診斷方法是聚合酶鏈反應，但其在真菌檢測中應用相對較少，主要原因在于真菌的細胞壁較厚，常規方法下核酸提取困難。
近年來，mNGS 的出現及臨床應用為肺部真菌感染的診斷提供了非常重要的手段，使臨床診斷下呼吸道真菌感染的方法更加豐富，具有重要的臨床價值。mNGS 技術無需對獲取的臨床樣本進行培養，其可直接從樣本中提取全部微生物的核酸，然后對提取的核酸構建標準測序文庫并進行高通量測序，最后運用生物信息學分析確認各個物種的基因組序列比對，從而得知樣品中微生物的種類和豐度。因此，本質上，mNGS 同屬于分子生物學診斷方法。mNGS 在不同真菌感染中的診斷價值略有差異，如果不在核酸提取方面下功夫，其在檢查細胞壁較厚、脂質成分較多的真菌類病原微生物時靈敏度有限，檢測陰性不能排除感染。
3 影響 mNGS 診斷效率的要素總結及其在肺部真菌感染中的臨床應用
3.1 mNGS 對肺部真菌感染送檢標本的要求
留取合格樣本是準確診斷肺部真菌感染的前提。
3.1.1 標本類型
mNGS 的送檢樣本應來自于感染部位，肺部真菌感染是下呼吸道感染，送檢樣本包括以下類型：① 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）：總體而言，BALF 是下呼吸道感染較為理想的 mNGS 送檢樣本。采集 BALF 樣本時還可通過支氣管鏡觀察病變部位，有時甚至可以見到菌團樣或膿性分泌物，通常采集此部位的樣本最為理想。但當真菌菌絲侵襲并損傷至黏膜下血管壁時，為避免在獲取樣本時導致血管損傷，在采集標本時須謹慎操作。此外，若患者免疫狀況較好，隱球菌屬和某些曲霉屬等的感染部位肺部病變局限，BALF mNGS 未必能檢測到病原菌。② 痰液樣本：痰液樣本雜菌多，干擾大，通常不推薦，特別是留取不合格的樣本，其診斷價值將大受影響。但若患者無法耐受支氣管鏡檢查等有創操作，可在用清水充分漱口后用力咳出支氣管深處的痰液及時送檢，注意勿混入鼻咽分泌物。③ 鼻咽拭子：僅可用來診斷呼吸道病毒、化膿性鏈球菌等引起的上呼吸道感染或推測下呼吸道感染的病原類型。如果采用 mNGS 法在鼻咽拭子中檢出真菌，說明鼻咽部有真菌定植。④ 血液樣本：若患者病情較重，不能耐受支氣管鏡或其他侵入性檢查，可以采集血液樣本進行 mNGS 檢測。原因是肺部真菌感染時，定植或侵襲的病原菌裂解后可釋放游離核酸入血，此時可通過檢測血液中游離 DNA（cell-free DNA，cfDNA）來推斷肺部有無感染[12]。如果血液樣本中檢出真菌核酸序列，可能是病原菌入血或病原菌 cfDNA 入血所致，與其他部位的侵襲性真菌感染有較大相關性[13]。因此，cfDNA 的陽性結果并不意味著檢測到真正的病原菌，無癥狀人群（22.8%）也可出現 cfDNA 陽性[13]。⑤ 肺組織活檢樣本或穿刺樣本：如果常用樣本無法明確肺部真菌感染的病原學來源，或需要病理學檢測明確或排除腫瘤、間質性疾病時，可使用肺組織活檢樣本進行 mNGS 檢測。但須注意，肺組織樣本獲取代價高，人源序列多，mNGS 檢測靈敏度有限，在使用 mNGS 檢測的同時還應進行顯微鏡檢、真菌增菌培養、病理學檢查，多種手段協同診斷。
3.1.2 采樣時機
抗真菌治療后，病原體死亡，難以采用傳統檢測方法檢出，但 DNA 可存續一段時間，存續時間與病原體的類別和患者免疫狀況有關，通常為 2～3 周或者更長時間。因此，使用抗真菌藥物后一段時間，采用 mNGS 進行真菌病原檢出的陽性率相較傳統檢測方法依然很高，這是 mNGS 較常規培養方法的優勢所在[7]。因此，短時間使用抗真菌藥物后采樣進行 mNGS 檢測對檢出率的影響并不大，但較長時間使用抗真菌藥物則會影響檢測結果，檢出率會隨給藥時間延長而下降。
3.2 mNGS 檢測真菌報告解讀注意事項
讀長（reads）數是指測序獲得的堿基序列片段的數量。測序平臺不同，如 Illumina 測序與 Nanopore 測序，讀長序列長度也不一致[7]。高讀長數意味著匹配到某真菌種或屬特異性片段的數量較多，如果結合覆蓋率等信息，高讀長常指示該真菌核酸存在。由于不同廠家處理流程不同，不同原始樣本的人源組織序列數據也相差很大，目前還難以給出判斷高低讀長數的域值。
mNGS 檢測陽性可能是感染的病原菌，也可能是正常菌群、一過性定植、樣本污染等。應該注意的是，mNGS 本質上檢測的是核酸，即使正常的無菌部位，也可能檢出微生物菌群，呼吸道樣本更是如此。而一些病原體很少成為定植菌或污染菌，在結合臨床患者情況及病原微生物相關檢查的前提下，絕大多數情況下檢出即有價值，比如隱球菌屬、結核分枝桿菌等。因此，臨床 mNGS 的報告必須結合患者情況進行解讀[14-16]。
在解讀 mNGS 報告時，常會發現某一種真菌僅有數個或十幾個讀長，包括曲霉屬、毛霉目，導致臨床解讀非常困難。出現此種情況可能存在如下可能：① 真菌細胞壁較厚，核酸提取較為困難；② 患者進行抗真菌治療后，真菌數量下降，此時采集樣本進行測序得到的可能是病原菌死亡后裂解的游離核酸片段序列，導致讀長數偏低；③ mNGS 檢測過程中，周圍環境中的曲霉屬、毛霉目等病原菌可能被引入檢測流程而造成污染，特別是在核酸提取操作過程中，在最終檢測時這些真菌的核酸序列也將被報告，但讀長數相對較低；④ 二代測序時，高能量的單個芯片上要檢測多個患者的樣本，操作不規范時會造成交叉污染，特別是其中一個樣本病原載量很高時；⑤ 測序數據與數據庫比對時，可能因數據庫菌種的特異性序列選擇不佳，而出現比對錯誤，會報告少量錯誤讀長；⑥ 原始樣本中病原載量低，如細胞內感染菌（如結核分枝桿菌）因釋放到體液中的菌量較少而導致檢測敏感性偏低，報告中反映為讀長較低[17]。
因此，臨床工作中，如果檢出真菌的讀長較少，需結合患者的臨床癥狀、實驗室常見檢測結果、影像學表現等綜合判斷。例如，患者免疫狀況較好，檢測出低讀長數耶氏肺孢子菌，影像學無磨玻璃影等特征性表現，G 試驗無不明原因升高，可暫不考慮 PCP 診斷。如檢出隱球菌低讀長數，應首選用隱球菌莢膜多糖抗原實驗去驗證，如為陽性即考慮為肺隱球菌病診斷成立，如為陰性，應結合其他手段，包括 BALF 或肺組織穿刺行顯微鏡檢與培養等。
3.3 mNGS 在肺部真菌感染診斷中優勢和劣勢
目前真菌檢測的手段相對較少，缺乏如聚合酶鏈反應、恒溫擴增等臨床可應用的單重或多重分子診斷方案，此時 mNGS 技術在診斷肺部真菌感染時就顯得尤為重要。例如毛霉目和曲霉屬，二者培養時間均較長，毛霉目有時培養較為困難，顯微鏡檢不易區別，但二者所致肺部感染在臨床處理措施上存在很大差異。針對這種情況，mNGS 體現出其獨特的優勢。
mNGS 和傳統病原學檢測技術各具優勢。mNGS 的優勢在于：① 48 h 內可獲得檢測結果，且檢測結果可精確到菌種。其較分離培養方法耗時短，較顯微鏡檢更準確。② 檢測的菌種范圍可覆蓋到罕見真菌菌種，如莢膜組織胞漿菌、球孢子菌屬等多見于美洲的地方性真菌。這些地方性真菌培養需要數日至數周，國內的大多數檢驗醫師對其認識有限，易造成誤診、漏診，延誤治療。而對于 mNGS 而言，只要解決真菌核酸提取困難的問題，同時確保數據庫有該類病原的基因，正確診斷并不困難。③ 對于混合感染或合并基礎疾病（如免疫力低下）的患者，mNGS 的檢出率較傳統方法明顯升高，可作為傳統檢測方法陰性的真菌性肺炎患者的補充檢測技術。目前，臨床常通過 mNGS 報告可疑致病真菌的核酸序列，實驗室再采用不同手段確認 mNGS 結果是否可靠。
但是，由于真菌細胞壁厚，破壁困難，核酸提取量少，如果 mNGS 檢測過程中不對標本進行特殊處理，其靈敏度并不優于傳統的分離培養或顯微鏡檢。且對于不同真菌，mNGS 的檢測價值并不一致。建議除非特殊情況，否則送檢 mNGS 時，應同時送檢傳統病原學檢測方法，多種手段聯合，結果互相驗證，再結合患者的病情、免疫狀況、影像學表現等，作出正確診斷。肺部真菌感染的檢測如果僅依靠 mNGS，將會給臨床診斷帶來很大困惑。如曲霉屬、毛霉目等病原體常見于周圍環境中或定植于正常人體的呼吸道，mNGS 檢測陽性并不意味著即為致病菌。國外文獻表明，近 40% 的非肺部真菌感染者的樣本中可檢測出曲霉屬核酸序列[10]。而對于耶氏肺孢子菌感染，傳統的病原學檢測手段只有顯微鏡檢，無法對其進行體外培養，此時 mNGS 便可為 PCP 的病原學診斷提供較大幫助。
4 結論與展望
總之，肺部真菌感染的臨床診斷，特別是病原學診斷存在很多挑戰。顯微鏡檢、分離培養、免疫學檢測以及核酸分子鑒定（如聚合酶鏈反應）等傳統手段能夠識別的真菌類別相對較窄，存在耗時、易漏檢等缺陷，給快速、準確診斷肺部真菌感染病原體帶來巨大挑戰，進而導致經驗性廣譜抗菌藥物的濫用。相比之下，mNGS 能直接從各種臨床標本中快速、準確、全面識別真菌，尤其在鑒定非典型真菌的類群方面明顯優于傳統培養方法。
mNGS 技術近年來發展迅速，但還存在一些亟待解決的問題：① mNGS 送檢樣本中檢出的大量人源序列，目前認為可能與機體免疫、炎癥狀態密切相關，還需對此進行詳細分析與研究；② mNGS 在檢測病原體耐藥基因、毒力基因等重要方面尚未成熟；③ 目前尚未出現高效快捷的厚壁病原體破壁方法及核酸提取技術，降低了 mNGS 對病原體的檢出率；④ mNGS 的檢測流程尚未標準化，不同廠家之間的檢測結果差異較大，給其報告解讀帶來很多困難。我們相信，隨著以上問題不斷深入探討和解決，mNGS 必將為肺部感染真菌的病原學診斷提供更有價值的信息。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
近年來隨著實體器官移植、造血干細胞移植和腫瘤化學治療患者的增多，糖皮質激素與免疫抑制劑的廣泛使用，以及重癥病毒感染、嚴重肝腎疾病、糖尿病、血液系統腫瘤等影響免疫功能的疾病發病率升高，侵襲性真菌病，特別是肺部真菌感染逐年升高[1-2]。肺部真菌感染主要通過臨床癥狀、病史、影像學、實驗室病原學檢測等診斷，但由于其臨床表現并不特異，影像學診斷需要與肺結核、非結核分枝桿菌感染等進行鑒別，加之肺部真菌感染還可能伴有其他細菌或病毒的混合感染或繼發感染[3]，導致肺部真菌感染診斷困難[4]。宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）被用于多種臨床樣本的病原學檢測，極大提高了肺部真菌感染的診斷率，但在樣本留取、報告解讀及與傳統檢測方法相結合等方面尚存在一些問題[5-8]。本文將對 mNGS 用于肺部真菌感染診斷中常出現的問題進行評述。
1 肺部感染真菌的類別
可引起肺部真菌感染的病原體種類較多，比較常見的包括隱球菌屬、曲霉屬、毛霉屬、肺孢子菌屬等[9-10]。假絲酵母菌屬引起的肺部感染較為少見，其主要為真菌入血后播散到肺部所致，胸部 CT 常表現為肺臟多發性結節樣改變。其他致病性真菌包括組織胞漿菌、球孢子菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、馬爾尼菲藍狀菌等引起的肺部感染則更為少見。
2 真菌感染實驗室診斷方法
肺部真菌感染的實驗室診斷方法主要包括以下 3 類：① 病原學診斷方法，如涂片顯微鏡檢、分離培養；② 免疫學診斷方法；③ 分子生物學診斷方法。
2.1 病原學診斷方法
2.1.1 顯微鏡檢
顯微鏡檢法方便、快速，不需要特殊儀器設備，適合在各級實驗室開展，可在顯微鏡下直觀觀察病原菌與炎性細胞的關系，判斷是否有組織侵襲。顯微鏡檢法的不足之處在于：① 靈敏度相對較低，病原菌數量少時難以發現；② 需要工作人員有一定的臨床檢驗工作經驗；③ 該法難以鑒定到種，有一定的誤差率；④ 微生物實驗室制片過程中采用的染色手段與病理組織切片制片相比較為局限，影響檢出率。常見肺部感染真菌顯微鏡檢圖詳見圖1。
圖1
常見肺部感染真菌顯微鏡檢圖
a. 肺組織內新型隱球菌（銀染 ×400）；b. 支氣管鏡采集的下呼吸道分泌物中根霉屬（熒光染色 ×400）；c. 下呼吸道樣本中隱球菌屬（革蘭染色 ×1000）；d. 肺組織內曲霉屬（銀染 ×1000）；e. 肺組織內新型隱球菌（墨汁染色 ×400）；f. 支氣管肺泡灌洗液中曲霉屬（熒光染色 ×400）。圖片為作者拍攝
2.1.2 分離培養
部分真菌培養困難，如毛霉目（包括根霉屬、毛霉屬、橫梗霉屬、小克銀漢霉屬以及根毛霉屬等）。有時顯微鏡檢可見大量菌絲，但培養陽性率不高。特別是肺穿刺組織的樣本，由于微生物實驗室采用研磨的方法處理標本，常導致毛霉目真菌菌體被損壞，生長困難。而耶氏肺孢子菌在常見的培養肉湯、沙氏培養基、土豆培養基等均不生長。隱球菌屬與曲霉屬相對容易培養，但曲霉屬與毛霉目真菌在周圍環境中可見，也可以孢子形式被吸入呼吸道而定植，培養陽性不一定意味著感染[10]，因此，要特別注意區分培養陽性菌株的臨床價值。常見肺部感染真菌培養物詳見圖2。
圖2
常見肺部感染真菌培養物
a. 經皮穿刺肺組織沙氏培養基培養出普通裂褶菌；b. 下呼吸道樣本經血平皿培養出新型隱球菌；c. 沙氏培養基培養出煙曲霉。圖片為作者拍攝
2.2 免疫學診斷方法
肺部真菌感染常用的免疫學診斷試驗包括 1,3-β-D 葡聚糖試驗（G 試驗）、半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）抗原試驗、曲霉免疫球蛋白 G 抗體試驗、隱球菌莢膜多糖抗原試驗等。隱球菌莢膜多糖抗原試驗在診斷隱球菌感染中具有極重要價值，靈敏度為 55%～97.7% 不等，與檢測時間、研究納入人群及試劑有關[4, 11]。曲霉免疫球蛋白 G 抗體試驗在超敏反應性支氣管肺曲霉病與慢性肺曲霉病診斷中有較好的應用價值。G 試驗在肺孢子菌肺炎（pneumocystis pneumonia，PCP）診斷中，以>200 pg/mL 為截斷值，靈敏度與特異度可分別高達 94.8% 與 86.3%[4]。GM 試驗主要用來輔助診斷侵襲性肺曲霉病，但激素使用者較中性粒細胞缺乏者該試驗更容易出現假陰性。值得注意的是，GM 水平升高偶可見于鐮刀菌屬與莢膜組織胞漿菌感染的患者，臨床上應注意甄別。
2.3 分子生物學診斷方法
分子生物學診斷方法，即微生物核酸（DNA 或 RNA）分子鑒定。目前最常見的分子生物學診斷方法是聚合酶鏈反應，但其在真菌檢測中應用相對較少，主要原因在于真菌的細胞壁較厚，常規方法下核酸提取困難。
近年來，mNGS 的出現及臨床應用為肺部真菌感染的診斷提供了非常重要的手段，使臨床診斷下呼吸道真菌感染的方法更加豐富，具有重要的臨床價值。mNGS 技術無需對獲取的臨床樣本進行培養，其可直接從樣本中提取全部微生物的核酸，然后對提取的核酸構建標準測序文庫并進行高通量測序，最后運用生物信息學分析確認各個物種的基因組序列比對，從而得知樣品中微生物的種類和豐度。因此，本質上，mNGS 同屬于分子生物學診斷方法。mNGS 在不同真菌感染中的診斷價值略有差異，如果不在核酸提取方面下功夫，其在檢查細胞壁較厚、脂質成分較多的真菌類病原微生物時靈敏度有限，檢測陰性不能排除感染。
3 影響 mNGS 診斷效率的要素總結及其在肺部真菌感染中的臨床應用
3.1 mNGS 對肺部真菌感染送檢標本的要求
留取合格樣本是準確診斷肺部真菌感染的前提。
3.1.1 標本類型
mNGS 的送檢樣本應來自于感染部位，肺部真菌感染是下呼吸道感染，送檢樣本包括以下類型：① 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）：總體而言，BALF 是下呼吸道感染較為理想的 mNGS 送檢樣本。采集 BALF 樣本時還可通過支氣管鏡觀察病變部位，有時甚至可以見到菌團樣或膿性分泌物，通常采集此部位的樣本最為理想。但當真菌菌絲侵襲并損傷至黏膜下血管壁時，為避免在獲取樣本時導致血管損傷，在采集標本時須謹慎操作。此外，若患者免疫狀況較好，隱球菌屬和某些曲霉屬等的感染部位肺部病變局限，BALF mNGS 未必能檢測到病原菌。② 痰液樣本：痰液樣本雜菌多，干擾大，通常不推薦，特別是留取不合格的樣本，其診斷價值將大受影響。但若患者無法耐受支氣管鏡檢查等有創操作，可在用清水充分漱口后用力咳出支氣管深處的痰液及時送檢，注意勿混入鼻咽分泌物。③ 鼻咽拭子：僅可用來診斷呼吸道病毒、化膿性鏈球菌等引起的上呼吸道感染或推測下呼吸道感染的病原類型。如果采用 mNGS 法在鼻咽拭子中檢出真菌，說明鼻咽部有真菌定植。④ 血液樣本：若患者病情較重，不能耐受支氣管鏡或其他侵入性檢查，可以采集血液樣本進行 mNGS 檢測。原因是肺部真菌感染時，定植或侵襲的病原菌裂解后可釋放游離核酸入血，此時可通過檢測血液中游離 DNA（cell-free DNA，cfDNA）來推斷肺部有無感染[12]。如果血液樣本中檢出真菌核酸序列，可能是病原菌入血或病原菌 cfDNA 入血所致，與其他部位的侵襲性真菌感染有較大相關性[13]。因此，cfDNA 的陽性結果并不意味著檢測到真正的病原菌，無癥狀人群（22.8%）也可出現 cfDNA 陽性[13]。⑤ 肺組織活檢樣本或穿刺樣本：如果常用樣本無法明確肺部真菌感染的病原學來源，或需要病理學檢測明確或排除腫瘤、間質性疾病時，可使用肺組織活檢樣本進行 mNGS 檢測。但須注意，肺組織樣本獲取代價高，人源序列多，mNGS 檢測靈敏度有限，在使用 mNGS 檢測的同時還應進行顯微鏡檢、真菌增菌培養、病理學檢查，多種手段協同診斷。
3.1.2 采樣時機
抗真菌治療后，病原體死亡，難以采用傳統檢測方法檢出，但 DNA 可存續一段時間，存續時間與病原體的類別和患者免疫狀況有關，通常為 2～3 周或者更長時間。因此，使用抗真菌藥物后一段時間，采用 mNGS 進行真菌病原檢出的陽性率相較傳統檢測方法依然很高，這是 mNGS 較常規培養方法的優勢所在[7]。因此，短時間使用抗真菌藥物后采樣進行 mNGS 檢測對檢出率的影響并不大，但較長時間使用抗真菌藥物則會影響檢測結果，檢出率會隨給藥時間延長而下降。
3.2 mNGS 檢測真菌報告解讀注意事項
讀長（reads）數是指測序獲得的堿基序列片段的數量。測序平臺不同，如 Illumina 測序與 Nanopore 測序，讀長序列長度也不一致[7]。高讀長數意味著匹配到某真菌種或屬特異性片段的數量較多，如果結合覆蓋率等信息，高讀長常指示該真菌核酸存在。由于不同廠家處理流程不同，不同原始樣本的人源組織序列數據也相差很大，目前還難以給出判斷高低讀長數的域值。
mNGS 檢測陽性可能是感染的病原菌，也可能是正常菌群、一過性定植、樣本污染等。應該注意的是，mNGS 本質上檢測的是核酸，即使正常的無菌部位，也可能檢出微生物菌群，呼吸道樣本更是如此。而一些病原體很少成為定植菌或污染菌，在結合臨床患者情況及病原微生物相關檢查的前提下，絕大多數情況下檢出即有價值，比如隱球菌屬、結核分枝桿菌等。因此，臨床 mNGS 的報告必須結合患者情況進行解讀[14-16]。
在解讀 mNGS 報告時，常會發現某一種真菌僅有數個或十幾個讀長，包括曲霉屬、毛霉目，導致臨床解讀非常困難。出現此種情況可能存在如下可能：① 真菌細胞壁較厚，核酸提取較為困難；② 患者進行抗真菌治療后，真菌數量下降，此時采集樣本進行測序得到的可能是病原菌死亡后裂解的游離核酸片段序列，導致讀長數偏低；③ mNGS 檢測過程中，周圍環境中的曲霉屬、毛霉目等病原菌可能被引入檢測流程而造成污染，特別是在核酸提取操作過程中，在最終檢測時這些真菌的核酸序列也將被報告，但讀長數相對較低；④ 二代測序時，高能量的單個芯片上要檢測多個患者的樣本，操作不規范時會造成交叉污染，特別是其中一個樣本病原載量很高時；⑤ 測序數據與數據庫比對時，可能因數據庫菌種的特異性序列選擇不佳，而出現比對錯誤，會報告少量錯誤讀長；⑥ 原始樣本中病原載量低，如細胞內感染菌（如結核分枝桿菌）因釋放到體液中的菌量較少而導致檢測敏感性偏低，報告中反映為讀長較低[17]。
因此，臨床工作中，如果檢出真菌的讀長較少，需結合患者的臨床癥狀、實驗室常見檢測結果、影像學表現等綜合判斷。例如，患者免疫狀況較好，檢測出低讀長數耶氏肺孢子菌，影像學無磨玻璃影等特征性表現，G 試驗無不明原因升高，可暫不考慮 PCP 診斷。如檢出隱球菌低讀長數，應首選用隱球菌莢膜多糖抗原實驗去驗證，如為陽性即考慮為肺隱球菌病診斷成立，如為陰性，應結合其他手段，包括 BALF 或肺組織穿刺行顯微鏡檢與培養等。
3.3 mNGS 在肺部真菌感染診斷中優勢和劣勢
目前真菌檢測的手段相對較少，缺乏如聚合酶鏈反應、恒溫擴增等臨床可應用的單重或多重分子診斷方案，此時 mNGS 技術在診斷肺部真菌感染時就顯得尤為重要。例如毛霉目和曲霉屬，二者培養時間均較長，毛霉目有時培養較為困難，顯微鏡檢不易區別，但二者所致肺部感染在臨床處理措施上存在很大差異。針對這種情況，mNGS 體現出其獨特的優勢。
mNGS 和傳統病原學檢測技術各具優勢。mNGS 的優勢在于：① 48 h 內可獲得檢測結果，且檢測結果可精確到菌種。其較分離培養方法耗時短，較顯微鏡檢更準確。② 檢測的菌種范圍可覆蓋到罕見真菌菌種，如莢膜組織胞漿菌、球孢子菌屬等多見于美洲的地方性真菌。這些地方性真菌培養需要數日至數周，國內的大多數檢驗醫師對其認識有限，易造成誤診、漏診，延誤治療。而對于 mNGS 而言，只要解決真菌核酸提取困難的問題，同時確保數據庫有該類病原的基因，正確診斷并不困難。③ 對于混合感染或合并基礎疾病（如免疫力低下）的患者，mNGS 的檢出率較傳統方法明顯升高，可作為傳統檢測方法陰性的真菌性肺炎患者的補充檢測技術。目前，臨床常通過 mNGS 報告可疑致病真菌的核酸序列，實驗室再采用不同手段確認 mNGS 結果是否可靠。
但是，由于真菌細胞壁厚，破壁困難，核酸提取量少，如果 mNGS 檢測過程中不對標本進行特殊處理，其靈敏度并不優于傳統的分離培養或顯微鏡檢。且對于不同真菌，mNGS 的檢測價值并不一致。建議除非特殊情況，否則送檢 mNGS 時，應同時送檢傳統病原學檢測方法，多種手段聯合，結果互相驗證，再結合患者的病情、免疫狀況、影像學表現等，作出正確診斷。肺部真菌感染的檢測如果僅依靠 mNGS，將會給臨床診斷帶來很大困惑。如曲霉屬、毛霉目等病原體常見于周圍環境中或定植于正常人體的呼吸道，mNGS 檢測陽性并不意味著即為致病菌。國外文獻表明，近 40% 的非肺部真菌感染者的樣本中可檢測出曲霉屬核酸序列[10]。而對于耶氏肺孢子菌感染，傳統的病原學檢測手段只有顯微鏡檢，無法對其進行體外培養，此時 mNGS 便可為 PCP 的病原學診斷提供較大幫助。
4 結論與展望
總之，肺部真菌感染的臨床診斷，特別是病原學診斷存在很多挑戰。顯微鏡檢、分離培養、免疫學檢測以及核酸分子鑒定（如聚合酶鏈反應）等傳統手段能夠識別的真菌類別相對較窄，存在耗時、易漏檢等缺陷，給快速、準確診斷肺部真菌感染病原體帶來巨大挑戰，進而導致經驗性廣譜抗菌藥物的濫用。相比之下，mNGS 能直接從各種臨床標本中快速、準確、全面識別真菌，尤其在鑒定非典型真菌的類群方面明顯優于傳統培養方法。
mNGS 技術近年來發展迅速，但還存在一些亟待解決的問題：① mNGS 送檢樣本中檢出的大量人源序列，目前認為可能與機體免疫、炎癥狀態密切相關，還需對此進行詳細分析與研究；② mNGS 在檢測病原體耐藥基因、毒力基因等重要方面尚未成熟；③ 目前尚未出現高效快捷的厚壁病原體破壁方法及核酸提取技術，降低了 mNGS 對病原體的檢出率；④ mNGS 的檢測流程尚未標準化，不同廠家之間的檢測結果差異較大，給其報告解讀帶來很多困難。我們相信，隨著以上問題不斷深入探討和解決，mNGS 必將為肺部感染真菌的病原學診斷提供更有價值的信息。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
