引用本文： 吳澤剛, 顧劍, 鄭紅云, 徐萬洲, 肖紅軍, 童永清. 納米孔測序在血流感染中的應用. 華西醫學, 2022, 37(8): 1166-1169. doi: 10.7507/1002-0179.202206082 復制
血流感染是由內源性和/或外源性病原體侵入血液，導致的一種嚴重的全身感染性疾病，該疾病病程進展迅速，可導致機體多器官功能障礙，病死率達 20%～40%[1]。據估計，歐洲每年有 120 萬人次出現血流感染發作和長期后遺癥，血流感染代表了一個日益嚴重的公共衛生問題[2]，因此，對血流感染的致病病原體的快速準確診斷變得越來越重要[3-4]。血培養是目前診斷血流感染最直接和最重要的實驗室證據[5-6]，但因培養的陽性率不高，耗時長，且易受先前使用抗生素的影響，其局限性也日趨明顯[7]。納米孔測序是目前新興的病原微生物診斷技術，它不需要對樣本進行擴增，可以直接對樣本的 DNA、RNA 進行測序，具有快速、實時分析、便攜等優點[8]。本研究利用英國牛津納米孔（Oxford Nanopore Technologies，ONT）公司的 MinION 納米孔測序法和傳統的血培養法同時對武漢大學人民醫院疑似血流感染患者血標本的致病菌進行鑒定，評估納米孔測序法的基本性能和臨床應用價值，以期為臨床病原學的快速鑒定提供新思路。
1 資料與方法
1.1 研究對象
收集 2021 年 12 月－2022 年 5 月武漢大學人民醫院疑似血流感染的住院患者血標本，陽性標本的判定同時結合臨床資料。血流感染的定義參考美國疾病預防控制中心原發性血流感染的診斷標準[9]。入組標準（全部滿足）：患者血培養抽取時處于入院后 48 h 內，且 1 周內未使用抗菌藥物；患者年齡≥16 歲。排除標準：污染標本。本研究已通過武漢大學人民醫院倫理委員會倫理審查（審批號：WDRY2021-K041），受試者均知情同意。
1.2 主要儀器與試劑
主要試劑包括：長沙圣湘生物科技股份有限公司的核酸提取/純化試劑，上海典森生物科技有限公司的 Qubit dsDNA HS Assay Kit 定量試劑盒。主要儀器包括：美國 Life Technologies 公司的 Qubit 3.0 熒光定量儀，英國 ONT 公司的 MinION 測序儀，血培養采用美國 Becton, Dickinson and Company 公司的 BACTEC FX 型血培養儀。
1.3 檢測方法
采集患者血漿標本（乙二胺四乙酸抗凝）2～3 mL，采用基于細菌 16S 核糖體 RNA 和內源轉錄間隔區納米孔測序法對血樣本進行病原體鑒定。主要檢測步驟：血液預處理，低速分離血清，高速離心留沉淀，利用磁珠法進行核酸提取，隨后進行真菌擴增與產物純化，qubit 濃度測定，文庫構建，納米孔測序以及數據比對與分析。另外，患者采集 2 個不同部位靜脈血，每個部位采血 10～20 mL，分別注入需氧和厭氧血培養瓶進行培養。
1.4 統計學方法
數據整理和處理采用 Microsoft Excel 2019，統計學分析采用 SPSS 19.0 軟件。計數資料采用例數和/或百分比表示，兩種方法檢出率比較采用配對四格表資料的χ2 檢驗，兩種方法一致性的比較使用 kappa 檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 納米孔測序與血培養結果比較
本研究共納入 251 例患者，男性 132 例，女性 119 例，年齡 16～89 歲，平均年齡為（56±7）歲。經納米孔測序共有 119 例患者檢出病原體，檢出率為 47.4%，其中檢出細菌 105 例（41.8%），真菌 28 例（11.2%）。檢出 1 種細菌的有 87 例（34.7%），檢出 1 以上種細菌的有 18 例（7.2%）；檢出 1 種真菌的有 26 例（10.4%），檢出 1 種以上真菌的有 2 例（0.8%）。經血培養共有 23 例（9.2%）患者檢出病原體，其中細菌檢出 21 例（8.4%），真菌 2 例（0.8%），具體見表1。比較兩種方法的檢出率，納米孔測序的檢出率高于血培養（χ2=79.167，P<0.001）。納米孔測序與血培養結果的一致性比較見表2，kappa=0.052，P=0.175，表明納米孔測序與血培養結果不具有一致性。有 9 例血培養檢出細菌，1 例血培養檢出真菌，而納米孔測序均未檢出，因此納米孔測序法存在一定漏檢率。
表1
納米孔測序法與血培養法檢出細菌和真菌情況比較（例）
表2
納米孔測序法和血培養法檢測結果的一致性比較（例）
2.2 血流感染病原菌分布的特點
251 例患者血樣本中，納米孔測序檢出的細菌有 47 種，真菌 15 種，檢出率最高的細菌是大腸埃希菌 15 例（6.0%），檢出率最高的真菌是解脂耶氏酵母菌 10 例（4.0%），見表3；血培養檢出的細菌有 11 種，真菌 2 種，檢出率最高的細菌是大腸埃希菌 6 例（2.4%），見表4。
表3
納米孔測序法檢出的病原菌（n=251）
表4
血培養法檢出的病原菌（n=251）
3 討論
血流感染是一種嚴重的全身感染性疾病[10]，近年來，隨著創傷性治療技術的廣泛開展、免疫缺陷人群的出現及抗菌藥物的廣泛使用，血流感染的發病率逐年增高[11-12]。另外，致病菌種及抗菌藥物的耐藥性也發生顯著性變化，特別是多重耐藥菌株的出現，這些都為臨床診斷和治療帶來困難。目前細菌感染性疾病診斷的金標準仍是分離培養，但其靈敏度低且耗時長，通常需要 2～3 d 才能確定病原體[13]。另外，大部分病原微生物在醫院臨床實驗室條件下難以培養，60%的感染性病例致病病原體仍不清楚，不利于臨床快速診斷[14]。雖然目前出現了許多基于聚合酶鏈反應技術的分子生物學方法[15]，并且在臨床應用越來越廣泛，但這些方法單次檢測病原的種類有限。因此，最近 10 年來，不斷出現新的基于基因測序的分子生物方法，如宏基因組二代測序、宏基因組高通量測序、納米孔測序技等[8, 16-17]。基于納米孔的單分子測序具有長讀長的特點，同時不需要對樣本進行擴增，可以直接對樣本的 DNA、RNA 進行測序，從而克服了二代測序在文庫構建和擴增中可能引入的誤差。代表性的平臺包括英國 ONT 公司基于納米孔測序技術和美國 Pacific Biosciences 公司的單分子實時測序技術。由于納米孔測序的快速、實時分析、便攜等優點，很多研究證實了便攜式納米孔測序平臺在病原體檢測方面的應用優勢[8, 18]。
本研究中納米孔測序病原菌檢出率高于血培養，這表明納米孔測序在檢測血標本病原體上有更好的靈敏度。本研究的血培養陽性率低于上海李麗等[19]的報道，這可能與研究對象人群不一致以及地域差異有一定關系。本研究將納米孔測序與血培養結果的一致性進行了比較，結果不具有一致性。但是，本研究在對比兩種方法時發現，納米孔測序存在一定漏檢率，因此，該方法也存在一定局限性。另外，在檢出病原菌的種類上，納米孔測序法也優于血培養，這也說明納米孔測序法對病原體鑒定不受病原菌體外培養難的限制。本研究通過分析兩種檢測方法的數據發現，納米孔測序技術在血標本病原體鑒定方面優勢明顯，因此，納米孔測序技術可為臨床感染性疾病診治提供更準確和及時的參考依據。
綜上所述，目前的納米孔測序作為新一代測序的代表具有很多優點，但依然存在一些問題，例如：① 測序準確率尚不如二代測序，也存在較高的錯誤率[20]；② 對于同一物種的多個菌株難以區分，有時可能無法給出正確的病原體信息[13]。然而，已經有研究者對納米孔測序法進行了優化，優化后的方法增加了測序結果的準確度和靈敏度[21]。相信在不久的將來，納米孔測序能夠廣泛應用于臨床病原體的檢測，快速準確地為感染性疾病提供診治依據。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
血流感染是由內源性和/或外源性病原體侵入血液，導致的一種嚴重的全身感染性疾病，該疾病病程進展迅速，可導致機體多器官功能障礙，病死率達 20%～40%[1]。據估計，歐洲每年有 120 萬人次出現血流感染發作和長期后遺癥，血流感染代表了一個日益嚴重的公共衛生問題[2]，因此，對血流感染的致病病原體的快速準確診斷變得越來越重要[3-4]。血培養是目前診斷血流感染最直接和最重要的實驗室證據[5-6]，但因培養的陽性率不高，耗時長，且易受先前使用抗生素的影響，其局限性也日趨明顯[7]。納米孔測序是目前新興的病原微生物診斷技術，它不需要對樣本進行擴增，可以直接對樣本的 DNA、RNA 進行測序，具有快速、實時分析、便攜等優點[8]。本研究利用英國牛津納米孔（Oxford Nanopore Technologies，ONT）公司的 MinION 納米孔測序法和傳統的血培養法同時對武漢大學人民醫院疑似血流感染患者血標本的致病菌進行鑒定，評估納米孔測序法的基本性能和臨床應用價值，以期為臨床病原學的快速鑒定提供新思路。
1 資料與方法
1.1 研究對象
收集 2021 年 12 月－2022 年 5 月武漢大學人民醫院疑似血流感染的住院患者血標本，陽性標本的判定同時結合臨床資料。血流感染的定義參考美國疾病預防控制中心原發性血流感染的診斷標準[9]。入組標準（全部滿足）：患者血培養抽取時處于入院后 48 h 內，且 1 周內未使用抗菌藥物；患者年齡≥16 歲。排除標準：污染標本。本研究已通過武漢大學人民醫院倫理委員會倫理審查（審批號：WDRY2021-K041），受試者均知情同意。
1.2 主要儀器與試劑
主要試劑包括：長沙圣湘生物科技股份有限公司的核酸提取/純化試劑，上海典森生物科技有限公司的 Qubit dsDNA HS Assay Kit 定量試劑盒。主要儀器包括：美國 Life Technologies 公司的 Qubit 3.0 熒光定量儀，英國 ONT 公司的 MinION 測序儀，血培養采用美國 Becton, Dickinson and Company 公司的 BACTEC FX 型血培養儀。
1.3 檢測方法
采集患者血漿標本（乙二胺四乙酸抗凝）2～3 mL，采用基于細菌 16S 核糖體 RNA 和內源轉錄間隔區納米孔測序法對血樣本進行病原體鑒定。主要檢測步驟：血液預處理，低速分離血清，高速離心留沉淀，利用磁珠法進行核酸提取，隨后進行真菌擴增與產物純化，qubit 濃度測定，文庫構建，納米孔測序以及數據比對與分析。另外，患者采集 2 個不同部位靜脈血，每個部位采血 10～20 mL，分別注入需氧和厭氧血培養瓶進行培養。
1.4 統計學方法
數據整理和處理采用 Microsoft Excel 2019，統計學分析采用 SPSS 19.0 軟件。計數資料采用例數和/或百分比表示，兩種方法檢出率比較采用配對四格表資料的χ2 檢驗，兩種方法一致性的比較使用 kappa 檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 納米孔測序與血培養結果比較
本研究共納入 251 例患者，男性 132 例，女性 119 例，年齡 16～89 歲，平均年齡為（56±7）歲。經納米孔測序共有 119 例患者檢出病原體，檢出率為 47.4%，其中檢出細菌 105 例（41.8%），真菌 28 例（11.2%）。檢出 1 種細菌的有 87 例（34.7%），檢出 1 以上種細菌的有 18 例（7.2%）；檢出 1 種真菌的有 26 例（10.4%），檢出 1 種以上真菌的有 2 例（0.8%）。經血培養共有 23 例（9.2%）患者檢出病原體，其中細菌檢出 21 例（8.4%），真菌 2 例（0.8%），具體見表1。比較兩種方法的檢出率，納米孔測序的檢出率高于血培養（χ2=79.167，P<0.001）。納米孔測序與血培養結果的一致性比較見表2，kappa=0.052，P=0.175，表明納米孔測序與血培養結果不具有一致性。有 9 例血培養檢出細菌，1 例血培養檢出真菌，而納米孔測序均未檢出，因此納米孔測序法存在一定漏檢率。
表1
納米孔測序法與血培養法檢出細菌和真菌情況比較（例）
表2
納米孔測序法和血培養法檢測結果的一致性比較（例）
2.2 血流感染病原菌分布的特點
251 例患者血樣本中，納米孔測序檢出的細菌有 47 種，真菌 15 種，檢出率最高的細菌是大腸埃希菌 15 例（6.0%），檢出率最高的真菌是解脂耶氏酵母菌 10 例（4.0%），見表3；血培養檢出的細菌有 11 種，真菌 2 種，檢出率最高的細菌是大腸埃希菌 6 例（2.4%），見表4。
表3
納米孔測序法檢出的病原菌（n=251）
表4
血培養法檢出的病原菌（n=251）
3 討論
血流感染是一種嚴重的全身感染性疾病[10]，近年來，隨著創傷性治療技術的廣泛開展、免疫缺陷人群的出現及抗菌藥物的廣泛使用，血流感染的發病率逐年增高[11-12]。另外，致病菌種及抗菌藥物的耐藥性也發生顯著性變化，特別是多重耐藥菌株的出現，這些都為臨床診斷和治療帶來困難。目前細菌感染性疾病診斷的金標準仍是分離培養，但其靈敏度低且耗時長，通常需要 2～3 d 才能確定病原體[13]。另外，大部分病原微生物在醫院臨床實驗室條件下難以培養，60%的感染性病例致病病原體仍不清楚，不利于臨床快速診斷[14]。雖然目前出現了許多基于聚合酶鏈反應技術的分子生物學方法[15]，并且在臨床應用越來越廣泛，但這些方法單次檢測病原的種類有限。因此，最近 10 年來，不斷出現新的基于基因測序的分子生物方法，如宏基因組二代測序、宏基因組高通量測序、納米孔測序技等[8, 16-17]。基于納米孔的單分子測序具有長讀長的特點，同時不需要對樣本進行擴增，可以直接對樣本的 DNA、RNA 進行測序，從而克服了二代測序在文庫構建和擴增中可能引入的誤差。代表性的平臺包括英國 ONT 公司基于納米孔測序技術和美國 Pacific Biosciences 公司的單分子實時測序技術。由于納米孔測序的快速、實時分析、便攜等優點，很多研究證實了便攜式納米孔測序平臺在病原體檢測方面的應用優勢[8, 18]。
本研究中納米孔測序病原菌檢出率高于血培養，這表明納米孔測序在檢測血標本病原體上有更好的靈敏度。本研究的血培養陽性率低于上海李麗等[19]的報道，這可能與研究對象人群不一致以及地域差異有一定關系。本研究將納米孔測序與血培養結果的一致性進行了比較，結果不具有一致性。但是，本研究在對比兩種方法時發現，納米孔測序存在一定漏檢率，因此，該方法也存在一定局限性。另外，在檢出病原菌的種類上，納米孔測序法也優于血培養，這也說明納米孔測序法對病原體鑒定不受病原菌體外培養難的限制。本研究通過分析兩種檢測方法的數據發現，納米孔測序技術在血標本病原體鑒定方面優勢明顯，因此，納米孔測序技術可為臨床感染性疾病診治提供更準確和及時的參考依據。
綜上所述，目前的納米孔測序作為新一代測序的代表具有很多優點，但依然存在一些問題，例如：① 測序準確率尚不如二代測序，也存在較高的錯誤率[20]；② 對于同一物種的多個菌株難以區分，有時可能無法給出正確的病原體信息[13]。然而，已經有研究者對納米孔測序法進行了優化，優化后的方法增加了測序結果的準確度和靈敏度[21]。相信在不久的將來，納米孔測序能夠廣泛應用于臨床病原體的檢測，快速準確地為感染性疾病提供診治依據。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
