引用本文： 鄧嬌文, 李永麗, 劉倩, 李志遠, 卞鐵榮, 何光鳳, 袁凱鋒, 林凡莉, 邢宏運. 宏基因組二代測序用于惡性血液病嚴重感染診療的應用體會. 華西醫學, 2022, 37(8): 1161-1165. doi: 10.7507/1002-0179.202205091 復制
惡性血液病包括白血病、淋巴瘤等血液腫瘤。由于大量細胞惡性增殖，并浸潤其他組織和器官，影響正常造血[1]。血液病患者伴隨免疫受損，隨之而來的感染是患者死亡的主要原因之一，嚴重影響患者的生存質量和生存率[1]。血液病患者一般病情危重，尤其接受化療的患者，感染風險極高，一旦感染常表現為危及生命的嚴重感染。傳統的病原菌檢測方法主要基于微生物培養和分離鑒定，相對來說目標較單一、假陰性率高、效率低、許多細菌不易通過實驗室培養獲得。若未能及時識別病原體可能會延遲抗菌藥物的精確治療，不必要的廣譜抗菌藥物使用，誘導產生耐藥性及高昂的醫療費用[2]。在第一時間給予對因治療對病情控制極為重要，感染的有效控制能明顯提高患者的生存率。
宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）直接針對標本中核酸無偏倚檢測病原微生物序列，對血液病患者的嚴重復雜性感染進行分析可以為臨床診療提供有力證據并指導用藥。mNGS 能快速明確病原學診斷，同時還可檢測耐藥基因，因此更能凸顯其在臨床應用上的價值。mNGS 不依賴于培養和提取所有 DNA，可用于所有病原體的鑒定和分型，并且能在短時間內完成上百億堿基的測序，能更高效、更快速、更準確的獲得樣本中的全部微生物信息，會大大提高診療效率，為患者爭取治療時機[3]。本研究通過比對西南醫科大學附屬醫院血液內科惡性血液病患者檢測的樣本 mNGS 檢測結果、傳統病原學檢測結果，結合臨床資料，來探討 mNGS 對血液病嚴重復雜性感染診療的作用。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
收集 2020 年 6 月—2022 年 2 月西南醫科大學附屬醫院血液內科的惡性血液病住院患者的外送檢測樣本的 mNGS 檢測結果、傳統病原學檢測結果及一般臨床資料。納入標準（全部滿足）：① 患者年齡在 14 周歲以上；② 既往經完善相關檢查符合國際診斷標準，明確診斷為惡性血液病的患者；③ 住院期間出現發熱，臨床診斷為不明病原微生物重度感染患者，通過常規方式檢測病原菌（如血培養等），并經驗性抗感染治療后療效欠佳，外送相應標本行 mNGS 檢測。排除標準（所有患者均需排除以下條件）：① 非感染性發熱患者；② 合并嚴重心、肝、腎等損害；③ 妊娠、哺乳期的女性。本研究已取得西南醫科大學附屬醫院臨床試驗倫理委員會審批。
1.2 研究方法
所有患者均在病程中有發熱，且經經驗性抗感染治療效果不佳，外送基因檢測公司的標本行 mNGS 之前根據患者自身情況已完善血培養、痰培養或尿培養等傳統檢測方法擬檢出病原菌。
基因檢測公司所采取的測序方法是基于宏基因組學的二代測序技術，通過對臨床樣本的 DNA 或 RNA 進行高通量測序，可檢測出包括基因組序列已知的 12 895 種細菌、11 120 種病毒、1 582 種真菌、312 種寄生蟲、分枝桿菌復合群中的 177 種常見致病菌和 184 種支原體/衣原體。所有患者外送檢測的 mNGS 回示結果已經排除了實驗室污染后檢測出的所有微生物，其中可能包括：樣本采集過程中或分裝過程中受到污染的環境微生物或其核酸，樣本采集容器本身帶有的環境微生物或其核酸，樣本采集過程中受到污染的患者身上的人體共生微生物，樣本采集過程中受到污染的采集或分裝人員身上的人體共生微生物，定植于患者特定身體部位的微生物。痰液等開放部位的標本存在大量條件致病菌的定植與共生，故已予以去除痰液標本。
1.3 觀察指標
收集患者的 mNGS 檢測結果、傳統病原學檢測結果、臨床資料以及根據檢測結果進行抗感染治療方案調整后的臨床轉歸。觀察指標包括血常規、血生化、降鈣素原、細胞因子檢測結果［包括白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-a、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）］、胸部 CT、超聲及患者的病程、臨床轉歸、檢出率等。根據 mNGS 是否檢出陽性分為檢出組（mNGS 陽性）和未檢出組（mNGS 陰性）。在血液病患者中，還需嚴密監測粒細胞情況：一般來說，若出現粒細胞減少（<1.5×109/L）[4]，臨床醫生需積極干預并及時予以相應藥物以升高粒細胞來減少感染相關風險；若此時已經出現粒細胞缺乏癥，同時合并感染、發熱，有盡早使用碳青霉烯類抗菌藥物指征。以分離鑒定出的病原菌作為感染性疾病診斷的金標準，然后計算 mNGS 和傳統檢測方法對應的靈敏度和特異度。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 17.0 軟件進行分析。計量資料不符合正態分布，以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較采用 Mann-Whitney 秩和檢驗。計數資料采用例數表示，兩種方法檢查結果的比較采用 McNemar 檢驗（二分類資料）或 Wilcoxon 符號秩檢驗（等級資料）。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般資料
共納入患者 21 例。其中，男 14 例，女 7 例；年齡 16～76 歲，中位年齡 51（36，59）歲；送檢標本包括外周血標本 18 例，胸水標本 2 例，肺泡灌洗液標本 1 例；非霍奇金淋巴瘤 6 例、霍奇金淋巴瘤 1 例、慢性粒細胞白血病 1 例、多毛細胞白血病 1 例、急性髓系白血病 5 例、急性 T 淋巴細胞白血病 1 例、多發性骨髓瘤 2 例、嗜酸性粒細胞增多癥 1 例、骨髓增生異常綜合征 3 例。標本送檢前 21 例患者均有不同程度的發熱、血常規及感染指標異常、嚴重感染、胸部 CT 影像學改變。
2.2 兩種檢測方法的病原菌檢出結果及治療轉歸
在 21 例患者中，通過 mNGS，17 例直接檢出病原菌，4 例未檢出。mNGS 檢出病原菌的 17 例中，真菌 8 例、細菌 9 例、病毒 10 例，其中 9 例為混合感染；檢出細菌 11 種、真菌 4 種、病毒 12 種；4 例檢測陰性，其中 1 例與臨床檢測不相符。通過傳統檢測方法檢出病原菌 7 例，14 例未檢出，檢出細菌 5 種、真菌 2 種、病毒 4 種。mNGS 檢出病原菌陽性率為 81.0%（17/21），傳統檢測方法檢出病原菌陽性率為 33.3%（7/21），二者比較差異有統計學意義（P=0.002）。mNGS 陽性的17 例患者按檢測結果調整治療方案后感染控制得到不同程度好轉。
2.3 兩種檢測方法的病原體檢出種類比較
在 21 例患者中，17 例 mNGS 檢測結果為陽性，其中 8 例（47%）檢測到 1 種病原體，8 例（47.1%）檢測到 2 種病原體，1 例（5.9%）檢測到 3 種以上病原體；7 例傳統檢測方法結果為陽性，其中 6 例（85.7%）檢測到 1 種病原體，1 例（14.3%）檢測到 2 種及以上病原體。以分離鑒定出病原菌作為感染疾病診斷的金標準，mNGS 檢出病原菌的靈敏度為 85.7%、特異度為 75.0%，而傳統檢測方法檢出的靈敏度為 30.0%、特異度為 50.0%。由表1 可見，mNGS 檢出病原體檢出種類均高于傳統檢測方法（P<0.05）。
表1
兩種檢測方法病原體檢出種類比較（例）
2.4 兩種檢測方法的病原菌檢出情況
兩種檢測方法的病原菌檢出情況見表2。在通過兩種方式共分離得到 31 種微生物中，以肺炎克雷伯菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、人類皰疹病毒 4 型、人類皰疹病毒 5 型及屎腸球菌等較為多見。mNGS 檢測病原菌種類達 25 種，傳統檢測方法檢測病原菌種類達 11 種，mNGS 檢出病原菌種類多于傳統檢測方法。
表2
兩種檢測方法的病原菌檢出情況（例）
2.5 mNGS 未檢出組和檢出組炎癥相關指標比較
由表3 可見，mNGS 未檢出組和檢出組患者中性粒細胞計數、降鈣素原及細胞因子比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
表3
mNGS 未檢出組和檢出組患者炎癥相關指標及細胞因子的比較［M（QL，QU）］
2.6 兩種檢測方法檢出的粒細胞減少情況
由4 可見，mNGS 檢出粒細胞減少情況高于傳統檢測方法（P<0.05）。
表4
兩種檢測方法粒細胞減少情況比較（例）
3 討論
本研究分析了傳統病原菌檢測及 mNGS 兩種方法，得出 mNGS 檢出病原菌陽性率、靈敏度、病原菌檢出種類、檢出率都高于傳統檢測方法。雖然 mNGS 檢測費用高于細菌培養，但 mNGS 檢出率更高且能更早的明確病原菌，更有利于血液病患者早期接受對因的抗感染治療，從而提高其生存率。本研究中的 17 例患者按 mNGS 檢測結果調整治療方案后感染控制得到不同程度好轉。4 例患者 mNGS 檢測陰性，其中 1 例與臨床檢測不相符，考慮可能是檢測的樣本量不足、操作過程中交叉污染或使用抗菌藥物治療降低樣本中致病菌的序列數，從而導致陰性結果。另外，本文所含例數偏少，后續研究可以進一步擴大樣本量，以提高研究的可信度。
血液病患者由于疾病本身特點，及在治療中需大量反復使用激素、免疫抑制劑、廣譜抗菌藥物、化療藥物等因素，感染是導致治療失敗和死亡的主要原因。且其感染一般較重，感染因素復雜，常規經驗性抗感染治療難以有效控制病情。感染部位主要是血流感染，其發生率高達 10%～20%，總體病死率也較高[5-7]。血培養是血流感染病原學診斷的金標準，而大約 50%的病例血培養結果為陰性，而導致診治延誤[8]。近年，基于血液病本身特點，侵襲性真菌感染發生率有升高趨勢[9]。侵襲性真菌感染在急性白血病患者中達 8%～30%[10]，其中，肺部真菌感染所占比例最高[11]。加上傳統檢測方法真菌檢出率低下特點，對患者的診療不利。
本研究 21 例患者的 mNGS 檢出病原菌陽性率（81.0% vs. 33.3%）、靈敏度（ 85.7% vs.30.0% ）均高于傳統檢測方法；mNGS 檢測病原菌種類（25 種）也高于傳統檢測方法（11 種），這可能是由于微生物種類繁多，部分致病菌生長所需條件苛刻，傳統培養技術的限制等因素的影響，導致細菌培養陽性率不高。 mNGS 對 ICU 中血流感染患者進行病原學診斷，結果顯示其對比血培養能顯著提高診斷的敏感性[12]。血液病患者感染的致病因素復雜，病情多變，高效、全面、準確地查明病原體，是醫生及時有效的采取針對性抗感染治療的前提。常規 GM 試驗和 D-葡聚糖檢測均不能精準診斷，且培養陽性率極低，導致診療效果不佳。 mNGS 克服了多數病原體不能培養的弊端，能夠精確高效地獲得全部病原體遺傳物質信息，對疑難感染性疾病的診療具有重要參考價值。在 Duan 等[13]的研究中，mNGS 的靈敏度顯著高于傳統培養方法（67.4% vs. 23.6%，P<0.001），其特異度與傳統培養無差異（68.8% vs. 81.3%，P=0.41）。另一項針對于不同標本來源的橫向對比研究顯示，mNGS 的總體臨床檢測靈敏度和特異度分別為 50.7%和 85.7%，而傳統方法的診斷靈敏度和特異度分別為 35.2%和 89.1%，mNGS 在結核桿菌、厭氧菌和真菌方面的檢測尤其突出，mNGS 可有效回避細菌培養結果相似而難區分的問題[14]。
由于 mNGS 的無偏倚性，理論上樣本中所有微生物的核酸都可檢測，具有常規靶向病原學檢測如微生物培養、抗體/抗原檢測、聚合酶鏈反應所不具備的廣覆蓋優點。但有這些優點，在樣本采集、運輸及實驗等過程中引入的外源微生物或其核酸的污染會對 mNGS 的報告和解讀造成干擾，即使采用規范化的全流程無菌操作，外源微生物的核酸污染仍存在。這可能也是 mNGS 較傳統方法更易出現假陽性的原因之一。總體來說，無核酸的實驗過程難以實現，外源微生物污染無法完全避免，但可通過如在實驗中添加純水或磷酸鹽緩沖溶液作為陰性對照樣本，與臨床樣本同步進行核酸提取、建庫、測序和分析，從而識別試劑工程背景微生物，最大程度的對實驗環節中的背景微生物進行過濾[15-17]。本研究的 mNGS 結果判讀時已將可能的外源性微生物污染或常見的定植菌及條件致病菌排除在外。此外，人體開放部位的標本如痰液、口咽拭子等往往存在大量條件致病微生物的定植與共生，故本研究將涉及開放部位的痰液標本的 mNGS 予以去除，以減少假陽性結果對結果判讀的影響。另外，本研究病毒檢出的數量較多，是否為假陽性或真陽性結果，需結合患者臨床癥狀、體征、影像學表現及實驗室傳統病原菌培養等行進一步判讀。
綜上所述，與傳統細菌培養相比，mNGS 不僅能提高血液病患者的病原菌檢出率，檢出與細菌培養一致的病原菌，且可檢出多種其他潛在的病原菌，檢測耗時短，更有利于復雜嚴重感染早期診斷和治療，具有更高的應用價值。因此，mNGS 在臨床醫療中發揮著越來越重要的作用[18]。隨著測序技術的深入發展，mNGS 在臨床微生物學的多個領域得到應用。但目前的 mNGS 技術還面臨一系列問題及挑戰，包括降低測序成本、mNGS 污染、用于分析的數據庫及根據測序數據預測藥物敏感程度等問題，但 mNGS 常規數據量對耐藥和毒力基因檢測有局限性，如需耐藥和致病信息需提高測序數據量[19]。若某一微生物檢出的讀長數量多，為致病微生物的可能性大。但不同病原微生物基因組大小有差異，致病力也相去甚遠，因此不能僅依靠讀長多少來判斷是否感染，實際應用時應考慮病原體種類差異與致病特性。mNGS 結果不能作為臨床決策的唯一依據，結果陰性也需結合臨床核對甄別、排除感染[19]。mNGS 技術檢測的是核酸，不能簡單將核酸等同于病原微生物。不同的核酸試劑盒對不同病原體的提取效能不同，因此須對選取的病原體核酸提取試劑盒進行驗證，避免病原體的漏檢[19]。隨著技術不斷成熟與經驗積累，mNGS 將廣泛應用于臨床實踐中，幫助指導臨床診療，提高患者生存率。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
惡性血液病包括白血病、淋巴瘤等血液腫瘤。由于大量細胞惡性增殖，并浸潤其他組織和器官，影響正常造血[1]。血液病患者伴隨免疫受損，隨之而來的感染是患者死亡的主要原因之一，嚴重影響患者的生存質量和生存率[1]。血液病患者一般病情危重，尤其接受化療的患者，感染風險極高，一旦感染常表現為危及生命的嚴重感染。傳統的病原菌檢測方法主要基于微生物培養和分離鑒定，相對來說目標較單一、假陰性率高、效率低、許多細菌不易通過實驗室培養獲得。若未能及時識別病原體可能會延遲抗菌藥物的精確治療，不必要的廣譜抗菌藥物使用，誘導產生耐藥性及高昂的醫療費用[2]。在第一時間給予對因治療對病情控制極為重要，感染的有效控制能明顯提高患者的生存率。
宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）直接針對標本中核酸無偏倚檢測病原微生物序列，對血液病患者的嚴重復雜性感染進行分析可以為臨床診療提供有力證據并指導用藥。mNGS 能快速明確病原學診斷，同時還可檢測耐藥基因，因此更能凸顯其在臨床應用上的價值。mNGS 不依賴于培養和提取所有 DNA，可用于所有病原體的鑒定和分型，并且能在短時間內完成上百億堿基的測序，能更高效、更快速、更準確的獲得樣本中的全部微生物信息，會大大提高診療效率，為患者爭取治療時機[3]。本研究通過比對西南醫科大學附屬醫院血液內科惡性血液病患者檢測的樣本 mNGS 檢測結果、傳統病原學檢測結果，結合臨床資料，來探討 mNGS 對血液病嚴重復雜性感染診療的作用。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
收集 2020 年 6 月—2022 年 2 月西南醫科大學附屬醫院血液內科的惡性血液病住院患者的外送檢測樣本的 mNGS 檢測結果、傳統病原學檢測結果及一般臨床資料。納入標準（全部滿足）：① 患者年齡在 14 周歲以上；② 既往經完善相關檢查符合國際診斷標準，明確診斷為惡性血液病的患者；③ 住院期間出現發熱，臨床診斷為不明病原微生物重度感染患者，通過常規方式檢測病原菌（如血培養等），并經驗性抗感染治療后療效欠佳，外送相應標本行 mNGS 檢測。排除標準（所有患者均需排除以下條件）：① 非感染性發熱患者；② 合并嚴重心、肝、腎等損害；③ 妊娠、哺乳期的女性。本研究已取得西南醫科大學附屬醫院臨床試驗倫理委員會審批。
1.2 研究方法
所有患者均在病程中有發熱，且經經驗性抗感染治療效果不佳，外送基因檢測公司的標本行 mNGS 之前根據患者自身情況已完善血培養、痰培養或尿培養等傳統檢測方法擬檢出病原菌。
基因檢測公司所采取的測序方法是基于宏基因組學的二代測序技術，通過對臨床樣本的 DNA 或 RNA 進行高通量測序，可檢測出包括基因組序列已知的 12 895 種細菌、11 120 種病毒、1 582 種真菌、312 種寄生蟲、分枝桿菌復合群中的 177 種常見致病菌和 184 種支原體/衣原體。所有患者外送檢測的 mNGS 回示結果已經排除了實驗室污染后檢測出的所有微生物，其中可能包括：樣本采集過程中或分裝過程中受到污染的環境微生物或其核酸，樣本采集容器本身帶有的環境微生物或其核酸，樣本采集過程中受到污染的患者身上的人體共生微生物，樣本采集過程中受到污染的采集或分裝人員身上的人體共生微生物，定植于患者特定身體部位的微生物。痰液等開放部位的標本存在大量條件致病菌的定植與共生，故已予以去除痰液標本。
1.3 觀察指標
收集患者的 mNGS 檢測結果、傳統病原學檢測結果、臨床資料以及根據檢測結果進行抗感染治療方案調整后的臨床轉歸。觀察指標包括血常規、血生化、降鈣素原、細胞因子檢測結果［包括白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-a、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）］、胸部 CT、超聲及患者的病程、臨床轉歸、檢出率等。根據 mNGS 是否檢出陽性分為檢出組（mNGS 陽性）和未檢出組（mNGS 陰性）。在血液病患者中，還需嚴密監測粒細胞情況：一般來說，若出現粒細胞減少（<1.5×109/L）[4]，臨床醫生需積極干預并及時予以相應藥物以升高粒細胞來減少感染相關風險；若此時已經出現粒細胞缺乏癥，同時合并感染、發熱，有盡早使用碳青霉烯類抗菌藥物指征。以分離鑒定出的病原菌作為感染性疾病診斷的金標準，然后計算 mNGS 和傳統檢測方法對應的靈敏度和特異度。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 17.0 軟件進行分析。計量資料不符合正態分布，以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較采用 Mann-Whitney 秩和檢驗。計數資料采用例數表示，兩種方法檢查結果的比較采用 McNemar 檢驗（二分類資料）或 Wilcoxon 符號秩檢驗（等級資料）。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般資料
共納入患者 21 例。其中，男 14 例，女 7 例；年齡 16～76 歲，中位年齡 51（36，59）歲；送檢標本包括外周血標本 18 例，胸水標本 2 例，肺泡灌洗液標本 1 例；非霍奇金淋巴瘤 6 例、霍奇金淋巴瘤 1 例、慢性粒細胞白血病 1 例、多毛細胞白血病 1 例、急性髓系白血病 5 例、急性 T 淋巴細胞白血病 1 例、多發性骨髓瘤 2 例、嗜酸性粒細胞增多癥 1 例、骨髓增生異常綜合征 3 例。標本送檢前 21 例患者均有不同程度的發熱、血常規及感染指標異常、嚴重感染、胸部 CT 影像學改變。
2.2 兩種檢測方法的病原菌檢出結果及治療轉歸
在 21 例患者中，通過 mNGS，17 例直接檢出病原菌，4 例未檢出。mNGS 檢出病原菌的 17 例中，真菌 8 例、細菌 9 例、病毒 10 例，其中 9 例為混合感染；檢出細菌 11 種、真菌 4 種、病毒 12 種；4 例檢測陰性，其中 1 例與臨床檢測不相符。通過傳統檢測方法檢出病原菌 7 例，14 例未檢出，檢出細菌 5 種、真菌 2 種、病毒 4 種。mNGS 檢出病原菌陽性率為 81.0%（17/21），傳統檢測方法檢出病原菌陽性率為 33.3%（7/21），二者比較差異有統計學意義（P=0.002）。mNGS 陽性的17 例患者按檢測結果調整治療方案后感染控制得到不同程度好轉。
2.3 兩種檢測方法的病原體檢出種類比較
在 21 例患者中，17 例 mNGS 檢測結果為陽性，其中 8 例（47%）檢測到 1 種病原體，8 例（47.1%）檢測到 2 種病原體，1 例（5.9%）檢測到 3 種以上病原體；7 例傳統檢測方法結果為陽性，其中 6 例（85.7%）檢測到 1 種病原體，1 例（14.3%）檢測到 2 種及以上病原體。以分離鑒定出病原菌作為感染疾病診斷的金標準，mNGS 檢出病原菌的靈敏度為 85.7%、特異度為 75.0%，而傳統檢測方法檢出的靈敏度為 30.0%、特異度為 50.0%。由表1 可見，mNGS 檢出病原體檢出種類均高于傳統檢測方法（P<0.05）。
表1
兩種檢測方法病原體檢出種類比較（例）
2.4 兩種檢測方法的病原菌檢出情況
兩種檢測方法的病原菌檢出情況見表2。在通過兩種方式共分離得到 31 種微生物中，以肺炎克雷伯菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、人類皰疹病毒 4 型、人類皰疹病毒 5 型及屎腸球菌等較為多見。mNGS 檢測病原菌種類達 25 種，傳統檢測方法檢測病原菌種類達 11 種，mNGS 檢出病原菌種類多于傳統檢測方法。
表2
兩種檢測方法的病原菌檢出情況（例）
2.5 mNGS 未檢出組和檢出組炎癥相關指標比較
由表3 可見，mNGS 未檢出組和檢出組患者中性粒細胞計數、降鈣素原及細胞因子比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
表3
mNGS 未檢出組和檢出組患者炎癥相關指標及細胞因子的比較［M（QL，QU）］
2.6 兩種檢測方法檢出的粒細胞減少情況
由4 可見，mNGS 檢出粒細胞減少情況高于傳統檢測方法（P<0.05）。
表4
兩種檢測方法粒細胞減少情況比較（例）
3 討論
本研究分析了傳統病原菌檢測及 mNGS 兩種方法，得出 mNGS 檢出病原菌陽性率、靈敏度、病原菌檢出種類、檢出率都高于傳統檢測方法。雖然 mNGS 檢測費用高于細菌培養，但 mNGS 檢出率更高且能更早的明確病原菌，更有利于血液病患者早期接受對因的抗感染治療，從而提高其生存率。本研究中的 17 例患者按 mNGS 檢測結果調整治療方案后感染控制得到不同程度好轉。4 例患者 mNGS 檢測陰性，其中 1 例與臨床檢測不相符，考慮可能是檢測的樣本量不足、操作過程中交叉污染或使用抗菌藥物治療降低樣本中致病菌的序列數，從而導致陰性結果。另外，本文所含例數偏少，后續研究可以進一步擴大樣本量，以提高研究的可信度。
血液病患者由于疾病本身特點，及在治療中需大量反復使用激素、免疫抑制劑、廣譜抗菌藥物、化療藥物等因素，感染是導致治療失敗和死亡的主要原因。且其感染一般較重，感染因素復雜，常規經驗性抗感染治療難以有效控制病情。感染部位主要是血流感染，其發生率高達 10%～20%，總體病死率也較高[5-7]。血培養是血流感染病原學診斷的金標準，而大約 50%的病例血培養結果為陰性，而導致診治延誤[8]。近年，基于血液病本身特點，侵襲性真菌感染發生率有升高趨勢[9]。侵襲性真菌感染在急性白血病患者中達 8%～30%[10]，其中，肺部真菌感染所占比例最高[11]。加上傳統檢測方法真菌檢出率低下特點，對患者的診療不利。
本研究 21 例患者的 mNGS 檢出病原菌陽性率（81.0% vs. 33.3%）、靈敏度（ 85.7% vs.30.0% ）均高于傳統檢測方法；mNGS 檢測病原菌種類（25 種）也高于傳統檢測方法（11 種），這可能是由于微生物種類繁多，部分致病菌生長所需條件苛刻，傳統培養技術的限制等因素的影響，導致細菌培養陽性率不高。 mNGS 對 ICU 中血流感染患者進行病原學診斷，結果顯示其對比血培養能顯著提高診斷的敏感性[12]。血液病患者感染的致病因素復雜，病情多變，高效、全面、準確地查明病原體，是醫生及時有效的采取針對性抗感染治療的前提。常規 GM 試驗和 D-葡聚糖檢測均不能精準診斷，且培養陽性率極低，導致診療效果不佳。 mNGS 克服了多數病原體不能培養的弊端，能夠精確高效地獲得全部病原體遺傳物質信息，對疑難感染性疾病的診療具有重要參考價值。在 Duan 等[13]的研究中，mNGS 的靈敏度顯著高于傳統培養方法（67.4% vs. 23.6%，P<0.001），其特異度與傳統培養無差異（68.8% vs. 81.3%，P=0.41）。另一項針對于不同標本來源的橫向對比研究顯示，mNGS 的總體臨床檢測靈敏度和特異度分別為 50.7%和 85.7%，而傳統方法的診斷靈敏度和特異度分別為 35.2%和 89.1%，mNGS 在結核桿菌、厭氧菌和真菌方面的檢測尤其突出，mNGS 可有效回避細菌培養結果相似而難區分的問題[14]。
由于 mNGS 的無偏倚性，理論上樣本中所有微生物的核酸都可檢測，具有常規靶向病原學檢測如微生物培養、抗體/抗原檢測、聚合酶鏈反應所不具備的廣覆蓋優點。但有這些優點，在樣本采集、運輸及實驗等過程中引入的外源微生物或其核酸的污染會對 mNGS 的報告和解讀造成干擾，即使采用規范化的全流程無菌操作，外源微生物的核酸污染仍存在。這可能也是 mNGS 較傳統方法更易出現假陽性的原因之一。總體來說，無核酸的實驗過程難以實現，外源微生物污染無法完全避免，但可通過如在實驗中添加純水或磷酸鹽緩沖溶液作為陰性對照樣本，與臨床樣本同步進行核酸提取、建庫、測序和分析，從而識別試劑工程背景微生物，最大程度的對實驗環節中的背景微生物進行過濾[15-17]。本研究的 mNGS 結果判讀時已將可能的外源性微生物污染或常見的定植菌及條件致病菌排除在外。此外，人體開放部位的標本如痰液、口咽拭子等往往存在大量條件致病微生物的定植與共生，故本研究將涉及開放部位的痰液標本的 mNGS 予以去除，以減少假陽性結果對結果判讀的影響。另外，本研究病毒檢出的數量較多，是否為假陽性或真陽性結果，需結合患者臨床癥狀、體征、影像學表現及實驗室傳統病原菌培養等行進一步判讀。
綜上所述，與傳統細菌培養相比，mNGS 不僅能提高血液病患者的病原菌檢出率，檢出與細菌培養一致的病原菌，且可檢出多種其他潛在的病原菌，檢測耗時短，更有利于復雜嚴重感染早期診斷和治療，具有更高的應用價值。因此，mNGS 在臨床醫療中發揮著越來越重要的作用[18]。隨著測序技術的深入發展，mNGS 在臨床微生物學的多個領域得到應用。但目前的 mNGS 技術還面臨一系列問題及挑戰，包括降低測序成本、mNGS 污染、用于分析的數據庫及根據測序數據預測藥物敏感程度等問題，但 mNGS 常規數據量對耐藥和毒力基因檢測有局限性，如需耐藥和致病信息需提高測序數據量[19]。若某一微生物檢出的讀長數量多，為致病微生物的可能性大。但不同病原微生物基因組大小有差異，致病力也相去甚遠，因此不能僅依靠讀長多少來判斷是否感染，實際應用時應考慮病原體種類差異與致病特性。mNGS 結果不能作為臨床決策的唯一依據，結果陰性也需結合臨床核對甄別、排除感染[19]。mNGS 技術檢測的是核酸，不能簡單將核酸等同于病原微生物。不同的核酸試劑盒對不同病原體的提取效能不同，因此須對選取的病原體核酸提取試劑盒進行驗證，避免病原體的漏檢[19]。隨著技術不斷成熟與經驗積累，mNGS 將廣泛應用于臨床實踐中，幫助指導臨床診療，提高患者生存率。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
