引用本文： 卿婷, 易興陽, 王淳, 曾濤, 羅華, 李作孝, 林靜, 周強. 氯吡格雷相關基因多態性與缺血性腦卒中早期神經功能惡化的相關性研究. 華西醫學, 2022, 37(6): 830-837. doi: 10.7507/1002-0179.202112086 復制
早期神經功能惡化（early neurological deterioration，END）是急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）常見并發癥，并與死亡和致殘密切相關[1-3]，闡明 END 的發病機制對預防其發生十分重要。AIS 既往研究表明，抗血小板治療是 AIS 治療的重要組成部分[4]。其中，氯吡格雷治療 AIS 的有效性和安全性得到了循證醫學的證實[5]。然而，部分接受氯吡格雷治療的患者存在有氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）[6-7]，CR 患者 AIS 復發和其他血管事件風險增加[8]。氯吡格雷相關基因多態性與 CR 和 AIS 復發獨立相關，但這些基因多態性是否在 END 發病中發揮作用還沒有闡明[9]。本研究旨在從氯吡格雷相關基因多態性水平探討 END 的發生機制，以期更好的預防或治療 END。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
連續納入 2014 年 6 月—2015 年 1 月首次發病、72 h 內入住德陽市人民醫院、溫州醫科大學第三附屬醫院和西南醫科大學附屬醫院的 AIS 患者。所有入組患者全部滿足以下所有的納入和排除標準：納入標準：① 年齡>40 歲；② 經頭部 MR 確診，改良 TOAST 分型為動脈粥樣硬化血栓形成型或小動脈病變型 AIS[10]；③ 美國國立衛生研究院卒中量表評分（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）<15 分。排除標準：① 既往有腦卒中病史；② 接受靜脈溶栓或血管內取栓術；③ 近 2 周內有使用阿司匹林或氯吡格雷以外其他的非甾體抗血小板藥和抗凝藥；④ 有家族或個人出血史或血液系統疾病；⑤ 血小板計數>450×109/L 或<100×109/L；⑥ 近期行較大外科手術或有嚴重外傷；⑦ 不愿意參加本研究。本研究通過德陽市人民醫院倫理委員會審查。
1.2 研究方法
1.2.1 資料收集
所有入組患者接受基于指南的標準化治療[11]，包括入院當日即開始服用氯吡格雷（75 mg，1 次/d）；對小卒中（NIHSS≤3 分）[12-13]患者或伴顱內動脈嚴重狹窄患者用氯吡格雷（75 mg，1 次/d）加阿司匹林（200 mg，每日頓服），3 周后改用氯吡格雷（75 mg，1 次/d）。對入組患者各種危險因素的數據進行記錄，包括既往高血壓、糖尿病、心肌梗死病史，吸煙情況，入院時的收縮壓和舒張壓及體質量指數（body mass index，BMI）等，并取入院第 2 天空腹血檢測血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白。高脂血癥定義為血清膽固醇>5.20 mmol/L 或甘油三酯>2.30 mmol/L 或正在服用降血脂藥者[1]。
1.2.2 血小板聚集率檢測
用光學比濁法測定氯吡格雷治療前和氯吡格雷治療 7～10 d 后 0.5 mmol/L 花生四烯酸（arachidonic acid，AA）或 10 μmol/L 二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導的血小板聚集率[14]。
1.2.3 研究基因位點的選擇和基因型的檢測
參考國內外既往相關研究的位點[15-17]，并登錄 NCBI 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP）最新登記的人類單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）中的氯吡格雷相關基因，設置最小等位基因頻率≥0.05，即為各基因檢測的位點，包括ABCB1（rs2032562）、CYP3A4（rs2242480）、CYP3A5（rs776746）、CYP2C9（rs1057910、rs1799853）、CYP2C8（rs1934980、rs17110453）、CYP2C19（rs4986893、rs4244285）、P2Y1（rs1371097、rs1439010、rs701265）、P2Y12（rs9859538、rs16863323）、GPⅢa（rs11871251、rs2317676） 。
采集患者入院第 2 天空腹肘靜脈血 2 mL，乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝，提取 DNA。用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法［生工生物工程（上海）股份有限公司，JMS-S3000］對各檢測基因位點進行基因分型[9]。
1.2.4 終點指標
① 主要終點：END。查閱國內外文獻，本文將 END 定義為入院后 10 d 內與入院時基線 NIHSS 評分比較增加 2 分及以上，并復查 CT 或 MRI 等檢查排除其他血管的新發 AIS、出血轉化或顱內出血所致的加重[1，11，18-20]。
② 次要終點：為入院后 10 d 內新發 AIS、心肌梗死和因心腦血管事件死亡組成的復合終點。
③ 安全終點：為入院后 10 d 內顱內外出血事件。包括：有無癥狀出血轉化、有無癥狀顱內出血（梗死灶以外部位出血）、顱外出血（包括胃腸道出血、泌尿道出血、牙齦出血、皮膚黏膜出血等）。終點事件采用盲法評估，即評估者不知曉基因型結果。
1.3 觀察指標
根據 END 發生情況，將納入患者分為發生 END 組和未發生 END 組，觀察并比較兩組患者人口學特征、既往病史、個人史、臨床資料（包括入院時 NIHSS 評分、血壓和 BMI，梗死部位和大小，病因學分型等）、住院的治療資料（包括降血壓治療、降血糖治療、他汀治療、氯吡格雷單用還是聯合阿司匹林治療等）、檢驗檢查資料（包括空腹血糖、入院時及治療 7～10 d 后 AA 和 ADP 誘導的血小板聚集率等）。
根據基因多因子降維法（generalized multifactor-dimenmonality reduction，GMDR）分析的結果，將納入患者分為高風險交互基因型組和低風險交互基因型組，觀察比較兩組患者 END 發生情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料統計描述采用均數±標準差表示，假設檢驗組間比較采用 t 檢驗；計數資料統計描述采用頻數及百分比表示，假設檢驗采用χ2 檢驗或 Fisher 確切概率法。對 16 個氯吡格雷基因多態性哈迪-溫伯格平衡檢驗采用χ2 檢驗。發生及未發 END 患者 16 種基因型比較采用χ2 檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。
采用 GMDR Beta 0.7 版軟件分析基因間交互作用[9，21]。其中，交叉檢驗一致性檢驗即是將數據隨機分成 10 等份，1 份作為檢驗集，其余作為訓練集，并進行訓練和檢驗測試，如果結果有 7 次準確率，即為 7/10，分子越大說明數據擬合度越好。訓練準確度、檢驗準確度：顯示不同數量的因子相互作用中最顯著的結果。訓練準確度表示訓練集中的準確率。檢驗準確度表示測試集中的準確率。范圍為 0～1，數值越大，準確率越高。符號檢驗是指利用正號和負號的數目進行判定的非參數方法。交叉驗證評價交互因子的作用強度，選出有統計學意義的模型（符號檢驗 P<0.05）再比較各個模型之間的交叉驗證一致性等指標，確定出該數據分析的最佳交互作用模型。同時采用 GMDR 分析最佳交互模型中不同基因型組合與 END 發生風險，用比值比（odds ratio，OR）表示。
采用多因素 Cox 比例風險模型分析原發終點發生的危險因素，用風險比（hazard ratio，HR）和 95%置信區間（confidence interval，CI）表示。由于本研究指標較多，因此進入 Cox 比例風險模型的變量為單因素分析中發生與未發 END 患者比較有統計學意義（P<0.05）的變量，采用輸入法進行分析。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 AIS 患者 END 發生情況
共納入 AIS 患者 375 例，其中男 242 例，女 133 例，平均年齡（68.59±12.63）歲。375 例患者中發生 END 95 例，發生率為 25.33%，其中入院≤1、>1且≤3、>3且≤5、>5且≤7、>7且≤10 d 發生 END 分別為 48 例（50.53%）、20 例（21.05%）、15 例（15.79%）、9 例（9.47%）、3 例（3.16%）；可見 71.58%的患者在入院 3 d 內發生 END，僅 3.16%的患者在入院 7 d 后發生 END。
2.2 發生和未發生 END 患者基線特征比較
與未發生 END 患者比較，發生 END 患者的 NIHSS 評分≤3 分比例低、入院時收縮壓偏低、氯吡格雷聯合阿司匹林比例低、糖尿病史比例高、最大梗死灶平面直徑>3 cm 者比例高、空腹血糖高、入院時及治療 7～10 d 后 AA 或 ADP 誘導的血小板聚集率高（P<0.05）；其余指標兩組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。NIHSS≤3 分組，END 發生率為 20.10%（40/199）；NIHSS 評分 4～14 分組，END 發生率為 31.25%（55/176）。氯吡格雷聯合阿司匹林組，END 發生率為 21.65%（50/231）；單用單用氯吡格雷組，END 發生率為 31.25%（45/144）。見表1。
表1
發生和未發生 END 患者的基線特征及血小板聚集率比較
2.3 氯吡格雷相關基因多態性與 END 相關性
16 個基因位點 SNP 符合哈迪-溫伯格平衡。發生 END 患者 CYP2C19*2 AG+AA（功能降低等位基因）基因型頻率分布高于未發生 END 患者（78.95% vs. 52.50%，P<0.001）。見表2。
表2
發生和未發生 END 患者基因型頻率比較［例（%）］
2.4 基因-基因交互作用與 END 相關性
GMDR 分析發現，CYP2C19*2 rs4244285、P2Y12 rs16863323 和 GPⅢa rs2317676 這 3 個基因位點存有交互作用，交叉驗證一致性為 10/10 分，符號檢驗為 9 分（P=0.019）。見表3。
表3
基因-基因交互作用的 GMDR 分析
進一步評估這 3 個基因位點各基因型組合與 END 相關性發現，與攜帶這 3 個基因位點野生基因型患者比較，發現 3 種基因型組合明顯增加了 END 的發病風險，即 CYP2C19*2 rs4244285 AA、GPⅢa rs2317676 GG 和P2Y12 rs16863323 TT［OR=2.722，95%CI（1.163，6.762），P=0.007］，CYP2C19*2 rs4244285 AA、GPⅢa rs2317676 AG+GG 和P2Y12 rs16863323 TT［OR=1.931，95%CI（1.040，4.123），P=0.037］，CYP2C19*2 rs4244285 AA、GPⅢa rs2317676 AG 和P2Y12 rs16863323 CT［OR=2.378，95% CI（1.118，5.542），P=0.026］。這 3 種基因型組合被定義為是高風險交互基因型，而其他組合被定義為低風險交互基因型。見表4。
表4
高風險交互基因位點各基因型組合與 END 相關性
2.5 高風險交互基因型與終點事件和血小板聚集相關性
攜帶高風險交互基因型患者 END 的發生率顯著升高（P<0.05），而次要終點及安全終點在兩組間比較無統計學意義（P>0.05）。同時發現，攜帶高風險交互基因型患者入院時及入院后 7～10 d 的血小板聚集更高、而血小板聚集抑制率更低（P<0.001）。見表5。
表5
高與低風險交互基因型患者血小板聚集和終點事件比較
2.6 Cox 比例風險模型分析 END 發生的預測因素
將表1、2 單因素分析中發生與未發 END 患者比較有統計學意義（P<0.05）的變量及高風險交互基因型納入 Cox 比例風險模型分析。連續型變量如入院時收縮壓、空腹血糖、AA 誘導的血小板聚集率、ADP 誘導的血小板聚集率直接帶入模型計算。分類變量賦值表見表6。
表6
END 發生的危險因素分類量表賦值表
由表7 可見，調整協變量后，CYP2C19*2 rs4244285、 P2Y12 rs16863323、 GPⅢa rs2317676 這 3 個基因位點高風險交互是 END 發生的獨立預測因素［HR=2.184，95%CI（1.472，3.238），P=0.004］。
表7
END 發生危險因素的多因素 Cox 比例風險模型分析
3 討論
本研究結果表明，AIS 后 END 的發生率高達 25.33%，這與國內外其他研究結果一致[1，3]。且入院后血糖、血小板聚集率與 END 的發生相關，因此對血糖和血小板聚集率高的患者對其盡早的進行干預，可能會降低 END 的發生。
END 發生機制復雜，目前還沒有完全闡明，探討 END 發生的基因機制是目前研究的熱點之一。本組資料 Cox 比例風險模型分析顯示，CYP2C19*2 rs4244285、 P2Y12 rs16863323、 GPⅢa rs2317676 這 3 個基因位點高風險交互作用基因型可能為 END 發生的獨立預測因子。這 3 個基因位點高風險交互增加了 END 發病的風險，但其機制尚不清楚。眾所周知，氯吡格雷是一種無活性的前體藥物，需要通過胃腸道吸收、細胞色素 P450（CYP）酶生物轉化、最后作用于血小板膜表面 P2Y12 受體才能發揮抗血小板聚集作用[22-26]，氯吡格雷反應性受其吸收、代謝活性、生物學行為和糖蛋白Ⅲa 等基因多態性的調控[27]。CYP2C19*2 功能喪失等位基因攜帶者，服用氯吡格雷后，血漿活性氯吡格雷水平低、抗血小板能力降低[27]。這與 AIS 患者卒中復發和其他血管事件的發生風險密切相關[9，28]，P2Y12 受體及其效應體（糖蛋白Ⅱb/Ⅲa）是氯吡格雷作用的靶點，與氯吡格雷的生物學變異相關[29-30]。GPⅢa 和 P2Y12 多態性是氯吡格雷反應性的獨立預測因子[31]。CYP2C19*2 rs4244285、P2Y12 rs16863323 和 GPⅢa rs2317676 基因分別編碼 CYP 酶、血小板膜 P2Y12 受體和 GPⅢa ，后三者參與調節氯吡格雷的藥物效應動力學、藥物代謝動力學和生物活性，進而影響氯吡格雷的反應性。本研究結果也顯示，與攜帶這 3 個基因位點低風險交互基因型者比較，攜帶高風險交互基因型患者入院時及治療 7～10 d 后的血小板聚集率更高、血小板聚集抑制更低。因此，可推測 CYP2C19*2 rs4244285、P2Y12 rs16863323 及 GPⅢa rs2317676 之間的高風險交互可能導致高血小板聚集率，降低氯吡格雷抗血小板聚集能力，進而增加 END 發生的風險。本研究局限：① 樣本量少，數據來源于 3 個中心，隨訪時間短；② 盡管研究了高風險交互基因型與血小板聚集之間的關系，但沒有檢測血漿氯吡格雷及其活性代謝產物水平。因此，本研究結果有待于將來多中心研究證實。
綜上所述，AIS 患者 END 發生率高，CYP2C19*2 rs4244285、P2Y12 rs16863323 和 GPⅢa rs2317676 這 3 個基因位點高風險交互可能為 END 發生的獨立預測因子。對于攜帶這 3 個基因位點高風險交互基因型患者，應該調整氯吡格雷抗血小板治療方案。本研究結果有助于指導氯吡格雷的精準治療和個體化治療，同時為針對新靶點藥物開發提供依據。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
早期神經功能惡化（early neurological deterioration，END）是急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）常見并發癥，并與死亡和致殘密切相關[1-3]，闡明 END 的發病機制對預防其發生十分重要。AIS 既往研究表明，抗血小板治療是 AIS 治療的重要組成部分[4]。其中，氯吡格雷治療 AIS 的有效性和安全性得到了循證醫學的證實[5]。然而，部分接受氯吡格雷治療的患者存在有氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）[6-7]，CR 患者 AIS 復發和其他血管事件風險增加[8]。氯吡格雷相關基因多態性與 CR 和 AIS 復發獨立相關，但這些基因多態性是否在 END 發病中發揮作用還沒有闡明[9]。本研究旨在從氯吡格雷相關基因多態性水平探討 END 的發生機制，以期更好的預防或治療 END。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
連續納入 2014 年 6 月—2015 年 1 月首次發病、72 h 內入住德陽市人民醫院、溫州醫科大學第三附屬醫院和西南醫科大學附屬醫院的 AIS 患者。所有入組患者全部滿足以下所有的納入和排除標準：納入標準：① 年齡>40 歲；② 經頭部 MR 確診，改良 TOAST 分型為動脈粥樣硬化血栓形成型或小動脈病變型 AIS[10]；③ 美國國立衛生研究院卒中量表評分（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）<15 分。排除標準：① 既往有腦卒中病史；② 接受靜脈溶栓或血管內取栓術；③ 近 2 周內有使用阿司匹林或氯吡格雷以外其他的非甾體抗血小板藥和抗凝藥；④ 有家族或個人出血史或血液系統疾病；⑤ 血小板計數>450×109/L 或<100×109/L；⑥ 近期行較大外科手術或有嚴重外傷；⑦ 不愿意參加本研究。本研究通過德陽市人民醫院倫理委員會審查。
1.2 研究方法
1.2.1 資料收集
所有入組患者接受基于指南的標準化治療[11]，包括入院當日即開始服用氯吡格雷（75 mg，1 次/d）；對小卒中（NIHSS≤3 分）[12-13]患者或伴顱內動脈嚴重狹窄患者用氯吡格雷（75 mg，1 次/d）加阿司匹林（200 mg，每日頓服），3 周后改用氯吡格雷（75 mg，1 次/d）。對入組患者各種危險因素的數據進行記錄，包括既往高血壓、糖尿病、心肌梗死病史，吸煙情況，入院時的收縮壓和舒張壓及體質量指數（body mass index，BMI）等，并取入院第 2 天空腹血檢測血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白。高脂血癥定義為血清膽固醇>5.20 mmol/L 或甘油三酯>2.30 mmol/L 或正在服用降血脂藥者[1]。
1.2.2 血小板聚集率檢測
用光學比濁法測定氯吡格雷治療前和氯吡格雷治療 7～10 d 后 0.5 mmol/L 花生四烯酸（arachidonic acid，AA）或 10 μmol/L 二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導的血小板聚集率[14]。
1.2.3 研究基因位點的選擇和基因型的檢測
參考國內外既往相關研究的位點[15-17]，并登錄 NCBI 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP）最新登記的人類單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）中的氯吡格雷相關基因，設置最小等位基因頻率≥0.05，即為各基因檢測的位點，包括ABCB1（rs2032562）、CYP3A4（rs2242480）、CYP3A5（rs776746）、CYP2C9（rs1057910、rs1799853）、CYP2C8（rs1934980、rs17110453）、CYP2C19（rs4986893、rs4244285）、P2Y1（rs1371097、rs1439010、rs701265）、P2Y12（rs9859538、rs16863323）、GPⅢa（rs11871251、rs2317676） 。
采集患者入院第 2 天空腹肘靜脈血 2 mL，乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝，提取 DNA。用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法［生工生物工程（上海）股份有限公司，JMS-S3000］對各檢測基因位點進行基因分型[9]。
1.2.4 終點指標
① 主要終點：END。查閱國內外文獻，本文將 END 定義為入院后 10 d 內與入院時基線 NIHSS 評分比較增加 2 分及以上，并復查 CT 或 MRI 等檢查排除其他血管的新發 AIS、出血轉化或顱內出血所致的加重[1，11，18-20]。
② 次要終點：為入院后 10 d 內新發 AIS、心肌梗死和因心腦血管事件死亡組成的復合終點。
③ 安全終點：為入院后 10 d 內顱內外出血事件。包括：有無癥狀出血轉化、有無癥狀顱內出血（梗死灶以外部位出血）、顱外出血（包括胃腸道出血、泌尿道出血、牙齦出血、皮膚黏膜出血等）。終點事件采用盲法評估，即評估者不知曉基因型結果。
1.3 觀察指標
根據 END 發生情況，將納入患者分為發生 END 組和未發生 END 組，觀察并比較兩組患者人口學特征、既往病史、個人史、臨床資料（包括入院時 NIHSS 評分、血壓和 BMI，梗死部位和大小，病因學分型等）、住院的治療資料（包括降血壓治療、降血糖治療、他汀治療、氯吡格雷單用還是聯合阿司匹林治療等）、檢驗檢查資料（包括空腹血糖、入院時及治療 7～10 d 后 AA 和 ADP 誘導的血小板聚集率等）。
根據基因多因子降維法（generalized multifactor-dimenmonality reduction，GMDR）分析的結果，將納入患者分為高風險交互基因型組和低風險交互基因型組，觀察比較兩組患者 END 發生情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料統計描述采用均數±標準差表示，假設檢驗組間比較采用 t 檢驗；計數資料統計描述采用頻數及百分比表示，假設檢驗采用χ2 檢驗或 Fisher 確切概率法。對 16 個氯吡格雷基因多態性哈迪-溫伯格平衡檢驗采用χ2 檢驗。發生及未發 END 患者 16 種基因型比較采用χ2 檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。
采用 GMDR Beta 0.7 版軟件分析基因間交互作用[9，21]。其中，交叉檢驗一致性檢驗即是將數據隨機分成 10 等份，1 份作為檢驗集，其余作為訓練集，并進行訓練和檢驗測試，如果結果有 7 次準確率，即為 7/10，分子越大說明數據擬合度越好。訓練準確度、檢驗準確度：顯示不同數量的因子相互作用中最顯著的結果。訓練準確度表示訓練集中的準確率。檢驗準確度表示測試集中的準確率。范圍為 0～1，數值越大，準確率越高。符號檢驗是指利用正號和負號的數目進行判定的非參數方法。交叉驗證評價交互因子的作用強度，選出有統計學意義的模型（符號檢驗 P<0.05）再比較各個模型之間的交叉驗證一致性等指標，確定出該數據分析的最佳交互作用模型。同時采用 GMDR 分析最佳交互模型中不同基因型組合與 END 發生風險，用比值比（odds ratio，OR）表示。
采用多因素 Cox 比例風險模型分析原發終點發生的危險因素，用風險比（hazard ratio，HR）和 95%置信區間（confidence interval，CI）表示。由于本研究指標較多，因此進入 Cox 比例風險模型的變量為單因素分析中發生與未發 END 患者比較有統計學意義（P<0.05）的變量，采用輸入法進行分析。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 AIS 患者 END 發生情況
共納入 AIS 患者 375 例，其中男 242 例，女 133 例，平均年齡（68.59±12.63）歲。375 例患者中發生 END 95 例，發生率為 25.33%，其中入院≤1、>1且≤3、>3且≤5、>5且≤7、>7且≤10 d 發生 END 分別為 48 例（50.53%）、20 例（21.05%）、15 例（15.79%）、9 例（9.47%）、3 例（3.16%）；可見 71.58%的患者在入院 3 d 內發生 END，僅 3.16%的患者在入院 7 d 后發生 END。
2.2 發生和未發生 END 患者基線特征比較
與未發生 END 患者比較，發生 END 患者的 NIHSS 評分≤3 分比例低、入院時收縮壓偏低、氯吡格雷聯合阿司匹林比例低、糖尿病史比例高、最大梗死灶平面直徑>3 cm 者比例高、空腹血糖高、入院時及治療 7～10 d 后 AA 或 ADP 誘導的血小板聚集率高（P<0.05）；其余指標兩組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。NIHSS≤3 分組，END 發生率為 20.10%（40/199）；NIHSS 評分 4～14 分組，END 發生率為 31.25%（55/176）。氯吡格雷聯合阿司匹林組，END 發生率為 21.65%（50/231）；單用單用氯吡格雷組，END 發生率為 31.25%（45/144）。見表1。
表1
發生和未發生 END 患者的基線特征及血小板聚集率比較
2.3 氯吡格雷相關基因多態性與 END 相關性
16 個基因位點 SNP 符合哈迪-溫伯格平衡。發生 END 患者 CYP2C19*2 AG+AA（功能降低等位基因）基因型頻率分布高于未發生 END 患者（78.95% vs. 52.50%，P<0.001）。見表2。
表2
發生和未發生 END 患者基因型頻率比較［例（%）］
2.4 基因-基因交互作用與 END 相關性
GMDR 分析發現，CYP2C19*2 rs4244285、P2Y12 rs16863323 和 GPⅢa rs2317676 這 3 個基因位點存有交互作用，交叉驗證一致性為 10/10 分，符號檢驗為 9 分（P=0.019）。見表3。
表3
基因-基因交互作用的 GMDR 分析
進一步評估這 3 個基因位點各基因型組合與 END 相關性發現，與攜帶這 3 個基因位點野生基因型患者比較，發現 3 種基因型組合明顯增加了 END 的發病風險，即 CYP2C19*2 rs4244285 AA、GPⅢa rs2317676 GG 和P2Y12 rs16863323 TT［OR=2.722，95%CI（1.163，6.762），P=0.007］，CYP2C19*2 rs4244285 AA、GPⅢa rs2317676 AG+GG 和P2Y12 rs16863323 TT［OR=1.931，95%CI（1.040，4.123），P=0.037］，CYP2C19*2 rs4244285 AA、GPⅢa rs2317676 AG 和P2Y12 rs16863323 CT［OR=2.378，95% CI（1.118，5.542），P=0.026］。這 3 種基因型組合被定義為是高風險交互基因型，而其他組合被定義為低風險交互基因型。見表4。
表4
高風險交互基因位點各基因型組合與 END 相關性
2.5 高風險交互基因型與終點事件和血小板聚集相關性
攜帶高風險交互基因型患者 END 的發生率顯著升高（P<0.05），而次要終點及安全終點在兩組間比較無統計學意義（P>0.05）。同時發現，攜帶高風險交互基因型患者入院時及入院后 7～10 d 的血小板聚集更高、而血小板聚集抑制率更低（P<0.001）。見表5。
表5
高與低風險交互基因型患者血小板聚集和終點事件比較
2.6 Cox 比例風險模型分析 END 發生的預測因素
將表1、2 單因素分析中發生與未發 END 患者比較有統計學意義（P<0.05）的變量及高風險交互基因型納入 Cox 比例風險模型分析。連續型變量如入院時收縮壓、空腹血糖、AA 誘導的血小板聚集率、ADP 誘導的血小板聚集率直接帶入模型計算。分類變量賦值表見表6。
表6
END 發生的危險因素分類量表賦值表
由表7 可見，調整協變量后，CYP2C19*2 rs4244285、 P2Y12 rs16863323、 GPⅢa rs2317676 這 3 個基因位點高風險交互是 END 發生的獨立預測因素［HR=2.184，95%CI（1.472，3.238），P=0.004］。
表7
END 發生危險因素的多因素 Cox 比例風險模型分析
3 討論
本研究結果表明，AIS 后 END 的發生率高達 25.33%，這與國內外其他研究結果一致[1，3]。且入院后血糖、血小板聚集率與 END 的發生相關，因此對血糖和血小板聚集率高的患者對其盡早的進行干預，可能會降低 END 的發生。
END 發生機制復雜，目前還沒有完全闡明，探討 END 發生的基因機制是目前研究的熱點之一。本組資料 Cox 比例風險模型分析顯示，CYP2C19*2 rs4244285、 P2Y12 rs16863323、 GPⅢa rs2317676 這 3 個基因位點高風險交互作用基因型可能為 END 發生的獨立預測因子。這 3 個基因位點高風險交互增加了 END 發病的風險，但其機制尚不清楚。眾所周知，氯吡格雷是一種無活性的前體藥物，需要通過胃腸道吸收、細胞色素 P450（CYP）酶生物轉化、最后作用于血小板膜表面 P2Y12 受體才能發揮抗血小板聚集作用[22-26]，氯吡格雷反應性受其吸收、代謝活性、生物學行為和糖蛋白Ⅲa 等基因多態性的調控[27]。CYP2C19*2 功能喪失等位基因攜帶者，服用氯吡格雷后，血漿活性氯吡格雷水平低、抗血小板能力降低[27]。這與 AIS 患者卒中復發和其他血管事件的發生風險密切相關[9，28]，P2Y12 受體及其效應體（糖蛋白Ⅱb/Ⅲa）是氯吡格雷作用的靶點，與氯吡格雷的生物學變異相關[29-30]。GPⅢa 和 P2Y12 多態性是氯吡格雷反應性的獨立預測因子[31]。CYP2C19*2 rs4244285、P2Y12 rs16863323 和 GPⅢa rs2317676 基因分別編碼 CYP 酶、血小板膜 P2Y12 受體和 GPⅢa ，后三者參與調節氯吡格雷的藥物效應動力學、藥物代謝動力學和生物活性，進而影響氯吡格雷的反應性。本研究結果也顯示，與攜帶這 3 個基因位點低風險交互基因型者比較，攜帶高風險交互基因型患者入院時及治療 7～10 d 后的血小板聚集率更高、血小板聚集抑制更低。因此，可推測 CYP2C19*2 rs4244285、P2Y12 rs16863323 及 GPⅢa rs2317676 之間的高風險交互可能導致高血小板聚集率，降低氯吡格雷抗血小板聚集能力，進而增加 END 發生的風險。本研究局限：① 樣本量少，數據來源于 3 個中心，隨訪時間短；② 盡管研究了高風險交互基因型與血小板聚集之間的關系，但沒有檢測血漿氯吡格雷及其活性代謝產物水平。因此，本研究結果有待于將來多中心研究證實。
綜上所述，AIS 患者 END 發生率高，CYP2C19*2 rs4244285、P2Y12 rs16863323 和 GPⅢa rs2317676 這 3 個基因位點高風險交互可能為 END 發生的獨立預測因子。對于攜帶這 3 個基因位點高風險交互基因型患者，應該調整氯吡格雷抗血小板治療方案。本研究結果有助于指導氯吡格雷的精準治療和個體化治療，同時為針對新靶點藥物開發提供依據。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
