引用本文： 楊明, 李鯤鵬, 宋書田, 李國靖. 重組人腦利鈉肽調控絲裂原活化蛋白激酶信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷的作用及機制. 華西醫學, 2022, 37(10): 1538-1544. doi: 10.7507/1002-0179.202109098 復制
心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是急性心肌梗死再灌注治療后常見的病理生理過程，I/R通過激活炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等加重心肌損傷，進而影響再灌注治療效果[1-2]。絲裂原活化蛋白激酶信號通路（mitogen activated protein kinase pathway，MAPK）是一族細胞內重要的信號轉導分子，包括p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）、細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）等成員，在心肌I/R損傷過程中MAPK通路的異常與炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡有關[3-4]。
腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）是心室肌在牽拉刺激下合成和釋放的心血管活性肽，具有擴張血管、利鈉利尿的作用。重組人BNP（recombinant human BNP，rh-BNP）通過基因重組技術制成，是目前治療急性失代償期心力衰竭的有效藥物，新近也有研究發現rh-BNP在急性心肌梗死[5]、心肌I/R損傷[6]中發揮治療作用。Li等[7]的細胞實驗發現，rh-BNP通過調控MAPK通路抑制脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥因子釋放，表明rh-BNP對MAPK通路具有調控作用。基于MAPK通路在心肌I/R損傷中的重要作用提出科學假設，rh-BNP可能通過調控MAPK通過減輕心肌I/R損傷。為了驗證這一假設，本研究將以大鼠為對象，分析rh-BNP調控MAPK通路減輕心肌I/R損傷的作用及機制。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選擇無特定病原體級成年雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（上海杰思捷實驗動物有限公司提供）128只；周齡8～10周，體重200～220 g；動物生產許可證號：SCXK（冀）2020-001，使用許可證號：SYXK（冀）2019-006；飼養環境為自然光照、自由飲食、飲水，溫度25℃、相對濕度50%、噪音<80 dB。動物實驗獲得滄州市中心醫院醫學倫理委員會批準。
1.2 主要材料與儀器
1.2.1 藥品與試劑
凍干rh-BNP（0.5 mg/支）為成都諾迪康生物制藥有限公司產品，陰性對照腺病毒（negative control adenovirus，Ad-NC）、過表達p38MAPK的腺病毒（p38MAPK adenovirus，Ad-p38MAPK）為上海吉凱公司產品，2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（2, 3, 5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）為美國Sigma公司產品，蛋白裂解液、蛋白BCA定量試劑盒、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）熒光法檢測試劑盒為上海碧云天公司產品，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯免疫吸附法試劑盒為上海西唐公司產品，磷酸化p38MAPK（phosphorylated p38MAPK，p-p38MAPK）、磷酸化JNK（phosphorylated JNK，p-JNK）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）及β-肌動蛋白（β-actin）的抗體為美國Sigma公司產品。
1.2.2 儀器
顯微鏡為日本Olympus公司產品，電泳系統及凝膠成像系統為上海天能公司產品。
1.3 動物分組、造模及給藥
動物實驗分為2個部分。第1部分：研究rh-BNP減輕心肌I/R損傷的作用，對SD大鼠進行編號后按照隨機數字表分為假手術（Sham）組、I/R組和I/R+rh-BNP組，每組各16只；第2部分：研究p38MAPK在rh-BNP減輕心肌I/R損傷中的作用，對SD大鼠進行編號后按照隨機數字表分為Ad-NC+Sham組、Ad-NC+I/R組、Ad-NC+I/R+rh-BNP組、Ad-p38MAPK+I/R組和Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組，每組各16只。
Sham為假手術操作，腹腔注射戊巴比妥鈉100 mg/kg麻醉，開胸后顯露心臟，打開心包膜并在左冠狀動脈前降支下穿線，但不結扎。I/R進行心肌I/R損傷造模，方法如下：腹腔注射戊巴比妥鈉100 mg/kg麻醉，開胸后顯露心臟，打開心包膜并在左冠狀動脈前降支下穿線結扎，阻斷30 min后再灌注180 min。rh-BNP給藥方法如下：I/R造模前給予rh-BNP 25 mg/kg腹腔注射，隔日1次，連續3次，末次給藥后24 h進行造模。腺病毒注射方法如下：麻醉開胸、顯露心臟后，在阻斷冠脈前腺病毒注射液（1.2×1010 TU/mL）注射在左心室游離壁上、下、左、右4個點，每點注射50 μL。
1.4 血清心肌酶含量的檢測
第1部分和第2部分動物實驗中的每組16只大鼠均在再灌注180 min時，經心尖取血3～5 mL，靜置半小時凝血后3 000轉/min 離心10 min，分離血清后采用試劑盒檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、磷酸肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）的含量。
1.5 心肌梗死面積的檢測
第1部分和第2部分動物實驗中的每組隨機選擇8只大鼠，經心尖取血后處死，迅速取出心臟，立即放入 –80℃冰凍1 h，后根據以往經驗再在切片機中將心臟切位厚度2 mm的切片、4～5片。用1%的 TTC 染色液在37℃對切片進行避光染色30 min。觀察染色情況，梗死心肌呈灰白色、未梗死心肌呈磚紅色，用數碼相機拍照并用Image J軟件分析每張切片的心肌梗死面積及全心面積，按照心肌梗死面積之和/全心面積之和×100%計算心肌梗死面積。
1.6 心肌中TNF-α、ROS含量的檢測
完成心肌梗死面積的檢測后，將第1部分和第2部分動物實驗中的每組剩余8只大鼠，經心尖取血后處死，取心肌組織適量，加入蛋白裂解液后勻漿，采用試劑盒檢測總蛋白及TNF-α、ROS的含量，計算每毫克總蛋白中TNF-α、ROS的含量。
1.7 心肌中p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2表達的蛋白質印跡法檢測
另取完成心肌中TNF-α、ROS含量的檢測中獲取的適量心肌組織，加入蛋白裂解液后勻漿，采用試劑盒檢測總蛋白含量后將含有30 μg總蛋白的樣本加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳后電轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，1∶1 000稀釋的p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2抗體或1∶5 000稀釋的β-actin抗體4℃孵育過夜，1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，最后在凝膠成像系統中顯影得到蛋白條帶，用Image J軟件計算灰度值，以β-actin灰度值為內參，計算p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2的表達水平。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計學軟件進行分析。計量資料首先進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，若差異有統計學意義則采用 LSD-t法進行兩兩比較；符合偏態分布的計量資料用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，多組間比較采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，若差異有統計學意義則采用 Wilcoxon 秩和檢驗進行兩兩比較，并采用 Bonferroni 法校正檢驗水準。計數資料采用只數表示。雙側檢驗水準α=0.05，Bonferroni法校正后的檢驗水準α’=0.05/3=0.017。
2 結果
2.1 rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠血清心肌酶的影響
與Sham組比較，I/R組大鼠血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加（P<0.05）；與I/R組比較，I/R+rh-BNP組大鼠血清中LDH、CK-MB的含量明顯降低（P<0.05）。見表1。
表1
rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠血清心肌酶的影響（n=16，
）
2.2 rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響
與Sham組比較，I/R組大鼠的心肌梗死面積明顯增大（P<0.05）；與I/R組比較，I/R+rh-BNP組大鼠的心肌梗死面積明顯縮小（P<0.05）。見圖1。
圖1
rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響（n=8）
a. 心肌的TTC染色。b. 心肌梗死面積的比較，*與Sham組比較，
2.3 rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌中TNF-α、ROS含量的影響
與Sham組比較，I/R組大鼠心肌中TNF-α、ROS的含量明顯增加（P<0.05）；與I/R組比較，I/R+rh-BNP組大鼠心肌中TNF-α、ROS的含量明顯降低（P<0.05）。見表2。
表2
rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌中TNF-α、ROS含量的影響［n=8，M（QL，QU）］
2.4 rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌中MAPK通路的影響
與Sham組比較，I/R組大鼠心肌中p-p38MAPK、p-JNK的表達水平明顯增加，p-ERK1/2的表達水平明顯降低（P<0.05）；與I/R組比較，I/R+rh-BNP組大鼠心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯降低（P<0.05），p-JNK、p-ERK1/2的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3、圖2。
圖2
蛋白質印跡法檢測3組大鼠心肌中p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2的表達（n=8）
表3
rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌中p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2表達的影響［n=8，M（QL，QU）］
2.5 局部注射腺病毒過表達p38MAPK的效果
Ad-NC+Sham組［0.67（0.60，0.72）］、Ad-NC+I/R組［1.05（0.94，1.13）］、Ad-p38MAPK+I/R組［1.48（1.33，1.59）］、Ad-NC+I/R+rh-BNP組［0.73（0.65，0.78）］、Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組［1.11（1.00，1.19）］5組間的p-p38MAPK比較，差異有統計學意義（χ2=34.385，P<0.001）。與Ad-NC+Sham組比較，Ad-NC+I/R組心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯增加（P<0.05）；與Ad-NC+I/R組比較，Ad-p38MAPK+I/R組心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯增加，Ad-NC+I/R+rh-BNP組心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯降低（P<0.05）；與Ad-NC+I/R+rh-BNP組比較，Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯增加（P<0.05）。見圖3。
圖3
蛋白質印跡法檢測5組大鼠心肌中p-p38MAPK的表達（n=8）
2.6 過表達p38MAPK對rh-BNP降低心肌I/R損傷大鼠血清心肌酶含量的影響
與Ad-NC+Sham組比較，Ad-NC+I/R組血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加（P<0.05）；與Ad-NC+I/R組比較，Ad-p38MAPK+I/R組血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加，Ad-NC+I/R+rh-BNP組血清中LDH、CK-MB的含量明顯降低（P<0.05）；與Ad-NC+I/R+rh-BNP組比較，Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加（P<0.05）。見表4。
表4
過表達p38MAPK對rh-BNP降低心肌I/R損傷大鼠血清心肌酶含量的影響（n=16，
）
2.7 過表達p38MAPK對rh-BNP縮小心肌I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響
與Ad-NC+Sham組比較，Ad-NC+I/R組的心肌梗死面積明顯增大（P<0.05）；與Ad-NC+I/R組比較，Ad-p38MAPK+I/R組的心肌梗死面積明顯增大，Ad-NC+I/R+rh-BNP組的心肌梗死面積明顯縮小（P<0.05）；與Ad-NC+I/R+rh-BNP組比較，Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組的心肌梗死面積明顯增大（P<0.05）。見圖4。
圖4
過表達p38MAPK對rh-BNP縮小心肌I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響（n=8）
a. 心肌的TTC染色。b. 心肌梗死面積的比較，*與Ad-NC+Sham組比較，
2.8 過表達p38MAPK對rh-BNP降低心肌I/R損傷大鼠心肌中TNF-α、ROS含量的影響
與Ad-NC+Sham組比較，Ad-NC+I/R組心肌中TNF-α、ROS的含量明顯增加（P<0.05）；與Ad-NC+I/R組比較，Ad-p38MAPK+I/R組心肌中TNF-α、ROS的含量明顯增加，Ad-NC+I/R+rh-BNP組心肌中TNF-α、ROS的含量明顯降低（P<0.05）；與Ad-NC+I/R+rh-BNP組比較，Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組心肌中TNF-α、ROS的含量明顯增加（P<0.05）。見表5。
表5
過表達p38MAPK對rh-BNP降低心肌I/R損傷大鼠心肌中TNF-α、ROS含量的影響［n=8，M（QL，QU）］
3 討論
BNP是用于失代償期心力衰竭診斷的標志物，心室負荷增加、心室肌擴張能夠刺激BNP大量合成及釋放[8-9]。BNP具有擴張血管、利鈉利尿的作用，其含量增加是一種代償性的自我保護機制，但卻不足以完全代償體內紊亂的神經內分泌系統，此時外源性補充BNP能夠起到治療作用[10-11]。在急性心肌梗死的發病過程中，大量心肌細胞的損傷及壞死會造成心臟收縮及舒張功能損害，進而造成心室負荷增加、心室肌擴張并增加BNP的釋放。有研究報道急性心肌梗死患者血清BNP含量明確增加且與預后有關[12-13]；另有研究報道，使用rh-BNP對急性心肌梗死患者介入治療后的心功能具有改善作用[14-15]。
心肌I/R損傷是急性心肌梗死介入治療后常見的病理生理改變，會加重心肌損傷、增加惡性心律失常及心源性猝死等危重并發癥的發生風險。因此，防治心肌I/R損傷在急性心肌梗死的治療中具有重要意義。rh-BNP已被證實能夠改善急性心肌梗死介入治療后的心功能，但rh-BNP是否直接在心肌I/R損傷過程中發揮保護作用并不清楚。本研究建立了心肌I/R損傷SD大鼠模型，在造模前給予rh-BNP后觀察到大鼠血清中心肌酶LDH、CK-MB的含量降低，心肌梗死面積縮小，表明rh-BNP能夠減輕心肌I/R損傷。
炎癥反應及氧化應激是與心肌I/R損傷密切相關的病理環節，TNF-α是重要的促炎細胞因子、能夠介導炎癥反應的級聯放大，ROS是氧化應激的重要產物、能夠介導組織的氧化應激損傷，國外多項心肌I/R損傷相關的研究及本研究均發現：I/R心肌中TNF-α及ROS的含量增加[1-4]。rh-BNP具有抗炎及抗氧化作用，有研究在急性肺損傷模型中證實rh-BNP能夠抑制肺組織中炎癥及氧化應激反應的激活[16]；孫阿林等[17]和譚力力等[18]的研究分別在心肌梗死家兔及心肌細胞缺氧復氧損傷模型中證實rh-BNP能夠抑制炎癥反應及氧化應激。本研究在心肌I/R損傷大鼠中觀察了rh-BNP的抗炎及抗氧化作用，在心肌I/R損傷造模前給予rh-BNP能夠使心肌中TNF-α及ROS的含量降低，表明rh-BNP能夠抑制I/R心肌的炎癥反應及氧化應激反應，與rh-BNP減輕心肌I/R損傷的作用吻合。
MAPK通路是細胞內調控炎癥反應、氧化應激的重要信號通路，MAPK家族包括p38MAPK、ERK1/2、JNK等成員，以磷酸化的形式發生激活并調控下游炎癥反應、氧化應激。心肌I/R損傷相關的研究證實，I/R心肌中p-p38MAPK及p-JNK表達增多、p-ERK1/2表達降低并促進炎癥反應、氧化應激[19-21]。本研究同樣發現I/R心肌中p-p38MAPK及p-JNK表達增多、p-ERK1/2表達降低，與既往其研究結果抑制；在使用rh-BNP后，I/R心肌中p-p38MAPK的表達降低，p-JNK及p-ERK1/2的表達無明顯變化，表明rh-BNP可能通過抑制p38MAPK的激活發揮心肌保護作用。為了進一步p38MAPK在rh-BNP減輕心肌I/R損傷中的作用，本研究采用腺病毒注射的方式過表達了心肌中的p38MAPK，結果發現過表達p38MAPK能夠削弱rh-BNP減輕心肌I/R損傷、縮小心肌梗死面積、降低TNF-α及ROS含量的作用，表明rh-BNP通過抑制p38MAPK激活減輕心肌I/R損傷及炎癥反應、氧化應激的激活。
綜上所述，rh-BNP具有減輕心肌I/R損傷的作用，該作用與抑制p38MAPK通路、減輕炎癥反應及氧化應激反應有關，未來rh-BNP有望成為臨床防治急性心肌梗死治療過程中心肌I/R損傷的藥物。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是急性心肌梗死再灌注治療后常見的病理生理過程，I/R通過激活炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等加重心肌損傷，進而影響再灌注治療效果[1-2]。絲裂原活化蛋白激酶信號通路（mitogen activated protein kinase pathway，MAPK）是一族細胞內重要的信號轉導分子，包括p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）、細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）等成員，在心肌I/R損傷過程中MAPK通路的異常與炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡有關[3-4]。
腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）是心室肌在牽拉刺激下合成和釋放的心血管活性肽，具有擴張血管、利鈉利尿的作用。重組人BNP（recombinant human BNP，rh-BNP）通過基因重組技術制成，是目前治療急性失代償期心力衰竭的有效藥物，新近也有研究發現rh-BNP在急性心肌梗死[5]、心肌I/R損傷[6]中發揮治療作用。Li等[7]的細胞實驗發現，rh-BNP通過調控MAPK通路抑制脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥因子釋放，表明rh-BNP對MAPK通路具有調控作用。基于MAPK通路在心肌I/R損傷中的重要作用提出科學假設，rh-BNP可能通過調控MAPK通過減輕心肌I/R損傷。為了驗證這一假設，本研究將以大鼠為對象，分析rh-BNP調控MAPK通路減輕心肌I/R損傷的作用及機制。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選擇無特定病原體級成年雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（上海杰思捷實驗動物有限公司提供）128只；周齡8～10周，體重200～220 g；動物生產許可證號：SCXK（冀）2020-001，使用許可證號：SYXK（冀）2019-006；飼養環境為自然光照、自由飲食、飲水，溫度25℃、相對濕度50%、噪音<80 dB。動物實驗獲得滄州市中心醫院醫學倫理委員會批準。
1.2 主要材料與儀器
1.2.1 藥品與試劑
凍干rh-BNP（0.5 mg/支）為成都諾迪康生物制藥有限公司產品，陰性對照腺病毒（negative control adenovirus，Ad-NC）、過表達p38MAPK的腺病毒（p38MAPK adenovirus，Ad-p38MAPK）為上海吉凱公司產品，2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（2, 3, 5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）為美國Sigma公司產品，蛋白裂解液、蛋白BCA定量試劑盒、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）熒光法檢測試劑盒為上海碧云天公司產品，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯免疫吸附法試劑盒為上海西唐公司產品，磷酸化p38MAPK（phosphorylated p38MAPK，p-p38MAPK）、磷酸化JNK（phosphorylated JNK，p-JNK）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）及β-肌動蛋白（β-actin）的抗體為美國Sigma公司產品。
1.2.2 儀器
顯微鏡為日本Olympus公司產品，電泳系統及凝膠成像系統為上海天能公司產品。
1.3 動物分組、造模及給藥
動物實驗分為2個部分。第1部分：研究rh-BNP減輕心肌I/R損傷的作用，對SD大鼠進行編號后按照隨機數字表分為假手術（Sham）組、I/R組和I/R+rh-BNP組，每組各16只；第2部分：研究p38MAPK在rh-BNP減輕心肌I/R損傷中的作用，對SD大鼠進行編號后按照隨機數字表分為Ad-NC+Sham組、Ad-NC+I/R組、Ad-NC+I/R+rh-BNP組、Ad-p38MAPK+I/R組和Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組，每組各16只。
Sham為假手術操作，腹腔注射戊巴比妥鈉100 mg/kg麻醉，開胸后顯露心臟，打開心包膜并在左冠狀動脈前降支下穿線，但不結扎。I/R進行心肌I/R損傷造模，方法如下：腹腔注射戊巴比妥鈉100 mg/kg麻醉，開胸后顯露心臟，打開心包膜并在左冠狀動脈前降支下穿線結扎，阻斷30 min后再灌注180 min。rh-BNP給藥方法如下：I/R造模前給予rh-BNP 25 mg/kg腹腔注射，隔日1次，連續3次，末次給藥后24 h進行造模。腺病毒注射方法如下：麻醉開胸、顯露心臟后，在阻斷冠脈前腺病毒注射液（1.2×1010 TU/mL）注射在左心室游離壁上、下、左、右4個點，每點注射50 μL。
1.4 血清心肌酶含量的檢測
第1部分和第2部分動物實驗中的每組16只大鼠均在再灌注180 min時，經心尖取血3～5 mL，靜置半小時凝血后3 000轉/min 離心10 min，分離血清后采用試劑盒檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、磷酸肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）的含量。
1.5 心肌梗死面積的檢測
第1部分和第2部分動物實驗中的每組隨機選擇8只大鼠，經心尖取血后處死，迅速取出心臟，立即放入 –80℃冰凍1 h，后根據以往經驗再在切片機中將心臟切位厚度2 mm的切片、4～5片。用1%的 TTC 染色液在37℃對切片進行避光染色30 min。觀察染色情況，梗死心肌呈灰白色、未梗死心肌呈磚紅色，用數碼相機拍照并用Image J軟件分析每張切片的心肌梗死面積及全心面積，按照心肌梗死面積之和/全心面積之和×100%計算心肌梗死面積。
1.6 心肌中TNF-α、ROS含量的檢測
完成心肌梗死面積的檢測后，將第1部分和第2部分動物實驗中的每組剩余8只大鼠，經心尖取血后處死，取心肌組織適量，加入蛋白裂解液后勻漿，采用試劑盒檢測總蛋白及TNF-α、ROS的含量，計算每毫克總蛋白中TNF-α、ROS的含量。
1.7 心肌中p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2表達的蛋白質印跡法檢測
另取完成心肌中TNF-α、ROS含量的檢測中獲取的適量心肌組織，加入蛋白裂解液后勻漿，采用試劑盒檢測總蛋白含量后將含有30 μg總蛋白的樣本加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳后電轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，1∶1 000稀釋的p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2抗體或1∶5 000稀釋的β-actin抗體4℃孵育過夜，1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，最后在凝膠成像系統中顯影得到蛋白條帶，用Image J軟件計算灰度值，以β-actin灰度值為內參，計算p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2的表達水平。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計學軟件進行分析。計量資料首先進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，若差異有統計學意義則采用 LSD-t法進行兩兩比較；符合偏態分布的計量資料用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，多組間比較采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，若差異有統計學意義則采用 Wilcoxon 秩和檢驗進行兩兩比較，并采用 Bonferroni 法校正檢驗水準。計數資料采用只數表示。雙側檢驗水準α=0.05，Bonferroni法校正后的檢驗水準α’=0.05/3=0.017。
2 結果
2.1 rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠血清心肌酶的影響
與Sham組比較，I/R組大鼠血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加（P<0.05）；與I/R組比較，I/R+rh-BNP組大鼠血清中LDH、CK-MB的含量明顯降低（P<0.05）。見表1。
表1
rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠血清心肌酶的影響（n=16，）
2.2 rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響
與Sham組比較，I/R組大鼠的心肌梗死面積明顯增大（P<0.05）；與I/R組比較，I/R+rh-BNP組大鼠的心肌梗死面積明顯縮小（P<0.05）。見圖1。
圖1
rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響（n=8）
a. 心肌的TTC染色。b. 心肌梗死面積的比較，*與Sham組比較，
2.3 rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌中TNF-α、ROS含量的影響
與Sham組比較，I/R組大鼠心肌中TNF-α、ROS的含量明顯增加（P<0.05）；與I/R組比較，I/R+rh-BNP組大鼠心肌中TNF-α、ROS的含量明顯降低（P<0.05）。見表2。
表2
rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌中TNF-α、ROS含量的影響［n=8，M（QL，QU）］
2.4 rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌中MAPK通路的影響
與Sham組比較，I/R組大鼠心肌中p-p38MAPK、p-JNK的表達水平明顯增加，p-ERK1/2的表達水平明顯降低（P<0.05）；與I/R組比較，I/R+rh-BNP組大鼠心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯降低（P<0.05），p-JNK、p-ERK1/2的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3、圖2。
圖2
蛋白質印跡法檢測3組大鼠心肌中p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2的表達（n=8）
表3
rh-BNP對心肌I/R損傷大鼠心肌中p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2表達的影響［n=8，M（QL，QU）］
2.5 局部注射腺病毒過表達p38MAPK的效果
Ad-NC+Sham組［0.67（0.60，0.72）］、Ad-NC+I/R組［1.05（0.94，1.13）］、Ad-p38MAPK+I/R組［1.48（1.33，1.59）］、Ad-NC+I/R+rh-BNP組［0.73（0.65，0.78）］、Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組［1.11（1.00，1.19）］5組間的p-p38MAPK比較，差異有統計學意義（χ2=34.385，P<0.001）。與Ad-NC+Sham組比較，Ad-NC+I/R組心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯增加（P<0.05）；與Ad-NC+I/R組比較，Ad-p38MAPK+I/R組心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯增加，Ad-NC+I/R+rh-BNP組心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯降低（P<0.05）；與Ad-NC+I/R+rh-BNP組比較，Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組心肌中p-p38MAPK的表達水平明顯增加（P<0.05）。見圖3。
圖3
蛋白質印跡法檢測5組大鼠心肌中p-p38MAPK的表達（n=8）
2.6 過表達p38MAPK對rh-BNP降低心肌I/R損傷大鼠血清心肌酶含量的影響
與Ad-NC+Sham組比較，Ad-NC+I/R組血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加（P<0.05）；與Ad-NC+I/R組比較，Ad-p38MAPK+I/R組血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加，Ad-NC+I/R+rh-BNP組血清中LDH、CK-MB的含量明顯降低（P<0.05）；與Ad-NC+I/R+rh-BNP組比較，Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加（P<0.05）。見表4。
表4
過表達p38MAPK對rh-BNP降低心肌I/R損傷大鼠血清心肌酶含量的影響（n=16，）
2.7 過表達p38MAPK對rh-BNP縮小心肌I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響
與Ad-NC+Sham組比較，Ad-NC+I/R組的心肌梗死面積明顯增大（P<0.05）；與Ad-NC+I/R組比較，Ad-p38MAPK+I/R組的心肌梗死面積明顯增大，Ad-NC+I/R+rh-BNP組的心肌梗死面積明顯縮小（P<0.05）；與Ad-NC+I/R+rh-BNP組比較，Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組的心肌梗死面積明顯增大（P<0.05）。見圖4。
圖4
過表達p38MAPK對rh-BNP縮小心肌I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響（n=8）
a. 心肌的TTC染色。b. 心肌梗死面積的比較，*與Ad-NC+Sham組比較，
2.8 過表達p38MAPK對rh-BNP降低心肌I/R損傷大鼠心肌中TNF-α、ROS含量的影響
與Ad-NC+Sham組比較，Ad-NC+I/R組心肌中TNF-α、ROS的含量明顯增加（P<0.05）；與Ad-NC+I/R組比較，Ad-p38MAPK+I/R組心肌中TNF-α、ROS的含量明顯增加，Ad-NC+I/R+rh-BNP組心肌中TNF-α、ROS的含量明顯降低（P<0.05）；與Ad-NC+I/R+rh-BNP組比較，Ad-p38MAPK+I/R+rh-BNP組心肌中TNF-α、ROS的含量明顯增加（P<0.05）。見表5。
表5
過表達p38MAPK對rh-BNP降低心肌I/R損傷大鼠心肌中TNF-α、ROS含量的影響［n=8，M（QL，QU）］
3 討論
BNP是用于失代償期心力衰竭診斷的標志物，心室負荷增加、心室肌擴張能夠刺激BNP大量合成及釋放[8-9]。BNP具有擴張血管、利鈉利尿的作用，其含量增加是一種代償性的自我保護機制，但卻不足以完全代償體內紊亂的神經內分泌系統，此時外源性補充BNP能夠起到治療作用[10-11]。在急性心肌梗死的發病過程中，大量心肌細胞的損傷及壞死會造成心臟收縮及舒張功能損害，進而造成心室負荷增加、心室肌擴張并增加BNP的釋放。有研究報道急性心肌梗死患者血清BNP含量明確增加且與預后有關[12-13]；另有研究報道，使用rh-BNP對急性心肌梗死患者介入治療后的心功能具有改善作用[14-15]。
心肌I/R損傷是急性心肌梗死介入治療后常見的病理生理改變，會加重心肌損傷、增加惡性心律失常及心源性猝死等危重并發癥的發生風險。因此，防治心肌I/R損傷在急性心肌梗死的治療中具有重要意義。rh-BNP已被證實能夠改善急性心肌梗死介入治療后的心功能，但rh-BNP是否直接在心肌I/R損傷過程中發揮保護作用并不清楚。本研究建立了心肌I/R損傷SD大鼠模型，在造模前給予rh-BNP后觀察到大鼠血清中心肌酶LDH、CK-MB的含量降低，心肌梗死面積縮小，表明rh-BNP能夠減輕心肌I/R損傷。
炎癥反應及氧化應激是與心肌I/R損傷密切相關的病理環節，TNF-α是重要的促炎細胞因子、能夠介導炎癥反應的級聯放大，ROS是氧化應激的重要產物、能夠介導組織的氧化應激損傷，國外多項心肌I/R損傷相關的研究及本研究均發現：I/R心肌中TNF-α及ROS的含量增加[1-4]。rh-BNP具有抗炎及抗氧化作用，有研究在急性肺損傷模型中證實rh-BNP能夠抑制肺組織中炎癥及氧化應激反應的激活[16]；孫阿林等[17]和譚力力等[18]的研究分別在心肌梗死家兔及心肌細胞缺氧復氧損傷模型中證實rh-BNP能夠抑制炎癥反應及氧化應激。本研究在心肌I/R損傷大鼠中觀察了rh-BNP的抗炎及抗氧化作用，在心肌I/R損傷造模前給予rh-BNP能夠使心肌中TNF-α及ROS的含量降低，表明rh-BNP能夠抑制I/R心肌的炎癥反應及氧化應激反應，與rh-BNP減輕心肌I/R損傷的作用吻合。
MAPK通路是細胞內調控炎癥反應、氧化應激的重要信號通路，MAPK家族包括p38MAPK、ERK1/2、JNK等成員，以磷酸化的形式發生激活并調控下游炎癥反應、氧化應激。心肌I/R損傷相關的研究證實，I/R心肌中p-p38MAPK及p-JNK表達增多、p-ERK1/2表達降低并促進炎癥反應、氧化應激[19-21]。本研究同樣發現I/R心肌中p-p38MAPK及p-JNK表達增多、p-ERK1/2表達降低，與既往其研究結果抑制；在使用rh-BNP后，I/R心肌中p-p38MAPK的表達降低，p-JNK及p-ERK1/2的表達無明顯變化，表明rh-BNP可能通過抑制p38MAPK的激活發揮心肌保護作用。為了進一步p38MAPK在rh-BNP減輕心肌I/R損傷中的作用，本研究采用腺病毒注射的方式過表達了心肌中的p38MAPK，結果發現過表達p38MAPK能夠削弱rh-BNP減輕心肌I/R損傷、縮小心肌梗死面積、降低TNF-α及ROS含量的作用，表明rh-BNP通過抑制p38MAPK激活減輕心肌I/R損傷及炎癥反應、氧化應激的激活。
綜上所述，rh-BNP具有減輕心肌I/R損傷的作用，該作用與抑制p38MAPK通路、減輕炎癥反應及氧化應激反應有關，未來rh-BNP有望成為臨床防治急性心肌梗死治療過程中心肌I/R損傷的藥物。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
