引用本文： 楊洋, 周永召, 劉凱. 外周血宏基因組二代測序診斷內臟利什曼病三例. 華西醫學, 2022, 37(5): 794-797. doi: 10.7507/1002-0179.202201108 復制
病例介紹 患者 1，男，47 歲，體重 55 kg，因“發熱 3 個月余”于 2020 年 12 月 28 日入住四川大學華西醫院（以下簡稱“華西醫院”）感染科。入院前 3 個月，患者無明顯誘因開始出現反復發熱，不伴咳嗽咳痰、畏寒寒顫、關節疼痛等，最高體溫 39.9℃，自行口服“退熱藥、青蒿素”（具體藥名及劑量不詳），仍間斷發熱，反復多次于華西醫院及外院就診，診斷未明。入院前 5 d，患者因再次發熱伴腹瀉、腹脹，不伴咳嗽咳痰，于外院診斷為“發熱待診、肝硬化失代償期、腎功能異常”（具體診治經過不詳），給予退熱等對癥支持治療（具體不詳）后，患者仍反復出現不規則發熱，遂于 2020 年 12 月 25 日至華西醫院急診科就診。急診科完善血常規示：血紅蛋白 83 g/L（參考值 130～175 g/L），血小板計數 16×109/L（參考值 100×109/L～300×109/L），白細胞計數 2.82×109/L（參考值 3.5×109/L～9.5×109/L），中性分葉核粒細胞百分率 84%（參考值 40%～75%），淋巴細胞絕對值 0.23×109/L（參考值 1.1×109/L～3.2×109/L），未查見嗜酸性粒細胞。凝血常規示：凝血酶時間 14 s（參考值 9.6～12.8 s），活化部分凝血酶時間 42.1 s（參考值 24.8～33.8 s），纖維蛋白原 2.43 g/L（參考值 2.0～4.0 g/L）；總膽紅素 9.0 μmol/L（參考值 5.0～28.0 μmol/L），丙氨酸氨基轉移酶 14 U/L（參考值<50 U/L），門冬氨酸氨基轉移酶 33 U/L（參考值<40 U/L），白蛋白 26.6 g/L（參考值 40～55 g/L），球蛋白 30.3 g/L（參考值 20～40 g/L），血肌酐 159 μmol/L（參考值 68～108 μmol/L），估算腎小球濾過率 43.88 mL/（min·1.73m2）［參考值 56～122 mL/（min·1.73m2）］。尿常規提示：尿蛋白定性+，亞硝酸陰性，細菌 294/μL（參考值<230/μL）尿培養提示樣本留取污染。大便常規未查見寄生蟲卵。降鈣素原 0.87 ng/mL（參考值<0.046 ng/mL）。血培養回示：耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌、表皮葡萄球菌。輸血前全套檢查［包括乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎（丙肝）病毒、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、梅毒］陰性。甲、戊肝標志物陰性。日本血吸蟲免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G 抗體、肝吸蟲抗體 IgG 檢測、包蟲病抗體 IgG 檢測、瘧原蟲抗原檢測、血涂片查瘧原蟲、隱球菌抗原檢測、真菌 1, 3-B-D 葡聚糖檢測、曲霉菌半乳甘露聚糖檢測均為陰性。結核感染 T 細胞γ干擾素釋放試驗結果判定不確定。2020 年 12 月 26 日，急診科醫師送檢患者外周血標本進行宏基因組二代測序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS），結果待回。影像學檢查：CT 胸腹部平掃示肝硬化，脾大，門脈高壓伴側支循環建立，輕度腹膜炎征象，腹盆腔散在積液，右肺中下葉及左肺上葉舌段少許炎癥，心包積液。急診考慮診斷“發熱待診、膿毒癥、肝硬化失代償期”，先后給予莫西沙星（0.5 g、1 次/d）、利奈唑胺（0.6 g、每 12 小時 1 次）抗感染，補充白蛋白，利尿，輸血小板，補液、補充電解質及能量，于 2020 年 12 月 28 日將患者轉入華西醫院感染科進一步治療。既往史：患者否認肝炎病史，6 年前診斷為“瘧疾”（診治經過不詳），自訴口服“奎寧”（具體劑量及療程不詳）后痊愈。個人史：在非洲從事廚師一職 10 余年，未至牧區，無長期酗酒史。
入院體格檢查：體溫 38.6℃，脈搏 117 次/min，呼吸 22 次/min，血壓 144/102 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），貧血貌，左手臂皮下瘀斑，雙肺未聞及明顯干、濕性啰音，肝、脾肋下未觸及，腹部腸鳴音減弱，移動性濁音陽性。
入院診斷：① 膿毒血癥。② 發熱待診：感染？其他？③ 肝硬化失代償期（脾功能亢進、腹水、凝血功能異常、低蛋白血癥）。④ 肺部感染。⑤ 腎功能不全。⑥ 電解質紊亂（低鈉、低鉀、低氯）。
診治經過及結局：入院后調整替加環素（0.05 g、每 12 小時 1 次）抗感染，輔以升白細胞、預防出血、輸注血制品、利尿、維持水電解質平衡、調節腸道菌群等對癥支持治療。繼續完善發熱相關檢查：高精度 HBV DNA 擴增陰性。大便培養未見明顯異常；大便艱難梭菌抗原檢測、艱難梭菌毒素 A/B 陰性。TORCH IgM［包括巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）抗體 IgM、風疹病毒抗體 IgM、單皰病毒抗體Ⅰ/Ⅱ型 IgM、弓形蟲抗體 IgM］均陰性。EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）DNA 擴增陰性，CMV DNA 陽性，<50 copies/mL。鐵蛋白>2 000 ng/mL（參考值 24～336 ng/mL），自身免疫抗體篩查均陰性。腫瘤標志物篩查未見明顯異常。入院后第 2 天 mNGS 結果回示：查見嬰兒利什曼原蟲及杜氏利什曼原蟲特異性序列。向四川省疾病預防控制（疾控）中心報告，送檢外周血 rK39 試驗，入院后第 3 天結果回示 rK39 試驗陽性。因血小板明顯降低（血小板計數 8×109/L），未行骨髓穿刺活檢。結合癥狀、流行病學史、體征及檢查結果，感染科修正主要診斷為“黑熱病”，并于入院后第 3 天啟動抗利什曼原蟲治療—葡萄糖酸銻鈉 1.2 g（首次劑量 0.6 g）、1 次/d，連續 8 d 靜脈注射。治療利什曼病期間，患者出現腹脹進行性加重，肺部感染持續加重，腎功能仍持續惡化，于 2021 年 1 月 11 日因呼吸衰竭死亡。
患者 2，男，15 歲，體重 60 kg，因“發熱伴咳嗽 10 余天”于 2021 年 1 月 8 日入住華西醫院感染科。入院前 10 余天，患者開始出現發熱，最高體溫 41℃，伴咳嗽，不伴關節疼痛，于當地醫院住院，考慮“① 發熱待診：感染性疾病？噬血細胞綜合征？淋巴瘤？② 脾大”（具體診治經過不詳），予頭孢哌酮舒巴坦鈉抗感染、藥物降溫等治療（具體劑量不詳）后仍每日發熱，于 2021 年 1 月 5 日就診于華西醫院急診科。急診科完善血常規：血紅蛋白 100 g/L，血小板計數 121×109/L，白細胞計數 4.68×109/L，中性分葉核粒細胞百分率 65%，淋巴細胞絕對值 1.4×109/L，嗜酸細胞絕對值 0.0×109/L（參考值 0.02×109/L～0.52×109/L）。凝血功能未見明顯異常。丙氨酸氨基轉移酶 204 U/L，門冬氨酸氨基轉移酶 176 U/L，白蛋白 39.0 g/L，球蛋白 39.8 g/L，腎功能未見明顯異常。尿常規、大便常規未見明顯異常。降鈣素原 2.11 ng/mL，C 反應蛋白 53.50 mg/L（參考值<5 mg/L），輸血前全套檢查未提示確切 HBV、丙肝病毒、HIV 、梅毒感染。TORCH IgM 均陰性。血培養未見病原微生物。2021 年 1 月 7 日急診送檢患者外周血 mNGS 檢查，結果待回。鐵蛋白>2 000 ng/mL，風濕免疫標記篩查：抗核抗體 +1:100，抗 Jo-1 抗體+，余免疫標記未見明顯異常。影像學檢查：胸部 CT 平掃示雙肺未見明顯異常，掃及脾大。腹部彩色多普勒超聲（彩超）提示脾臟長大（脾臟肋間厚 6.6 cm）。急診考慮診斷“發熱待診、輕度貧血”，急診給予頭孢曲松 2.0 g、1 次/d 經驗性抗感染治療，輔以物理降溫及藥物退熱，仍反復發熱，體溫波動于 38.5℃，于 2021 年 1 月 8 日轉入華西醫院感染科進一步治療。既往身體健康，否認肝炎、結核等病史。個人史：職業為學生，入院半年前有山西陽泉旅居史，未至牧區，無煙酒不良嗜好。
入院體格檢查：體溫 39.5℃，脈搏 122 次/min，呼吸 22 次/min，血壓 114/70 mm Hg，輕度貧血貌，雙肺未聞及明顯干濕性啰音，肝脾肋下未觸及。
入院診斷：發熱待診：感染性疾病？血液系統性疾病？其他？
診治經過及結局：入院后序貫頭孢曲松 2.0 g、1 次/d 抗感染治療，輔以保肝、升白細胞、降溫等對癥治療。同時繼續篩查發熱原因。呼吸道 13 項病毒及病原體（甲型流感病毒、腺病毒、博卡病毒、鼻病毒、甲流 H1N1、副流感病毒、衣原體、偏肺病毒、乙型流感病毒、肺炎支原體、甲流 H3N2、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒）陰性。真菌 1, 3-B-D 葡聚糖檢測、曲霉菌半乳甘露聚糖檢測均為陰性。多次血培養結果均陰性。結核菌素純蛋白衍生物皮試陰性，結核感染 T 細胞 γ 干擾素釋放試驗結果判定不確定。EBV DNA 4.11×102copies/mL，CMV DNA 陽性，<50 copies/mL。抗中性粒細胞胞漿抗體篩查陰性。白細胞介素-2 受體 6 139 U/mL（參考值 223～710 U/mL）。入院第 2 天 mNGS 結果回示查見嬰兒利什曼原蟲特異性序列及 EBV 特異性序列。向四川省疾控中心報告，送檢外周血 rK39 試驗，結果顯示 rK39 試驗陽性，證實利什曼原蟲感染。入院第 4 天（2021 年 1 月 11 日）行第 1 次骨髓穿刺，骨髓涂片未查見病原體存在。入院第 5 天啟動抗利什曼治療：葡糖糖酸銻鈉 0.6 g、1 次/d，連續 10 d 靜脈注射。患者發熱好轉、緩解，復查彩超提示脾臟回縮（脾臟肋間厚 5.1 cm）。入院第 14 天復查骨髓穿刺，于入院第 15 天（2021 年 1 月 22 日）出院。
隨訪：出院后追蹤首次骨髓穿刺病理結果：骨髓液結核桿菌 DNA 實時熒光檢測陰性。追蹤第 2 次骨髓穿刺結果，病理提示未查見病原體存在。出院后未再發熱，于 2021 年 2 月 17 日再次返院評估病情，患者精神、睡眠、食欲可，復查血常規提示貧血改善（血紅蛋白 125 g/L），復查腹部彩超提示脾臟繼續回縮（脾臟肋間厚 4.5 cm）。2021 年 2 月 18 日復查骨髓穿刺仍未查見病原體存在，評估治療后病情緩解。
患者 3，男，44 歲，體重 55 kg，因“反復發熱 1 個月余”于 2021 年 8 月 14 日于入住華西醫院傳染科。入院前 1 個月，患者受涼后出現發熱，體溫最高 40.6℃，不伴咳嗽咳痰、尿頻尿急、關節疼痛等，于當地醫院診治（具體不詳）后仍反復發熱，為明確診斷至華西醫院急診科就診。急診完善血常規：血紅蛋白 54 g/L，血小板計數 10×109/L，白細胞計數 0.87×109/L，淋巴細胞計數 0.25×109/L，嗜酸性粒細胞計數 0.0×109/L。凝血常規示：凝血酶時間 14.5 s，活化部分凝血酶時間 53.3 s，纖維蛋白原 0.97 g/L。白蛋白 26.9 g/L，球蛋白 48 g/L，降鈣素原 0.53 ng/mL，C 反應蛋白 22.2 mg/L，輸血前全套檢查：HIV 抗原抗體復合檢測 300 COI，未提示確切 HBV、丙肝病毒、梅毒感染。進一步完善高精度 HIV-Ⅰ病毒載量 1.29×105copies/mL。血培養未培養出病原微生物。胸+全腹部 CT 平掃示：右肺上葉尖段片團狀軟組織影，范圍約 2.5 cm×2.0 cm，周圍見斑片影、磨玻璃影，邊界模糊；雙肺另散在結節影，部分伴空洞，大者位于左肺上葉尖后段，長徑約 1.0 cm，上述考慮炎性/感染性病變，右肺尖病灶其他待排；雙側腋窩、縱隔淋巴結增多，縱隔淋巴結稍增大；網膜及腸系膜腫脹，部分腸壁水腫，盆腹腔少量積液，腹盆壁皮下水腫；肝脾增大，以脾臟增大明顯，腹腔及腹膜后、雙側腹股溝區淋巴結增多。急診考慮診斷：“① 發熱待診；② 獲得性免疫缺陷綜合征”，給予成分輸血、補充白蛋白、維持水電解質平衡后，建議患者于傳染病醫院繼續治療。入院前 5 d，患者因發熱伴咳嗽、咳痰再次于急診科就診，復查血常規：血紅蛋白 59 g/L，血小板計數 18×109/L，白細胞計數 0.82×109/L，淋巴細胞計數 0.23×109/L，嗜酸性粒細胞計數 0.0×109/L。白蛋白 25.3 g/L，球蛋白 52.3 g/L，降鈣素原 0.50 ng/mL，C 反應蛋白 25.5 mg/L，CD4 細胞絕對計數 12 個/μL。尿常規、大便常規未見明顯異常。多次血培養結果均陰性。TORCH IgM 均陰性。EBV DNA 1.64×102copies/mL，CMV DNA 陽性，<50 copies/mL。痰涂片查見似酵母樣菌，痰培養提示熱帶念珠菌及光滑念珠菌，真菌 1, 3-B-D 葡聚糖 60.22 pg/mL（參考值 0～95 pg/mL），曲霉菌半乳甘露聚糖 0.52 GMI（參考值<0.5 GMI）。結核感染 T 細胞γ干擾素釋放試驗結果判定陰性。腫瘤標志物篩查無明顯異常。影像學檢查：復查胸部及全腹部 CT 平掃提示右肺上葉尖段片團狀軟組織影，范圍約 3.1 cm×2.3 cm，內見空泡及鈣化，邊緣見毛刺及條索，感染性病變？腫瘤待排；心腔密度減低，心包少量積液；腹部征象較前次變化不大。急診給予美羅培南 1.0 g、每 8 小時 1 次抗感染治療后于 2021 年 8 月 14 日轉入傳染科住院繼續治療。發病后體重減輕約 10 kg。既往身體健康，否認肝炎、結核等傳染病史。個人史：原籍云南，長期于新疆喀什務農，未飼養牛羊等家畜，無吸煙史，偶爾飲酒，飲白酒約 500 g/次，有高危性行為史。
入院體格檢查：體溫 36.8℃，脈搏 92 次/min，呼吸 20 次/ min，血壓 114/76 mm Hg，貧血貌，雙肺呼吸音粗糙，未聞及明顯干、濕性啰音，肝臟肋下未觸及，脾臟肋下 2 cm，腹股溝區捫及多枚淋巴結長大。
入院診斷：① 獲得性免疫缺陷綜合征。② 肺部感染（細菌+真菌）。③ EBV 感染。④ 肝硬化失代償期？⑤ 全血細胞減少原因待查。⑥ 重度貧血。
診治經過及結局：入院后先后予以口服、靜脈滴注伏立康唑 0.2 g、每 12 小時 1 次抗真菌治療；序貫急診使用美羅培南 1.0 g、每 8 小時 1 次靜脈滴注抗感染治療；更昔洛韋 0.25 g、每 12 小時 1 次靜脈滴注抗病毒治療。期間使用升白細胞、升血小板藥物促進造血，并間斷補充血小板、人血白蛋白。患者仍反復發熱，多次血培養仍為陰性。入院后繼續完善相關檢查：隱球菌抗原滴度檢測陰性。復查真菌 1, 3-B-D 葡聚糖 71.87 pg/mL，曲霉菌半乳甘露聚糖 0.47 GMI。鐵蛋白 762 ng/mL。復查胸部 CT 提示右肺病灶較前縮小，右肺尖病灶內空洞形成，經知情同意后患者接受 HREO 方案［異煙肼（0.3 g、1 次/d 口服）+利福噴丁（0.45 g、2 次/周口服）+乙胺丁醇（0.75 g、1 次/d 口服）+左氧氟沙星（0.5 g、1 次/d 靜脈滴注）］診斷性抗結核治療近 2 周，仍間斷發熱至 38.5℃。于入院第 12 天行骨髓穿刺檢查，并于入院第 17 天送檢患者外周血 mNGS 檢查。患者因血小板降低，部分有創性檢查風險較大，與家屬溝通后暫緩纖維支氣管鏡檢查、經皮肺穿刺活檢、淋巴結活檢。入院第 19 天 mNGS 結果回示查見嬰兒利什曼原蟲及杜氏利什曼原蟲特異性序列、EBV 及 CMV 特異性序列；入院第 20 天骨髓涂片示骨髓增生活躍，查見散在分布的利-杜小體。向四川省疾控中心報告，送檢外周血 rK39 試驗，結果顯示 rK39 試驗陽性，入院第 21 天證實利什曼原蟲感染當天停用抗結核藥物并開始接受葡萄糖酸銻 0.6 g、1 次/d，連續 10 d 靜脈注射治療。患者發熱逐漸緩解；針對 HIV 感染，患者要求回當地疾控中心行高效抗逆轉錄病毒治療，入院第 36 天（2021 年 9 月 18 日）出院。
討論 內臟利什曼病，也稱為黑熱病，主要由親內臟杜氏利什曼原蟲和嬰兒利什曼原蟲引起的一種人畜共患寄生蟲病。部分患者開始并無臨床癥狀，隨著寄生蟲不斷侵入單核-巨噬細胞系統，導致機體免疫功能進一步下降，可逐漸出現慢性不規則發熱、肝脾腫大、全血細胞減少、高球蛋白血癥、體重減輕等癥狀，目前我國最常用和公認的診斷標準為《黑熱病診斷標準》[1]。自新中國成立以來傳染病防治工作有效開展，全國范圍內黑熱病的發病率非常低，據統計，2011 年發病率為 0.03/10 萬[2]，但內臟利什曼病未經治療，病死率超過 90%[3]。而且這種“容易被忽視的”熱帶病缺乏特異性臨床表現，容易誤診并延誤治療，所以，早期診斷、及時治療顯得尤為重要。
當內臟利什曼病繼發/合并噬血細胞性綜合征時，病死率進一步升高。有研究中提出利什曼原蟲感染致噬血細胞性綜合征的比例被低估，在流行地區這種比例甚至更高[4]。重視對這種觸發關聯的早期診斷至關重要，它決定著治療方向，是更傾向于抗利什曼治療還是抗炎治療。
mNGS 能對 DNA 和（或）RNA 進行無偏倚檢測[5]，并且不依賴于培養、對抗菌藥物暴露影響小[6-7]。一項回顧性研究顯示，mNGS 診斷感染性疾病的靈敏度和特異度分別為 50.7%和 85.7%[6]，這表明 mNGS 技術在內臟利什曼病的診斷中具有很大的潛力。而且隨著高通量測序技術不斷發展，測序時間縮短、測序成本降低、文庫的豐度增加，使得更多臨床醫師在感染性疾病中的診療思路悄然發生了變化。
在黑熱病診斷過程中，結合癥狀、體征及流行病學史，通常還需采用常規篩查手段來確證病原體，包括培養、特異性抗體檢查、抗原檢測與分子生物學檢測、病原學檢查等。在高度懷疑黑熱病時，骨髓液、脾穿刺液接種于 NNN 培養基，22～25℃培養 7～10 d，查見活動的前鞭毛體則可確診[1]。特異性抗體檢查通常指 rK39 試驗，華西醫院通常是高度疑診黑熱病時，向四川省疾控中心進行傳染病報卡后再送檢 rK39 試驗，陽性即可確診。聚合酶鏈反應技術通常需要制備引物，這也需要臨床上高度懷疑黑熱病。病理學檢查多系侵入性檢查，有效標本可能不易獲取[7-8]，當需要作免疫組織化學染色時檢查周期更長，此外病理診斷更依賴于病理醫師豐富的經驗[9]。本文 3 例患者在常規篩查下未能快速、準確診斷黑熱病，而是在 mNGS 診斷利什曼原蟲感染后采用 rK39 試驗證實了黑熱病，分析原因可能如下：① 全國黑熱病發病率較低，主要集中于我國西部及西北部[2]，該傳染病在繁忙的臨床工作中容易被忽視，特別是在經驗不足的一線醫師中常發生，以致于未能早期送檢 rK39 試驗；② 患者 3 在艾滋病期（HIV 病毒高載量+CD4 細胞計數極低）基礎上，寄生蟲負荷此時在骨髓中較高[10]，然而患者 1 因血小板極低限制了骨髓穿刺等侵入性檢查的應用，而患者 2 多次骨髓穿刺未查見杜利小體，提示骨髓穿刺病理學檢查在診斷黑熱病時也可能存在局限；③ 患者 3 合并 HIV 病毒共感染，易繼發其他混合感染，進一步掩蓋黑熱病的臨床表現，導致診斷困難。
mNGS 在華西醫院的測序周期目前需要 2 d，極大縮短了篩查周期，為早期、快速診斷提供了技術支持，這得益于精準醫學中心提供了快速準確診斷的設備、發揮了技術支撐作用。目前 mNGS 的檢測費用在 4 000 元左右，且需要測序平臺，這在一定程度上限制了臨床大規模的使用。mNGS 目前應用于臨床診斷時間尚短，本文僅報道 3 例使用 mNGS 快速診斷內臟利什曼病病例，但仍需多中心、大規模的臨床試驗進一步驗證，以確定 NGS 在不同臨床環境中的用途及價值[11]。此外，整個測序的流程目前國際上仍缺乏統一的標準[12]，對于 mNGS 報告的解讀也缺乏權威的指南[13]，目前的研究對 mNGS 的評價褒貶不一，但從長遠來看，隨著測序技術發展，mNGS 有可能成為由少見病原體引起的復雜感染性疾病的常規診斷方法之一。
本文 3 例患者的診治過程給臨床工作帶來以下啟示：mNGS 技術在內臟利什曼病的診斷上具有較大的潛在價值，到目前為止，考慮到靈敏度、檢測周期和成本效益，mNGS 可作為傳統方法診斷黑熱病的補充。因此，推薦疑似黑熱病且合并 HIV 感染或合并噬血細胞綜合征的患者盡快采用外周血 mNGS 進行全面感染篩查。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
病例介紹 患者 1，男，47 歲，體重 55 kg，因“發熱 3 個月余”于 2020 年 12 月 28 日入住四川大學華西醫院（以下簡稱“華西醫院”）感染科。入院前 3 個月，患者無明顯誘因開始出現反復發熱，不伴咳嗽咳痰、畏寒寒顫、關節疼痛等，最高體溫 39.9℃，自行口服“退熱藥、青蒿素”（具體藥名及劑量不詳），仍間斷發熱，反復多次于華西醫院及外院就診，診斷未明。入院前 5 d，患者因再次發熱伴腹瀉、腹脹，不伴咳嗽咳痰，于外院診斷為“發熱待診、肝硬化失代償期、腎功能異常”（具體診治經過不詳），給予退熱等對癥支持治療（具體不詳）后，患者仍反復出現不規則發熱，遂于 2020 年 12 月 25 日至華西醫院急診科就診。急診科完善血常規示：血紅蛋白 83 g/L（參考值 130～175 g/L），血小板計數 16×109/L（參考值 100×109/L～300×109/L），白細胞計數 2.82×109/L（參考值 3.5×109/L～9.5×109/L），中性分葉核粒細胞百分率 84%（參考值 40%～75%），淋巴細胞絕對值 0.23×109/L（參考值 1.1×109/L～3.2×109/L），未查見嗜酸性粒細胞。凝血常規示：凝血酶時間 14 s（參考值 9.6～12.8 s），活化部分凝血酶時間 42.1 s（參考值 24.8～33.8 s），纖維蛋白原 2.43 g/L（參考值 2.0～4.0 g/L）；總膽紅素 9.0 μmol/L（參考值 5.0～28.0 μmol/L），丙氨酸氨基轉移酶 14 U/L（參考值<50 U/L），門冬氨酸氨基轉移酶 33 U/L（參考值<40 U/L），白蛋白 26.6 g/L（參考值 40～55 g/L），球蛋白 30.3 g/L（參考值 20～40 g/L），血肌酐 159 μmol/L（參考值 68～108 μmol/L），估算腎小球濾過率 43.88 mL/（min·1.73m2）［參考值 56～122 mL/（min·1.73m2）］。尿常規提示：尿蛋白定性+，亞硝酸陰性，細菌 294/μL（參考值<230/μL）尿培養提示樣本留取污染。大便常規未查見寄生蟲卵。降鈣素原 0.87 ng/mL（參考值<0.046 ng/mL）。血培養回示：耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌、表皮葡萄球菌。輸血前全套檢查［包括乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎（丙肝）病毒、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、梅毒］陰性。甲、戊肝標志物陰性。日本血吸蟲免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G 抗體、肝吸蟲抗體 IgG 檢測、包蟲病抗體 IgG 檢測、瘧原蟲抗原檢測、血涂片查瘧原蟲、隱球菌抗原檢測、真菌 1, 3-B-D 葡聚糖檢測、曲霉菌半乳甘露聚糖檢測均為陰性。結核感染 T 細胞γ干擾素釋放試驗結果判定不確定。2020 年 12 月 26 日，急診科醫師送檢患者外周血標本進行宏基因組二代測序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS），結果待回。影像學檢查：CT 胸腹部平掃示肝硬化，脾大，門脈高壓伴側支循環建立，輕度腹膜炎征象，腹盆腔散在積液，右肺中下葉及左肺上葉舌段少許炎癥，心包積液。急診考慮診斷“發熱待診、膿毒癥、肝硬化失代償期”，先后給予莫西沙星（0.5 g、1 次/d）、利奈唑胺（0.6 g、每 12 小時 1 次）抗感染，補充白蛋白，利尿，輸血小板，補液、補充電解質及能量，于 2020 年 12 月 28 日將患者轉入華西醫院感染科進一步治療。既往史：患者否認肝炎病史，6 年前診斷為“瘧疾”（診治經過不詳），自訴口服“奎寧”（具體劑量及療程不詳）后痊愈。個人史：在非洲從事廚師一職 10 余年，未至牧區，無長期酗酒史。
入院體格檢查：體溫 38.6℃，脈搏 117 次/min，呼吸 22 次/min，血壓 144/102 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），貧血貌，左手臂皮下瘀斑，雙肺未聞及明顯干、濕性啰音，肝、脾肋下未觸及，腹部腸鳴音減弱，移動性濁音陽性。
入院診斷：① 膿毒血癥。② 發熱待診：感染？其他？③ 肝硬化失代償期（脾功能亢進、腹水、凝血功能異常、低蛋白血癥）。④ 肺部感染。⑤ 腎功能不全。⑥ 電解質紊亂（低鈉、低鉀、低氯）。
診治經過及結局：入院后調整替加環素（0.05 g、每 12 小時 1 次）抗感染，輔以升白細胞、預防出血、輸注血制品、利尿、維持水電解質平衡、調節腸道菌群等對癥支持治療。繼續完善發熱相關檢查：高精度 HBV DNA 擴增陰性。大便培養未見明顯異常；大便艱難梭菌抗原檢測、艱難梭菌毒素 A/B 陰性。TORCH IgM［包括巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）抗體 IgM、風疹病毒抗體 IgM、單皰病毒抗體Ⅰ/Ⅱ型 IgM、弓形蟲抗體 IgM］均陰性。EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）DNA 擴增陰性，CMV DNA 陽性，<50 copies/mL。鐵蛋白>2 000 ng/mL（參考值 24～336 ng/mL），自身免疫抗體篩查均陰性。腫瘤標志物篩查未見明顯異常。入院后第 2 天 mNGS 結果回示：查見嬰兒利什曼原蟲及杜氏利什曼原蟲特異性序列。向四川省疾病預防控制（疾控）中心報告，送檢外周血 rK39 試驗，入院后第 3 天結果回示 rK39 試驗陽性。因血小板明顯降低（血小板計數 8×109/L），未行骨髓穿刺活檢。結合癥狀、流行病學史、體征及檢查結果，感染科修正主要診斷為“黑熱病”，并于入院后第 3 天啟動抗利什曼原蟲治療—葡萄糖酸銻鈉 1.2 g（首次劑量 0.6 g）、1 次/d，連續 8 d 靜脈注射。治療利什曼病期間，患者出現腹脹進行性加重，肺部感染持續加重，腎功能仍持續惡化，于 2021 年 1 月 11 日因呼吸衰竭死亡。
患者 2，男，15 歲，體重 60 kg，因“發熱伴咳嗽 10 余天”于 2021 年 1 月 8 日入住華西醫院感染科。入院前 10 余天，患者開始出現發熱，最高體溫 41℃，伴咳嗽，不伴關節疼痛，于當地醫院住院，考慮“① 發熱待診：感染性疾病？噬血細胞綜合征？淋巴瘤？② 脾大”（具體診治經過不詳），予頭孢哌酮舒巴坦鈉抗感染、藥物降溫等治療（具體劑量不詳）后仍每日發熱，于 2021 年 1 月 5 日就診于華西醫院急診科。急診科完善血常規：血紅蛋白 100 g/L，血小板計數 121×109/L，白細胞計數 4.68×109/L，中性分葉核粒細胞百分率 65%，淋巴細胞絕對值 1.4×109/L，嗜酸細胞絕對值 0.0×109/L（參考值 0.02×109/L～0.52×109/L）。凝血功能未見明顯異常。丙氨酸氨基轉移酶 204 U/L，門冬氨酸氨基轉移酶 176 U/L，白蛋白 39.0 g/L，球蛋白 39.8 g/L，腎功能未見明顯異常。尿常規、大便常規未見明顯異常。降鈣素原 2.11 ng/mL，C 反應蛋白 53.50 mg/L（參考值<5 mg/L），輸血前全套檢查未提示確切 HBV、丙肝病毒、HIV 、梅毒感染。TORCH IgM 均陰性。血培養未見病原微生物。2021 年 1 月 7 日急診送檢患者外周血 mNGS 檢查，結果待回。鐵蛋白>2 000 ng/mL，風濕免疫標記篩查：抗核抗體 +1:100，抗 Jo-1 抗體+，余免疫標記未見明顯異常。影像學檢查：胸部 CT 平掃示雙肺未見明顯異常，掃及脾大。腹部彩色多普勒超聲（彩超）提示脾臟長大（脾臟肋間厚 6.6 cm）。急診考慮診斷“發熱待診、輕度貧血”，急診給予頭孢曲松 2.0 g、1 次/d 經驗性抗感染治療，輔以物理降溫及藥物退熱，仍反復發熱，體溫波動于 38.5℃，于 2021 年 1 月 8 日轉入華西醫院感染科進一步治療。既往身體健康，否認肝炎、結核等病史。個人史：職業為學生，入院半年前有山西陽泉旅居史，未至牧區，無煙酒不良嗜好。
入院體格檢查：體溫 39.5℃，脈搏 122 次/min，呼吸 22 次/min，血壓 114/70 mm Hg，輕度貧血貌，雙肺未聞及明顯干濕性啰音，肝脾肋下未觸及。
入院診斷：發熱待診：感染性疾病？血液系統性疾病？其他？
診治經過及結局：入院后序貫頭孢曲松 2.0 g、1 次/d 抗感染治療，輔以保肝、升白細胞、降溫等對癥治療。同時繼續篩查發熱原因。呼吸道 13 項病毒及病原體（甲型流感病毒、腺病毒、博卡病毒、鼻病毒、甲流 H1N1、副流感病毒、衣原體、偏肺病毒、乙型流感病毒、肺炎支原體、甲流 H3N2、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒）陰性。真菌 1, 3-B-D 葡聚糖檢測、曲霉菌半乳甘露聚糖檢測均為陰性。多次血培養結果均陰性。結核菌素純蛋白衍生物皮試陰性，結核感染 T 細胞 γ 干擾素釋放試驗結果判定不確定。EBV DNA 4.11×102copies/mL，CMV DNA 陽性，<50 copies/mL。抗中性粒細胞胞漿抗體篩查陰性。白細胞介素-2 受體 6 139 U/mL（參考值 223～710 U/mL）。入院第 2 天 mNGS 結果回示查見嬰兒利什曼原蟲特異性序列及 EBV 特異性序列。向四川省疾控中心報告，送檢外周血 rK39 試驗，結果顯示 rK39 試驗陽性，證實利什曼原蟲感染。入院第 4 天（2021 年 1 月 11 日）行第 1 次骨髓穿刺，骨髓涂片未查見病原體存在。入院第 5 天啟動抗利什曼治療：葡糖糖酸銻鈉 0.6 g、1 次/d，連續 10 d 靜脈注射。患者發熱好轉、緩解，復查彩超提示脾臟回縮（脾臟肋間厚 5.1 cm）。入院第 14 天復查骨髓穿刺，于入院第 15 天（2021 年 1 月 22 日）出院。
隨訪：出院后追蹤首次骨髓穿刺病理結果：骨髓液結核桿菌 DNA 實時熒光檢測陰性。追蹤第 2 次骨髓穿刺結果，病理提示未查見病原體存在。出院后未再發熱，于 2021 年 2 月 17 日再次返院評估病情，患者精神、睡眠、食欲可，復查血常規提示貧血改善（血紅蛋白 125 g/L），復查腹部彩超提示脾臟繼續回縮（脾臟肋間厚 4.5 cm）。2021 年 2 月 18 日復查骨髓穿刺仍未查見病原體存在，評估治療后病情緩解。
患者 3，男，44 歲，體重 55 kg，因“反復發熱 1 個月余”于 2021 年 8 月 14 日于入住華西醫院傳染科。入院前 1 個月，患者受涼后出現發熱，體溫最高 40.6℃，不伴咳嗽咳痰、尿頻尿急、關節疼痛等，于當地醫院診治（具體不詳）后仍反復發熱，為明確診斷至華西醫院急診科就診。急診完善血常規：血紅蛋白 54 g/L，血小板計數 10×109/L，白細胞計數 0.87×109/L，淋巴細胞計數 0.25×109/L，嗜酸性粒細胞計數 0.0×109/L。凝血常規示：凝血酶時間 14.5 s，活化部分凝血酶時間 53.3 s，纖維蛋白原 0.97 g/L。白蛋白 26.9 g/L，球蛋白 48 g/L，降鈣素原 0.53 ng/mL，C 反應蛋白 22.2 mg/L，輸血前全套檢查：HIV 抗原抗體復合檢測 300 COI，未提示確切 HBV、丙肝病毒、梅毒感染。進一步完善高精度 HIV-Ⅰ病毒載量 1.29×105copies/mL。血培養未培養出病原微生物。胸+全腹部 CT 平掃示：右肺上葉尖段片團狀軟組織影，范圍約 2.5 cm×2.0 cm，周圍見斑片影、磨玻璃影，邊界模糊；雙肺另散在結節影，部分伴空洞，大者位于左肺上葉尖后段，長徑約 1.0 cm，上述考慮炎性/感染性病變，右肺尖病灶其他待排；雙側腋窩、縱隔淋巴結增多，縱隔淋巴結稍增大；網膜及腸系膜腫脹，部分腸壁水腫，盆腹腔少量積液，腹盆壁皮下水腫；肝脾增大，以脾臟增大明顯，腹腔及腹膜后、雙側腹股溝區淋巴結增多。急診考慮診斷：“① 發熱待診；② 獲得性免疫缺陷綜合征”，給予成分輸血、補充白蛋白、維持水電解質平衡后，建議患者于傳染病醫院繼續治療。入院前 5 d，患者因發熱伴咳嗽、咳痰再次于急診科就診，復查血常規：血紅蛋白 59 g/L，血小板計數 18×109/L，白細胞計數 0.82×109/L，淋巴細胞計數 0.23×109/L，嗜酸性粒細胞計數 0.0×109/L。白蛋白 25.3 g/L，球蛋白 52.3 g/L，降鈣素原 0.50 ng/mL，C 反應蛋白 25.5 mg/L，CD4 細胞絕對計數 12 個/μL。尿常規、大便常規未見明顯異常。多次血培養結果均陰性。TORCH IgM 均陰性。EBV DNA 1.64×102copies/mL，CMV DNA 陽性，<50 copies/mL。痰涂片查見似酵母樣菌，痰培養提示熱帶念珠菌及光滑念珠菌，真菌 1, 3-B-D 葡聚糖 60.22 pg/mL（參考值 0～95 pg/mL），曲霉菌半乳甘露聚糖 0.52 GMI（參考值<0.5 GMI）。結核感染 T 細胞γ干擾素釋放試驗結果判定陰性。腫瘤標志物篩查無明顯異常。影像學檢查：復查胸部及全腹部 CT 平掃提示右肺上葉尖段片團狀軟組織影，范圍約 3.1 cm×2.3 cm，內見空泡及鈣化，邊緣見毛刺及條索，感染性病變？腫瘤待排；心腔密度減低，心包少量積液；腹部征象較前次變化不大。急診給予美羅培南 1.0 g、每 8 小時 1 次抗感染治療后于 2021 年 8 月 14 日轉入傳染科住院繼續治療。發病后體重減輕約 10 kg。既往身體健康，否認肝炎、結核等傳染病史。個人史：原籍云南，長期于新疆喀什務農，未飼養牛羊等家畜，無吸煙史，偶爾飲酒，飲白酒約 500 g/次，有高危性行為史。
入院體格檢查：體溫 36.8℃，脈搏 92 次/min，呼吸 20 次/ min，血壓 114/76 mm Hg，貧血貌，雙肺呼吸音粗糙，未聞及明顯干、濕性啰音，肝臟肋下未觸及，脾臟肋下 2 cm，腹股溝區捫及多枚淋巴結長大。
入院診斷：① 獲得性免疫缺陷綜合征。② 肺部感染（細菌+真菌）。③ EBV 感染。④ 肝硬化失代償期？⑤ 全血細胞減少原因待查。⑥ 重度貧血。
診治經過及結局：入院后先后予以口服、靜脈滴注伏立康唑 0.2 g、每 12 小時 1 次抗真菌治療；序貫急診使用美羅培南 1.0 g、每 8 小時 1 次靜脈滴注抗感染治療；更昔洛韋 0.25 g、每 12 小時 1 次靜脈滴注抗病毒治療。期間使用升白細胞、升血小板藥物促進造血，并間斷補充血小板、人血白蛋白。患者仍反復發熱，多次血培養仍為陰性。入院后繼續完善相關檢查：隱球菌抗原滴度檢測陰性。復查真菌 1, 3-B-D 葡聚糖 71.87 pg/mL，曲霉菌半乳甘露聚糖 0.47 GMI。鐵蛋白 762 ng/mL。復查胸部 CT 提示右肺病灶較前縮小，右肺尖病灶內空洞形成，經知情同意后患者接受 HREO 方案［異煙肼（0.3 g、1 次/d 口服）+利福噴丁（0.45 g、2 次/周口服）+乙胺丁醇（0.75 g、1 次/d 口服）+左氧氟沙星（0.5 g、1 次/d 靜脈滴注）］診斷性抗結核治療近 2 周，仍間斷發熱至 38.5℃。于入院第 12 天行骨髓穿刺檢查，并于入院第 17 天送檢患者外周血 mNGS 檢查。患者因血小板降低，部分有創性檢查風險較大，與家屬溝通后暫緩纖維支氣管鏡檢查、經皮肺穿刺活檢、淋巴結活檢。入院第 19 天 mNGS 結果回示查見嬰兒利什曼原蟲及杜氏利什曼原蟲特異性序列、EBV 及 CMV 特異性序列；入院第 20 天骨髓涂片示骨髓增生活躍，查見散在分布的利-杜小體。向四川省疾控中心報告，送檢外周血 rK39 試驗，結果顯示 rK39 試驗陽性，入院第 21 天證實利什曼原蟲感染當天停用抗結核藥物并開始接受葡萄糖酸銻 0.6 g、1 次/d，連續 10 d 靜脈注射治療。患者發熱逐漸緩解；針對 HIV 感染，患者要求回當地疾控中心行高效抗逆轉錄病毒治療，入院第 36 天（2021 年 9 月 18 日）出院。
討論 內臟利什曼病，也稱為黑熱病，主要由親內臟杜氏利什曼原蟲和嬰兒利什曼原蟲引起的一種人畜共患寄生蟲病。部分患者開始并無臨床癥狀，隨著寄生蟲不斷侵入單核-巨噬細胞系統，導致機體免疫功能進一步下降，可逐漸出現慢性不規則發熱、肝脾腫大、全血細胞減少、高球蛋白血癥、體重減輕等癥狀，目前我國最常用和公認的診斷標準為《黑熱病診斷標準》[1]。自新中國成立以來傳染病防治工作有效開展，全國范圍內黑熱病的發病率非常低，據統計，2011 年發病率為 0.03/10 萬[2]，但內臟利什曼病未經治療，病死率超過 90%[3]。而且這種“容易被忽視的”熱帶病缺乏特異性臨床表現，容易誤診并延誤治療，所以，早期診斷、及時治療顯得尤為重要。
當內臟利什曼病繼發/合并噬血細胞性綜合征時，病死率進一步升高。有研究中提出利什曼原蟲感染致噬血細胞性綜合征的比例被低估，在流行地區這種比例甚至更高[4]。重視對這種觸發關聯的早期診斷至關重要，它決定著治療方向，是更傾向于抗利什曼治療還是抗炎治療。
mNGS 能對 DNA 和（或）RNA 進行無偏倚檢測[5]，并且不依賴于培養、對抗菌藥物暴露影響小[6-7]。一項回顧性研究顯示，mNGS 診斷感染性疾病的靈敏度和特異度分別為 50.7%和 85.7%[6]，這表明 mNGS 技術在內臟利什曼病的診斷中具有很大的潛力。而且隨著高通量測序技術不斷發展，測序時間縮短、測序成本降低、文庫的豐度增加，使得更多臨床醫師在感染性疾病中的診療思路悄然發生了變化。
在黑熱病診斷過程中，結合癥狀、體征及流行病學史，通常還需采用常規篩查手段來確證病原體，包括培養、特異性抗體檢查、抗原檢測與分子生物學檢測、病原學檢查等。在高度懷疑黑熱病時，骨髓液、脾穿刺液接種于 NNN 培養基，22～25℃培養 7～10 d，查見活動的前鞭毛體則可確診[1]。特異性抗體檢查通常指 rK39 試驗，華西醫院通常是高度疑診黑熱病時，向四川省疾控中心進行傳染病報卡后再送檢 rK39 試驗，陽性即可確診。聚合酶鏈反應技術通常需要制備引物，這也需要臨床上高度懷疑黑熱病。病理學檢查多系侵入性檢查，有效標本可能不易獲取[7-8]，當需要作免疫組織化學染色時檢查周期更長，此外病理診斷更依賴于病理醫師豐富的經驗[9]。本文 3 例患者在常規篩查下未能快速、準確診斷黑熱病，而是在 mNGS 診斷利什曼原蟲感染后采用 rK39 試驗證實了黑熱病，分析原因可能如下：① 全國黑熱病發病率較低，主要集中于我國西部及西北部[2]，該傳染病在繁忙的臨床工作中容易被忽視，特別是在經驗不足的一線醫師中常發生，以致于未能早期送檢 rK39 試驗；② 患者 3 在艾滋病期（HIV 病毒高載量+CD4 細胞計數極低）基礎上，寄生蟲負荷此時在骨髓中較高[10]，然而患者 1 因血小板極低限制了骨髓穿刺等侵入性檢查的應用，而患者 2 多次骨髓穿刺未查見杜利小體，提示骨髓穿刺病理學檢查在診斷黑熱病時也可能存在局限；③ 患者 3 合并 HIV 病毒共感染，易繼發其他混合感染，進一步掩蓋黑熱病的臨床表現，導致診斷困難。
mNGS 在華西醫院的測序周期目前需要 2 d，極大縮短了篩查周期，為早期、快速診斷提供了技術支持，這得益于精準醫學中心提供了快速準確診斷的設備、發揮了技術支撐作用。目前 mNGS 的檢測費用在 4 000 元左右，且需要測序平臺，這在一定程度上限制了臨床大規模的使用。mNGS 目前應用于臨床診斷時間尚短，本文僅報道 3 例使用 mNGS 快速診斷內臟利什曼病病例，但仍需多中心、大規模的臨床試驗進一步驗證，以確定 NGS 在不同臨床環境中的用途及價值[11]。此外，整個測序的流程目前國際上仍缺乏統一的標準[12]，對于 mNGS 報告的解讀也缺乏權威的指南[13]，目前的研究對 mNGS 的評價褒貶不一，但從長遠來看，隨著測序技術發展，mNGS 有可能成為由少見病原體引起的復雜感染性疾病的常規診斷方法之一。
本文 3 例患者的診治過程給臨床工作帶來以下啟示：mNGS 技術在內臟利什曼病的診斷上具有較大的潛在價值，到目前為止，考慮到靈敏度、檢測周期和成本效益，mNGS 可作為傳統方法診斷黑熱病的補充。因此，推薦疑似黑熱病且合并 HIV 感染或合并噬血細胞綜合征的患者盡快采用外周血 mNGS 進行全面感染篩查。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。