引用本文： 常思思, 高付彥, 朱亞輝, 盧娟娟, 閆俊濤, 馬純政, 李洪霖. 基于生物信息學分析 CCNB1 在肺腺癌組織中的表達及其與預后的關系. 華西醫學, 2023, 38(3): 444-453. doi: 10.7507/1002-0179.202205082 復制
肺癌是最常見的癌癥之一，也是癌癥相關死亡的主要原因[1]，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌 2 種亞型，分別占全部病例的 15% 和 85%[2]。肺腺癌是非小細胞肺癌最常見的組織學類型，見于 40% 以上的患者[3-4]；且肺腺癌的發病率穩步上升[5]。近年來，化療、靶向治療等綜合治療為改善肺腺癌患者預后帶來了更多可能[4]。常規化療對大多數病例有效，但其副作用嚴重，可嚴重影響患者生活質量。此外，分子靶向治療藥物療效有限，新的靶向藥物往往因為耐藥性的發展而失敗[6]。晚期患者和不能使用靶向藥物的患者生存率顯著降低。目前，晚期非小細胞肺癌的治療以程序性死亡因子 1 或程序性死亡因子配體-1 抗體的免疫治療為主，可單獨使用，也可與化療聯合使用[7]，但緩解率很低。并且，目前尚無有效的生物標志物來預測肺腺癌的不良預后和治療效果。細胞周期蛋白 B1（cyclin B1, CCNB1）是一種參與有絲分裂的調節蛋白，與 p34（cdc2）復合物形成成熟促進因子，對于適當控制細胞周期的 G2/M（有絲分裂）過渡期是必要的。有研究表明，CCNB1 在肝細胞癌、胰腺癌中高表達[8-9]。因此，本研究基于各類數據庫，分析了 CCNB1 在肺腺癌中的表達情況，并進一步評估了 CCNB1 表達對肺腺癌預后的影響。
1 資料與方法
1.1 篩選差異目標基因
使用 Oncomine 數據庫，分別選擇：① 分析類型：癌癥 vs. 正常分析；② 癌癥類型：肺腺癌；③ 樣品類型：組織標本；④ 數據類型：mRNA；⑤ 設定條件：過度表達；⑥ 臨界值 P<0.05，差異倍數（fold change）>2。
1.2 CCNB1 表達差異情況分析
使用人類蛋白質表達圖譜（Human Protein Atlas, HPA）數據庫分析 CCNB1 在人類肺正常組織和癌組織中的 mRNA 水平和蛋白質水平差異，以及在常見的各種癌癥細胞系中的基因表達水平。通過基因表達譜交互分析工具 GEPPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）分析來自癌癥基因組圖譜數據庫（The Cancer Genome Atlas, TCGA）聯合基因型-組織表達數據庫（Genotype-Tissue Expression, GTEx）中正常組織和肺腺癌的表達情況，同時比較 TCGA 隊列中肺腺癌和匹配的正常肺組織中 CCNB1 的表達水平。從 HPA 數據庫中下載具有不同蛋白質表達水平的肺腺癌組織代表性的免疫組織化學圖像進行分析。
1.3 免疫浸潤分析
根據文獻報道的免疫細胞的基因標志物，即樹突狀細胞、未成熟的樹突狀細胞、活化的樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、自然殺傷（natural killer, NK）細胞、NK CD56dim 細胞、NK CD56bright 細胞、中性粒細胞、B 細胞、T 細胞、輔助性 T 細胞、輔助性 T 細胞 1（T helper 1, Th1）、輔助性 T 細胞 2（T helper 2, Th2）、Tγδ（T gamma delta）、CD8+ T 細胞、中央記憶 T 細胞、效應記憶 T 細胞、濾泡輔助性 T 細胞、輔助性 T 細胞 17（T helper 17, Th17）、調節性 T 細胞和細胞毒性細胞，用 GSVA 軟件包中的單樣本基因集富集分析方法評價腫瘤中免疫細胞的浸潤情況，用 Spearman 相關分析其與免疫細胞相對浸潤豐度的相關性。采用 Wilcoxon 秩和檢驗分析分子高表達組與低表達組間免疫細胞浸潤的差異。
1.4 CCNB1 富集分析
通過基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）的方法來比較高表達組和低表達組之間不同的京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）信號通路。GSEA 可以分析兩組信號通路富集的差異，推斷可能與基因有關的表型和信號通路。本研究使用 R 軟件包中“clusterProfiler”進行 GSEA 和可視化。
1.5 CCNB1 蛋白互作網絡構建
采用 STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins）數據庫構建 CCNB1 蛋白互作網絡，CCNB1 蛋白互作網絡的置信水平大于 0.4，聚類法采用 Kmeans 聚類，集群數量為 3。
1.6 統計學方法
采用 R 4.0.0 軟件進行統計分析。采用 Wilcoxon 秩和檢驗比較 GTEx 聯合 TCGA 數據庫中的正常樣本的表達和 TCGA 數據庫中腫瘤樣本的表達。同時采用配對樣本 t 檢驗比較 TCGA 隊列中腫瘤組織與配對正常肺腺癌組織的表達值。采用 Wilcoxon 秩和檢驗或 χ2 檢驗比較分子的表達與 TNM 分期、病理分期、性別、年齡的關系。使用 Cox 回歸分析肺腺癌的預后因素，將單因素 Cox 回歸中 P<0.10 的變量納入多因素 Cox 回歸，計算風險比（hazard ratio, HR）及其 95% 置信區間（confidence interval, CI）。采用 Kaplan-Meier 法評價其在肺腺癌中的預后價值，預后分析的主要終點是總生存期（overall survival, OS）、疾病特異性生存期（disease-specific survival, DSS），次要終點為無進展間期（progression-free interval, PFI）。用 Spearman 相關分析其與免疫細胞相對浸潤豐度的相關性。采用 Wilcoxon 秩和檢驗分析分子高表達組與低表達組間免疫細胞浸潤的差異。最后采用 R 包“survival ROC”確定受試者操作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線、曲線下面積（area under the curve, AUC），用以評價基因對 OS 的預測價值。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 篩選目標基因
通過 Oncomine 數據庫，篩選差異表達的目標基因。篩選出的基因 CCNB1 中位秩次為 86，P<0.001。見圖1。
圖1
通過 Oncomine 數據庫篩選出差異表達基因 CCNB1
經過 10 次分析對比，得出在肺腺癌組織中高表達的基因。根據中位秩次排序，剔除已報道過的基因，篩選出
2.2 CCNB1 在肺腺癌中的表達水平
分析 CCNB1 在 HPA 數據庫中的表達情況，結果顯示 CCNB1 在正常肺組織樣本中 RNA 的表達較低（圖2a），但 CCNB1 的蛋白質水平表達較高（圖2b）；圖2c 是來自 HPA 數據庫中 mRNA 細胞系的數據。基于 TCGA 和 GTEx 數據庫，比較 CCNB1 在肺腺癌組織與正常組織樣本中的表達，結果顯示，與正常肺組織相比，CCNB1 在肺腺癌組織中高表達（P<0.001，圖3a）。比較 TCGA 數據庫中肺腺癌組織與配對的正常肺組織之間的表達情況，結果顯示，在肺腺癌組織中 CCNB1 高表達（P<0.001，圖3b）。圖4 顯示了 HPA 數據庫中具有代表性的免疫組織化學圖像，包括高、中、低、未檢出 4 個等級，結果提示，CCNB1 蛋白質水平而不是 mRNA 表達水平可能在診斷肺腺癌上具有更高敏感性。
圖2
CCNB1 在 HPA 數據庫中的表達情況
a. 基于 Consensus dataset，在 RNA 水平上，
圖3
CCNB1 在 TCGA 聯合 GTEx 數據庫中的表達情況
a. 基于 TCGA 和 GTEx 數據庫，
圖4
HPA 數據庫中具有代表性的免疫組織化學圖像
高、中、低、未檢出分別指檢測過程中檢測到的腫瘤細胞的數量，其中未檢出指在該病理切片中未檢測到腫瘤細胞，即為正常的肺組織
2.3 CCNB1 表達與肺腺癌臨床病理特征的關系
分析從 TCGA 數據庫中下載的肺腺癌臨床數據及相關信息，結果顯示 CCNB1 的表達與年齡是否>65 歲和 M 分期無關（P>0.05）；CCNB1 表達與肺腺癌患者的 T 分期、N 分期、病理分期以及性別等臨床特征相關（P<0.05）。見表1。
表1
TCGA 數據庫中 CCNB1 低表達組與高表達組肺腺癌患者基線資料比較
2.4 生存分析
單因素 Cox 回歸分析結果顯示 CCNB1 的表達、T 分期、N 分期、M 分期、病理分期是影響肺腺癌患者總生存率的因素（P<0.05）。多因素 Cox 回歸分析顯示 CCNB1 的表達、T 分期是肺腺癌患者總生存率的獨立危險因素（P<0.05）。見表2。
表2
患者總生存率的單因素和多因素 Cox 比例風險回歸分析
采用 Kaplan-Meier 法對肺腺癌患者 CCNB1 蛋白高低表達組與生存預后的相關性進行分析，結果顯示 CCNB1 高表達與較短的 OS、DSS、PFI 相關（P<0.05），見圖5a～5c。ROC 曲線表明 CCNB1 可能是肺腺癌的診斷分子［AUC=0.980，95%CI（0.967，0.993）］，見圖5d。
圖5
CCNB1 的表達與患者預后的關系及CCNB1 的表達水平與免疫細胞浸潤的關系
a. 在 TCGA 數據庫中，CCNB1 的表達對肺腺癌患者的 OS 的影響；b. 在 TCGA 數據庫中，CCNB1 的表達對肺腺癌患者的 DSS 的影響；c. 在 TCGA 數據庫中，CCNB1 的表達對肺腺癌患者的 PFI 的影響；d. 用 ROC 曲線評價 CCNB1 對肺腺癌的診斷效果，FPR：假陽性率，TPR：真陽性率；e. 森林圖示
2.5 腫瘤微環境中 CCNB1 的表達水平與免疫細胞浸潤的關系
基于 TCGA 數據庫，通過單樣本 GSEA 的方法分析 CCNB1 的表達與肺腺癌免疫微環境中免疫細胞的關系（圖5e）。Spearman 相關分析結果顯示，CCNB1 的表達與 Th2 細胞（rs=0.805，P<0.001）及 T 輔助細胞（rs=0.103，P=0.017）的浸潤呈正相關，與 NK 細胞（rs=?0.195，P<0.001）、巨噬細胞（rs=?0.134，P=0.002）、T 細胞（rs=?0.092，P=0.033）的浸潤呈負相關。
2.6 CCNB1 的單基因 GSEA 富集分析
通過 GSEA 富集分析的方法尋找肺腺癌中 CCNB1 低表達和高表達之間的功能和生物通路。基于 TCGA 數據庫，發現在 MsigDB（C2.cp.v7.2.symbols.GMT）集合中，4 條通路具有顯著差異（表3）。
表3
表型高度富集的基因組
2.7 構建蛋白互作網絡及相關互作蛋白 GSEA
利用 STRING 數據庫建立蛋白互作網絡，篩選出與 CCNB1 蛋白密切相關的 10 個蛋白［補綴同源物 1（patched 1, PTCH1）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase, CDK）1、BUB1 有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸激酶 B（BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase B, BUB1B）、碳酸化/細胞分裂周期蛋白 20 相關蛋白 1（fizzy and cell division cycle 20 related 1, FZR1）、細胞分裂周期 20（cell division cycle 20, CDC20）、Polo 樣激酶 1（polo-like kinase 1, PLK1）、細胞周期蛋白 B2（cyclin B2, CCNB2）、細胞分裂周期 25A（cell division cycle 25A, CDC25A）、CDK2、cdc28 蛋白激酶調節亞基 2（CDC28 protein kinase regulatory subunit 2, CKS2）］，互作關系邊緣系數 edge=47，局部聚類系數為 0.968，蛋白互作網絡富集 P=1.39×10?10。采用 Kmeans 聚類分析將蛋白互作網絡基因分為 3 個模塊。CCNB1 相關互作蛋白相關信號通路主要富集于細胞周期、細胞衰老、P53 信號通路、叉頭框蛋白 O（forkhead box O, FoxO）信號通路。見表4、圖6a。
表4
CCNB1 相關相互作用蛋白富集的主要通路
圖6
CCNB1 蛋白互作網絡及 TCGA 數據庫中 CCNB1 相關互作蛋白的表達情況
a. CCNB1 蛋白互作網絡；b～k. 分別為 TCGA 數據庫中 CDK1、BUB1B、CDC20、PLK1、CCNB2、CDC25A、FZR1、CDK2、CKS2、PTCH1 的表達情況，除 PTCH1 在肺腺癌組織中的表達水平低于正常組織外（
2.8 CCNB1 相關互作蛋白在肺腺癌中的表達情況及預后分析
基于 TCGA 數據庫，對 CCNB1 及相關互作蛋白（PTCH1、CDK1、BUB1B、FZR1、CDC20、PLK1、CCNB2、CDC25A、CDK2、CKS2）在肺腺癌中的表達情況進行分析，結果顯示，所有互作蛋白在肺腺癌與正常肺組織中均存在差異表達，見圖6b～6k。進一步分析 CCNB1 及相關互作基因（PTCH1、CDK1、BUB1B、FZR1、CDC20、PLK1、CCNB2、CDC25A、CDK2、CKS2）表達與肺腺癌患者預后的關系，結果顯示，CDK1、BUB1B、CDC20、PLK1、CCNB2、CDC25A 基因與肺腺癌患者的預后相關，見圖7。
圖7
TCGA 數據庫中 CCNB1 相關互作基因的表達對患者總生存率的影響
a.
3 討論
癌細胞的發生是一個高度復雜的過程，涉及有絲分裂，CCNB1 是細胞周期機制中的重要調節劑。近年來，有報道稱在肝細胞癌患者組織中 CDK1、CCNB1 和 CCNB2 的 mRNA 表達上調，研究結果顯示這些基因的高表達與肝細胞癌患者的預后較差有關[8]。與非腫瘤組織相比，CCNB1 在胰腺癌中也高表達[9]。與上述結果類似，本研究使用了生物信息學工具從公共數據庫中觀察到 CCNB1 在肺腺癌組織中的高表達。本研究結果表明，CCNB1 在肺腺癌中的表達高于癌旁組織。CCNB1 在肺腺癌中的表達與生存期短、預后差有關，ROC 曲線提示 CCNB1 可能是一種潛在的診斷分子。因此我們認為 CCNB1 的表達與肺腺癌的發展密切相關。
腫瘤微環境的細胞成分被認為可以調節腫瘤的特征，包括腫瘤的增殖、血管生成、侵襲和轉移，以及化療耐藥。且近年來，臨床上以免疫檢查點抑制劑為代表的免疫治療少有患者獲益[10-11]。為此，本研究分析了 CCNB1 在肺腺癌微環境中的表達水平與免疫浸潤的關系，結果表明，與 CCNB1 低表達組相比，CCNB1 的表達在 Th2 細胞及 T 輔助細胞的浸潤明顯增加，但在能夠殺死腫瘤細胞的免疫細胞中的表達水平很低，如 NK 細胞、巨噬細胞、T 細胞等。研究表明，腫瘤微環境中的免疫細胞可能影響惡性腫瘤的發生和發展[12-13]。免疫細胞浸潤的比例也與腫瘤轉移和耐藥機制有關[14]。有報道稱，不同的免疫細胞浸潤可能不同程度地影響患者的臨床療效[15]。其中，T 細胞浸潤性腫瘤可能對針對免疫系統抑制機制的治療有反應。非 T 細胞浸潤性腫瘤可能需要額外干預以促進腫瘤微環境中的炎癥和先天免疫激活。巨噬細胞、樹突狀細胞和輔助性 T 細胞在腫瘤侵襲中心和邊緣的浸潤與腫瘤對放化療的抵抗和生存時間的縮短有關[16]。在一項分子介導的腫瘤微環境免疫細胞浸潤特征研究中，肺腺癌微環境中免疫細胞浸潤較正常肺組織明顯減少[17]。與低危組相比，高危組的特點是先天免疫細胞和獲得性免疫細胞浸潤減少，且調節 T 細胞被激活，這可能與預后較差有關。以上提示，CCNB1 可能參與調節肺腺癌微環境中免疫細胞的浸潤，從而影響肺腺癌患者的預后。
為進一步研究 CCNB1 在肺腺癌中的作用，本研究進行了單基因的富集分析，并對利用 STRING 數據庫篩選出的與 CCNB1 相關互作得分前 10 位的蛋白也進行了基因富集分析，這些蛋白主要富集于細胞周期、細胞衰老、P53 信號通路、FoxO 信號通路等通路。同樣，在卵巢癌中，研究人員發現 4 個基因（BUB1B、BUB1、TTK 和 CCNB1）在細胞周期通路中顯著富集，且在卵巢癌中預后較差[18]。在一項有關乳腺癌的研究中，研究人員發現有絲分裂細胞周期可能是解釋乳腺癌進展的潛在途徑，CDK1、CCNA2、TOP2A、CCNB1、KIF11 和 MELK 可能是潛在的關鍵基因，它們有可能被用作預后的新生物標志物和乳腺癌藥物合成的潛在新靶點。p53 信號通路在多種惡性腫瘤疾病的發生和發展中起著重要作用。在一項研究中，p53 信號通路中的中心基因（CCNB1、CCNB2、CDK1、CDKN2A 和 CHEK1）的上調證實 p53 信號通路是肺腺癌腫瘤發生和存活的危險因素[19]。有報道稱 CCNB1 沉默通過激活胰腺癌中的 p53 信號傳導途徑抑制細胞增殖并促進細胞衰老[9]。因此，我們推測肺腺癌中的 p53 信號通路可能通過 CCNB1 等分子與其他信號通路產生更多的相互作用網絡，或者可能通過改變細胞周期促進腫瘤發生。
除此之外，CCNB1/CDK1 還介導 Sirtuin 3[20]，增強線粒體功能和腫瘤的抗輻射性[21]，并使線粒體抗氧化劑錳依賴性超氧化物歧化酶磷酸化，適應細胞對輻射應激的反應[22]，從而使癌細胞更加難以被消滅。
本研究雖然在肺腺癌中發現了 CCNB1 的預測價值，但是仍存在局限性。首先，由于數據庫中患者治療細節信息不完整，本研究無法評估患者的具體情況；其次，CCNB1 在蛋白質水平的研究尚不清晰，其具體分子機制仍有待進一步分析。因此，我們仍需進行全面的研究，以確認本次研究的發現。
綜上所述，在肺腺癌中 CCNB1 的表達上調，高 CCNB1 表達導致肺腺癌預后不良，CCNB1 可能在肺腺癌的發生和發展中起著重要作用。CCNB1 或許是一種潛在的治療靶點，為改善患者的預后帶來更多的可能。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
肺癌是最常見的癌癥之一，也是癌癥相關死亡的主要原因[1]，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌 2 種亞型，分別占全部病例的 15% 和 85%[2]。肺腺癌是非小細胞肺癌最常見的組織學類型，見于 40% 以上的患者[3-4]；且肺腺癌的發病率穩步上升[5]。近年來，化療、靶向治療等綜合治療為改善肺腺癌患者預后帶來了更多可能[4]。常規化療對大多數病例有效，但其副作用嚴重，可嚴重影響患者生活質量。此外，分子靶向治療藥物療效有限，新的靶向藥物往往因為耐藥性的發展而失敗[6]。晚期患者和不能使用靶向藥物的患者生存率顯著降低。目前，晚期非小細胞肺癌的治療以程序性死亡因子 1 或程序性死亡因子配體-1 抗體的免疫治療為主，可單獨使用，也可與化療聯合使用[7]，但緩解率很低。并且，目前尚無有效的生物標志物來預測肺腺癌的不良預后和治療效果。細胞周期蛋白 B1（cyclin B1, CCNB1）是一種參與有絲分裂的調節蛋白，與 p34（cdc2）復合物形成成熟促進因子，對于適當控制細胞周期的 G2/M（有絲分裂）過渡期是必要的。有研究表明，CCNB1 在肝細胞癌、胰腺癌中高表達[8-9]。因此，本研究基于各類數據庫，分析了 CCNB1 在肺腺癌中的表達情況，并進一步評估了 CCNB1 表達對肺腺癌預后的影響。
1 資料與方法
1.1 篩選差異目標基因
使用 Oncomine 數據庫，分別選擇：① 分析類型：癌癥 vs. 正常分析；② 癌癥類型：肺腺癌；③ 樣品類型：組織標本；④ 數據類型：mRNA；⑤ 設定條件：過度表達；⑥ 臨界值 P<0.05，差異倍數（fold change）>2。
1.2 CCNB1 表達差異情況分析
使用人類蛋白質表達圖譜（Human Protein Atlas, HPA）數據庫分析 CCNB1 在人類肺正常組織和癌組織中的 mRNA 水平和蛋白質水平差異，以及在常見的各種癌癥細胞系中的基因表達水平。通過基因表達譜交互分析工具 GEPPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）分析來自癌癥基因組圖譜數據庫（The Cancer Genome Atlas, TCGA）聯合基因型-組織表達數據庫（Genotype-Tissue Expression, GTEx）中正常組織和肺腺癌的表達情況，同時比較 TCGA 隊列中肺腺癌和匹配的正常肺組織中 CCNB1 的表達水平。從 HPA 數據庫中下載具有不同蛋白質表達水平的肺腺癌組織代表性的免疫組織化學圖像進行分析。
1.3 免疫浸潤分析
根據文獻報道的免疫細胞的基因標志物，即樹突狀細胞、未成熟的樹突狀細胞、活化的樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、自然殺傷（natural killer, NK）細胞、NK CD56dim 細胞、NK CD56bright 細胞、中性粒細胞、B 細胞、T 細胞、輔助性 T 細胞、輔助性 T 細胞 1（T helper 1, Th1）、輔助性 T 細胞 2（T helper 2, Th2）、Tγδ（T gamma delta）、CD8+ T 細胞、中央記憶 T 細胞、效應記憶 T 細胞、濾泡輔助性 T 細胞、輔助性 T 細胞 17（T helper 17, Th17）、調節性 T 細胞和細胞毒性細胞，用 GSVA 軟件包中的單樣本基因集富集分析方法評價腫瘤中免疫細胞的浸潤情況，用 Spearman 相關分析其與免疫細胞相對浸潤豐度的相關性。采用 Wilcoxon 秩和檢驗分析分子高表達組與低表達組間免疫細胞浸潤的差異。
1.4 CCNB1 富集分析
通過基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）的方法來比較高表達組和低表達組之間不同的京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）信號通路。GSEA 可以分析兩組信號通路富集的差異，推斷可能與基因有關的表型和信號通路。本研究使用 R 軟件包中“clusterProfiler”進行 GSEA 和可視化。
1.5 CCNB1 蛋白互作網絡構建
采用 STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins）數據庫構建 CCNB1 蛋白互作網絡，CCNB1 蛋白互作網絡的置信水平大于 0.4，聚類法采用 Kmeans 聚類，集群數量為 3。
1.6 統計學方法
采用 R 4.0.0 軟件進行統計分析。采用 Wilcoxon 秩和檢驗比較 GTEx 聯合 TCGA 數據庫中的正常樣本的表達和 TCGA 數據庫中腫瘤樣本的表達。同時采用配對樣本 t 檢驗比較 TCGA 隊列中腫瘤組織與配對正常肺腺癌組織的表達值。采用 Wilcoxon 秩和檢驗或 χ2 檢驗比較分子的表達與 TNM 分期、病理分期、性別、年齡的關系。使用 Cox 回歸分析肺腺癌的預后因素，將單因素 Cox 回歸中 P<0.10 的變量納入多因素 Cox 回歸，計算風險比（hazard ratio, HR）及其 95% 置信區間（confidence interval, CI）。采用 Kaplan-Meier 法評價其在肺腺癌中的預后價值，預后分析的主要終點是總生存期（overall survival, OS）、疾病特異性生存期（disease-specific survival, DSS），次要終點為無進展間期（progression-free interval, PFI）。用 Spearman 相關分析其與免疫細胞相對浸潤豐度的相關性。采用 Wilcoxon 秩和檢驗分析分子高表達組與低表達組間免疫細胞浸潤的差異。最后采用 R 包“survival ROC”確定受試者操作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線、曲線下面積（area under the curve, AUC），用以評價基因對 OS 的預測價值。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 篩選目標基因
通過 Oncomine 數據庫，篩選差異表達的目標基因。篩選出的基因 CCNB1 中位秩次為 86，P<0.001。見圖1。
圖1
通過 Oncomine 數據庫篩選出差異表達基因 CCNB1
經過 10 次分析對比，得出在肺腺癌組織中高表達的基因。根據中位秩次排序，剔除已報道過的基因，篩選出
2.2 CCNB1 在肺腺癌中的表達水平
分析 CCNB1 在 HPA 數據庫中的表達情況，結果顯示 CCNB1 在正常肺組織樣本中 RNA 的表達較低（圖2a），但 CCNB1 的蛋白質水平表達較高（圖2b）；圖2c 是來自 HPA 數據庫中 mRNA 細胞系的數據。基于 TCGA 和 GTEx 數據庫，比較 CCNB1 在肺腺癌組織與正常組織樣本中的表達，結果顯示，與正常肺組織相比，CCNB1 在肺腺癌組織中高表達（P<0.001，圖3a）。比較 TCGA 數據庫中肺腺癌組織與配對的正常肺組織之間的表達情況，結果顯示，在肺腺癌組織中 CCNB1 高表達（P<0.001，圖3b）。圖4 顯示了 HPA 數據庫中具有代表性的免疫組織化學圖像，包括高、中、低、未檢出 4 個等級，結果提示，CCNB1 蛋白質水平而不是 mRNA 表達水平可能在診斷肺腺癌上具有更高敏感性。
圖2
CCNB1 在 HPA 數據庫中的表達情況
a. 基于 Consensus dataset，在 RNA 水平上，
圖3
CCNB1 在 TCGA 聯合 GTEx 數據庫中的表達情況
a. 基于 TCGA 和 GTEx 數據庫，
圖4
HPA 數據庫中具有代表性的免疫組織化學圖像
高、中、低、未檢出分別指檢測過程中檢測到的腫瘤細胞的數量，其中未檢出指在該病理切片中未檢測到腫瘤細胞，即為正常的肺組織
2.3 CCNB1 表達與肺腺癌臨床病理特征的關系
分析從 TCGA 數據庫中下載的肺腺癌臨床數據及相關信息，結果顯示 CCNB1 的表達與年齡是否>65 歲和 M 分期無關（P>0.05）；CCNB1 表達與肺腺癌患者的 T 分期、N 分期、病理分期以及性別等臨床特征相關（P<0.05）。見表1。
表1
TCGA 數據庫中 CCNB1 低表達組與高表達組肺腺癌患者基線資料比較
2.4 生存分析
單因素 Cox 回歸分析結果顯示 CCNB1 的表達、T 分期、N 分期、M 分期、病理分期是影響肺腺癌患者總生存率的因素（P<0.05）。多因素 Cox 回歸分析顯示 CCNB1 的表達、T 分期是肺腺癌患者總生存率的獨立危險因素（P<0.05）。見表2。
表2
患者總生存率的單因素和多因素 Cox 比例風險回歸分析
采用 Kaplan-Meier 法對肺腺癌患者 CCNB1 蛋白高低表達組與生存預后的相關性進行分析，結果顯示 CCNB1 高表達與較短的 OS、DSS、PFI 相關（P<0.05），見圖5a～5c。ROC 曲線表明 CCNB1 可能是肺腺癌的診斷分子［AUC=0.980，95%CI（0.967，0.993）］，見圖5d。
圖5
CCNB1 的表達與患者預后的關系及CCNB1 的表達水平與免疫細胞浸潤的關系
a. 在 TCGA 數據庫中，CCNB1 的表達對肺腺癌患者的 OS 的影響；b. 在 TCGA 數據庫中，CCNB1 的表達對肺腺癌患者的 DSS 的影響；c. 在 TCGA 數據庫中，CCNB1 的表達對肺腺癌患者的 PFI 的影響；d. 用 ROC 曲線評價 CCNB1 對肺腺癌的診斷效果，FPR：假陽性率，TPR：真陽性率；e. 森林圖示
2.5 腫瘤微環境中 CCNB1 的表達水平與免疫細胞浸潤的關系
基于 TCGA 數據庫，通過單樣本 GSEA 的方法分析 CCNB1 的表達與肺腺癌免疫微環境中免疫細胞的關系（圖5e）。Spearman 相關分析結果顯示，CCNB1 的表達與 Th2 細胞（rs=0.805，P<0.001）及 T 輔助細胞（rs=0.103，P=0.017）的浸潤呈正相關，與 NK 細胞（rs=?0.195，P<0.001）、巨噬細胞（rs=?0.134，P=0.002）、T 細胞（rs=?0.092，P=0.033）的浸潤呈負相關。
2.6 CCNB1 的單基因 GSEA 富集分析
通過 GSEA 富集分析的方法尋找肺腺癌中 CCNB1 低表達和高表達之間的功能和生物通路。基于 TCGA 數據庫，發現在 MsigDB（C2.cp.v7.2.symbols.GMT）集合中，4 條通路具有顯著差異（表3）。
表3
表型高度富集的基因組
2.7 構建蛋白互作網絡及相關互作蛋白 GSEA
利用 STRING 數據庫建立蛋白互作網絡，篩選出與 CCNB1 蛋白密切相關的 10 個蛋白［補綴同源物 1（patched 1, PTCH1）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase, CDK）1、BUB1 有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸激酶 B（BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase B, BUB1B）、碳酸化/細胞分裂周期蛋白 20 相關蛋白 1（fizzy and cell division cycle 20 related 1, FZR1）、細胞分裂周期 20（cell division cycle 20, CDC20）、Polo 樣激酶 1（polo-like kinase 1, PLK1）、細胞周期蛋白 B2（cyclin B2, CCNB2）、細胞分裂周期 25A（cell division cycle 25A, CDC25A）、CDK2、cdc28 蛋白激酶調節亞基 2（CDC28 protein kinase regulatory subunit 2, CKS2）］，互作關系邊緣系數 edge=47，局部聚類系數為 0.968，蛋白互作網絡富集 P=1.39×10?10。采用 Kmeans 聚類分析將蛋白互作網絡基因分為 3 個模塊。CCNB1 相關互作蛋白相關信號通路主要富集于細胞周期、細胞衰老、P53 信號通路、叉頭框蛋白 O（forkhead box O, FoxO）信號通路。見表4、圖6a。
表4
CCNB1 相關相互作用蛋白富集的主要通路
圖6
CCNB1 蛋白互作網絡及 TCGA 數據庫中 CCNB1 相關互作蛋白的表達情況
a. CCNB1 蛋白互作網絡；b～k. 分別為 TCGA 數據庫中 CDK1、BUB1B、CDC20、PLK1、CCNB2、CDC25A、FZR1、CDK2、CKS2、PTCH1 的表達情況，除 PTCH1 在肺腺癌組織中的表達水平低于正常組織外（
2.8 CCNB1 相關互作蛋白在肺腺癌中的表達情況及預后分析
基于 TCGA 數據庫，對 CCNB1 及相關互作蛋白（PTCH1、CDK1、BUB1B、FZR1、CDC20、PLK1、CCNB2、CDC25A、CDK2、CKS2）在肺腺癌中的表達情況進行分析，結果顯示，所有互作蛋白在肺腺癌與正常肺組織中均存在差異表達，見圖6b～6k。進一步分析 CCNB1 及相關互作基因（PTCH1、CDK1、BUB1B、FZR1、CDC20、PLK1、CCNB2、CDC25A、CDK2、CKS2）表達與肺腺癌患者預后的關系，結果顯示，CDK1、BUB1B、CDC20、PLK1、CCNB2、CDC25A 基因與肺腺癌患者的預后相關，見圖7。
圖7
TCGA 數據庫中 CCNB1 相關互作基因的表達對患者總生存率的影響
a.
3 討論
癌細胞的發生是一個高度復雜的過程，涉及有絲分裂，CCNB1 是細胞周期機制中的重要調節劑。近年來，有報道稱在肝細胞癌患者組織中 CDK1、CCNB1 和 CCNB2 的 mRNA 表達上調，研究結果顯示這些基因的高表達與肝細胞癌患者的預后較差有關[8]。與非腫瘤組織相比，CCNB1 在胰腺癌中也高表達[9]。與上述結果類似，本研究使用了生物信息學工具從公共數據庫中觀察到 CCNB1 在肺腺癌組織中的高表達。本研究結果表明，CCNB1 在肺腺癌中的表達高于癌旁組織。CCNB1 在肺腺癌中的表達與生存期短、預后差有關，ROC 曲線提示 CCNB1 可能是一種潛在的診斷分子。因此我們認為 CCNB1 的表達與肺腺癌的發展密切相關。
腫瘤微環境的細胞成分被認為可以調節腫瘤的特征，包括腫瘤的增殖、血管生成、侵襲和轉移，以及化療耐藥。且近年來，臨床上以免疫檢查點抑制劑為代表的免疫治療少有患者獲益[10-11]。為此，本研究分析了 CCNB1 在肺腺癌微環境中的表達水平與免疫浸潤的關系，結果表明，與 CCNB1 低表達組相比，CCNB1 的表達在 Th2 細胞及 T 輔助細胞的浸潤明顯增加，但在能夠殺死腫瘤細胞的免疫細胞中的表達水平很低，如 NK 細胞、巨噬細胞、T 細胞等。研究表明，腫瘤微環境中的免疫細胞可能影響惡性腫瘤的發生和發展[12-13]。免疫細胞浸潤的比例也與腫瘤轉移和耐藥機制有關[14]。有報道稱，不同的免疫細胞浸潤可能不同程度地影響患者的臨床療效[15]。其中，T 細胞浸潤性腫瘤可能對針對免疫系統抑制機制的治療有反應。非 T 細胞浸潤性腫瘤可能需要額外干預以促進腫瘤微環境中的炎癥和先天免疫激活。巨噬細胞、樹突狀細胞和輔助性 T 細胞在腫瘤侵襲中心和邊緣的浸潤與腫瘤對放化療的抵抗和生存時間的縮短有關[16]。在一項分子介導的腫瘤微環境免疫細胞浸潤特征研究中，肺腺癌微環境中免疫細胞浸潤較正常肺組織明顯減少[17]。與低危組相比，高危組的特點是先天免疫細胞和獲得性免疫細胞浸潤減少，且調節 T 細胞被激活，這可能與預后較差有關。以上提示，CCNB1 可能參與調節肺腺癌微環境中免疫細胞的浸潤，從而影響肺腺癌患者的預后。
為進一步研究 CCNB1 在肺腺癌中的作用，本研究進行了單基因的富集分析，并對利用 STRING 數據庫篩選出的與 CCNB1 相關互作得分前 10 位的蛋白也進行了基因富集分析，這些蛋白主要富集于細胞周期、細胞衰老、P53 信號通路、FoxO 信號通路等通路。同樣，在卵巢癌中，研究人員發現 4 個基因（BUB1B、BUB1、TTK 和 CCNB1）在細胞周期通路中顯著富集，且在卵巢癌中預后較差[18]。在一項有關乳腺癌的研究中，研究人員發現有絲分裂細胞周期可能是解釋乳腺癌進展的潛在途徑，CDK1、CCNA2、TOP2A、CCNB1、KIF11 和 MELK 可能是潛在的關鍵基因，它們有可能被用作預后的新生物標志物和乳腺癌藥物合成的潛在新靶點。p53 信號通路在多種惡性腫瘤疾病的發生和發展中起著重要作用。在一項研究中，p53 信號通路中的中心基因（CCNB1、CCNB2、CDK1、CDKN2A 和 CHEK1）的上調證實 p53 信號通路是肺腺癌腫瘤發生和存活的危險因素[19]。有報道稱 CCNB1 沉默通過激活胰腺癌中的 p53 信號傳導途徑抑制細胞增殖并促進細胞衰老[9]。因此，我們推測肺腺癌中的 p53 信號通路可能通過 CCNB1 等分子與其他信號通路產生更多的相互作用網絡，或者可能通過改變細胞周期促進腫瘤發生。
除此之外，CCNB1/CDK1 還介導 Sirtuin 3[20]，增強線粒體功能和腫瘤的抗輻射性[21]，并使線粒體抗氧化劑錳依賴性超氧化物歧化酶磷酸化，適應細胞對輻射應激的反應[22]，從而使癌細胞更加難以被消滅。
本研究雖然在肺腺癌中發現了 CCNB1 的預測價值，但是仍存在局限性。首先，由于數據庫中患者治療細節信息不完整，本研究無法評估患者的具體情況；其次，CCNB1 在蛋白質水平的研究尚不清晰，其具體分子機制仍有待進一步分析。因此，我們仍需進行全面的研究，以確認本次研究的發現。
綜上所述，在肺腺癌中 CCNB1 的表達上調，高 CCNB1 表達導致肺腺癌預后不良，CCNB1 可能在肺腺癌的發生和發展中起著重要作用。CCNB1 或許是一種潛在的治療靶點，為改善患者的預后帶來更多的可能。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
