腫瘤患者液體活檢的重要檢測指標包括循環腫瘤細胞和循環腫瘤 DNA，前者即從腫瘤原發灶和轉移灶脫落后通過血管或淋巴管進入血液循環的細胞，后者即由凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放到血管中的游離 DNA。對于接受新輔助治療的乳腺癌患者，動態監測循環腫瘤細胞和循環腫瘤 DNA 有助于早期識別腫瘤患者對不同治療的反應，指導后續治療以改善預后。該文綜述了在接受新輔助治療的乳腺癌患者中檢測循環腫瘤細胞和循環腫瘤 DNA 的相關研究進展及臨床意義，旨在為循環腫瘤細胞和循環腫瘤 DNA 在乳腺癌新輔助治療中的更合理應用提供參考。
引用本文： 賀萍, 伍雁琦, 羅婷. 液體活檢在乳腺癌新輔助治療中的臨床意義. 華西醫學, 2022, 37(6): 945-950. doi: 10.7507/1002-0179.202107172 復制
研究顯示，7%～27%新診斷的乳腺癌患者接受了新輔助治療（neoadjuvant therapy，NAT）[1]，以期達到降期、保乳或了解藥物敏感情況的目的[2-3]。接受 NAT 后達到病理學完全緩解（pathologic complete response，pCR）的患者雖然預后好于未達到 pCR 的患者[4-5]，但仍有 7.1%～14.7%的患者在 5 年內出現腫瘤復發轉移[6-7]，故通過影像學和術后對病理組織的傳統評估尚不能完全滿足臨床判讀患者預后的需求。液體活檢是一系列敏感、實時的無創檢測方法，可分析從腫瘤原發灶或轉移灶釋放入血液或其他體液的腫瘤細胞或腫瘤細胞產物，有助于腫瘤早期檢測，可預測疾病復發風險及生存預后，監測療效，確定個體化治療的靶點和耐藥機制等。腫瘤患者的液體活檢檢測指標包括循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）和循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）等。2019 年，CTC 和 ctDNA 首次被寫入中國臨床腫瘤學會乳腺癌診療指南，該指南提出兩者作為循環腫瘤標志物預測早期和晚期乳腺癌預后的價值，但是并未說明其在 NAT 患者中的檢測意義[8]。本文綜述了在接受 NAT 的乳腺癌患者中，檢測 CTC 和 ctDNA 的相關研究進展及其臨床意義，旨在為 CTC 和 ctDNA 在乳腺癌 NAT 中的更合理應用提供參考。
1 CTC 在乳腺癌 NAT 中的臨床意義
CTC 指從腫瘤原發灶和轉移灶脫落并通過血管或淋巴管進入血液循環的腫瘤細胞，是腫瘤轉移的潛在來源[9-10]。目前有較多關于 CTC 的檢測方法[11]，如 CellSearch 系統是目前唯一被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床檢測 CTC 的方法，其采用免疫磁珠陽性富集的方式，計數全血中上皮來源的 CTC[12]；此外，還可通過實時熒光定量聚合酶鏈反應、逆轉錄聚合酶鏈反應等技術分析特定的 RNA 標記來反應 CTC[13-14]。不同檢測方法的靈敏度存在差異。在第 7 版美國癌癥聯合委員會腫瘤分期指南中，CTC 被作為一個新的 M 分期（遠處轉移）標準，在無臨床或影像學證據表明存在遠處轉移的乳腺癌患者中若檢測到 CTC 則列為 cM0（i+）分期，且該指南明確指出早期乳腺癌患者的 CTC≥1 個/7.5 mL 提示預后不良[15]。《中國臨床腫瘤學會（CSCO）乳腺癌診療指南 2021》[3]也指出，CTC 可作為補充手段輔助病理診斷、疾病監測、分子測序。CTC 不僅可動態監測，還可以用于判斷預后，其應用已經從計數走向了分子分型和細胞測序。目前已有較多明確證據表明 CTC 與晚期乳腺癌患者的預后相關[16-17]，CTC≥5 個/7.5 mL 提示預后不良[16]，但在接受 NAT 的早期乳腺癌患者中，CTC 與預后相關性的證據較少。
1.1 CTC 與患者臨床特征的相關性
乳腺癌患者在接受 NAT 前，其通過 CellSearch 系統檢測到的 CTC 陽性率在 25%左右[18-22]，但 CTC 計數與患者基線特征的相關性存在爭議。一項匯總分析顯示，與診斷時基線 CTC 陰性的乳腺癌患者相比，初診時 CTC 陽性患者的腫瘤更大，淋巴結受累更多，腫瘤組織學分級更高[19]。Ni 等[23]的研究也顯示 CTC 與部分臨床特征如腫瘤大小、分期、分子分型具有相關性。Bidard 等[18]的 meta 分析顯示早期乳腺癌患者（n=1 574）在接受 NAT 之前的 CTC 計數與腫瘤 T 分期顯著相關，但這主要是由于 CTC 在炎性乳腺癌患者中有更高的檢出率，在排除炎性乳腺癌患者后則無明顯相關性。但部分研究結果顯示 CTC 與原發腫瘤特征并無相關性[22, 24-27]。
1.2 CTC 與患者對 NAT 反應的相關性
CTC 計數與乳腺癌患者對 NAT 反應的相關性也存在爭議。Bidard 等[18]的 meta 分析顯示，在非炎性乳腺癌患者中，接受 NAT 前 CTC 陰性患者的 pCR 率高于陽性組（24.2% vs. 17.4%，P=0.01），而是否達到 pCR 與 CTC 計數降低無關。此外，CTC 在 pCR 患者中仍然可以檢測到[24]。多項研究顯示，接受 NAT 前后的 CTC 計數值及前后計數變化都與治療反應無明顯相關性[20, 22, 24, 28]。Kwan 等[29]的研究使用多基因 RNA 評分的方式來計算 CTC 評分，發現在接受 3 個周期的 NAT 后，CTC 信號評分升高者的術后病理檢查更可能顯示有殘留病灶。Ni 等[23]的研究則顯示在接受 NAT 后 CTC 轉陰的患者中，客觀緩解率明顯較高。而在早期乳腺癌患者中，ctDNA 和/或 CTC 的存在與否不一定是病變后續復發轉移的最佳閾值定義，還需要更多研究來進一步明確早期乳腺癌患者病變復發轉移的閾值[30]。Kaigorodova 等[31]的研究（n=27）根據 CTC 是否具有干細胞特性、上皮-間充質轉化特性將患者分為 6 個亞組，發現在接受第 3 個療程的 NAT 后，患者血液中 CTC 總計數顯著增加，而不同亞組對 NAT 的反應不同，具有干細胞特性和上皮-間充質轉化特性亞組的 CTC 計數大幅度增加。然而，CTC 計數的增減可能顯示了其進入外周血液循環的內滲、血管內死亡、外滲之間的優劣勢變化，這提示除了關注 CTC 計數，還需要考慮 NAT 對 CTC 異質性的顯著影響，因為這可能增加病變血源性轉移的風險。Mego 等[32]的研究顯示，乳腺癌患者中 NAT 對上皮-間充質轉化狀態下的 CTC 沒有作用。有趣的是，Hattori 等[33]在圍手術期從不同靜脈（外周靜脈、腫瘤引流靜脈即被切除乳腺癌組織側的胸靜脈）獲取患者血液樣本對 CTC 進行檢測，發現在接受 NAT 后未達 pCR 患者中，CTC 陽性率分別為 93.3%和 53.3%，CTC 中位數分別為 16.0 個/mL 和 1.0 個/10 mL，在接受 NAT 后達到 pCR 者中，上述指標分別為 75.0%和 50.0%、 11.0 個/mL 和 3.0 個/10 mL，提示腫瘤引流靜脈中的 CTC 陽性率和數量較外周靜脈顯著增加，考慮腫瘤引流靜脈可能更直接反映了來源于原發腫瘤的細胞，而外周靜脈除了原發部位外，還會受到其他轉移灶的影響。
1.3 CTC 與患者預后的相關性
大量研究顯示在乳腺癌患者診治過程中的不同時間節點（接受 NAT 前[21, 34]、接受 NAT 后[26, 35]、接受 NAT 前后同時[21, 25]、接受 NAT 前后之一[21, 34]或術前術后[27, 36]）的 CTC 陽性狀態[21, 25-26, 34-35]或者更多的 CTC 計數[27, 34-35]與更差的預后如無遠處轉移生存期、無病生存期（disease-free survival，DFS）、區域無復發間隔或總生存期顯著相關[20, 25-27, 35-37]。乳腺癌患者接受 NAT 后 CTC 陽性似乎與腫瘤細胞的腫瘤干細胞特征以及耐藥腫瘤細胞群體有關，這可能表明此類患者的預后更差[34]。Pierga 等[20]的研究（n=65）顯示，接受 NAT 前后 CTC 計數的變化似乎與復發轉移有關，但結果無統計學意義，可能是因為各組患者人數較少。Lucci 等[27]的研究表明，在未接受 NAT 的非轉移性乳腺癌患者中，術前血液中檢測到 1 個或多個 CTC 則預示更早復發和整體生存率降低，且隨著 CTC 數量的增加，風險也進一步增加。在非轉移性炎性乳腺癌的Ⅱ期前瞻性臨床試驗中，患者接受化學治療聯合貝伐珠單抗的 NAT 方案，結果顯示接受 NAT 前患者 CTC 陽性率為 39%，4 個周期后陽性率顯著下降至 9%，基線 CTC 陽性組的復發風險和死亡風險較陰性組顯著升高；此外，盡管 CTC 和 pCR 率無相關性，但兩者具有聯合預測的價值，基線 CTC 陰性且達到 pCR 組預后最好，而基線 CTC 陽性且未達到 pCR 組預后最差[38]，這也與 Riethdorf 等[34]的研究結果類似。另一項Ⅲ期新輔助臨床試驗納入了區域淋巴結陽性的局部晚期乳腺癌患者（n=213），結果顯示，基線 CTC 計數更高預示了更短的 DFS 和總生存期，但接受 NAT 后檢測到的 CTC 與 DFS 或總生存期無關；在三陰性乳腺癌患者中，基線 CTC 陽性提示更短的 DFS 和總生存期；在人表皮生長因子受體-2 陽性乳腺癌患者中，CTC≥2 個/7.5 mL 提示更短的 DFS[34]。Kasimir-Bauer 等[39]的研究也顯示接受 NAT 前后是否檢測到 CTC 與無進展生存期和總生存期無顯著相關性。
2 ctDNA 在乳腺癌 NAT 中的臨床意義
ctDNA 指由凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放到血管中的游離 DNA[40]。《中國臨床腫瘤學會（CSCO）乳腺癌診療指南 2021》指出 ctDNA 能反映短時間體內腫瘤負荷，實時、動態監測藥物療效，在保證較高靈敏度和特異度的同時能夠提早預測病情變化，在早期診斷、腫瘤負荷監測、藥物療效預測、復發轉移風險評估和預后分析方面發揮重要作用[3]。然而，ctDNA 的篩選存在難度，其檢測方法、標準、靈敏度也并不統一，因此目前臨床應用受限。目前有研究通過高通量測序技術或聚合酶鏈反應等技術檢測 ctDNA[41-44]，2018 年美國臨床腫瘤學會指出對于早期乳腺癌，尚沒有證據表明在臨床試驗之外，ctDNA 檢測對診斷或輔助治療有用[45]，但鑒于研究進展很快，或許不久后將需要重新評估。
2.1 ctDNA 與患者臨床特征的相關性
研究顯示，非轉移性乳腺癌患者的 ctDNA 濃度極低[42-43]，早期乳腺癌患者接受任何治療前的 ctDNA 檢出率為 40%～75%[43, 46-49]。接受 NAT 前基線 ctDNA 陽性的乳腺癌患者更有可能為雌激素受體陰性或孕激素受體陰性，但與腫瘤大小[46, 48, 50]、淋巴結狀態[48, 50]無相關性。不同分子分型患者的基線 ctDNA 陽性率不同，三陰性乳腺癌患者的 ctDNA 陽性率最高（86%），Luminal A 型乳腺癌患者最低（0%）[46]。此外，ctDNA 濃度與腫瘤大小和/或腫瘤分期顯著相關[43, 49, 51]。與 ctDNA 檢測結果陰性的患者相比，陽性患者淋巴結轉移的比例更高[47]。與接受 NAT 期間或者接受 NAT 后 ctDNA 陽性的患者相比，陰性患者的淋巴結受累個數更少[52]。但也有研究結果顯示，三陰性乳腺癌患者（n=42）在接受 NAT 前或后，ctDNA 陽性、陰性者的臨床病理學特征沒有差異[53]。
2.2 ctDNA 與患者對 NAT 反應的相關性
研究顯示，接受 NAT 前[46]、接受 NAT 期間[52]、完成 NAT 后[52]是否檢測到 ctDNA，接受 NAT 前和接受 2 個周期 NAT 后的 ctDNA 持續陽性狀態[46]，接受 NAT 后的 ctDNA 濃度水平[42, 50]，接受 NAT 前后 ctDNA 由陽轉陰的狀態[49]以及接受 NAT 前后 ctDNA 濃度水平變化程度[54]與腫瘤反應相關。但也有部分研究顯示，接受 NAT 的患者是否檢測到 ctDNA 及 ctDNA 濃度水平[43]、NAT 前后 ctDNA 由陽轉陰的狀態改變[53]與腫瘤反應無顯著相關。然而，這些研究中檢測 ctDNA 的時間點參差不齊，因此不同時間點的檢測結果與研究指標的相關性也可能不同。Riva 等[43]的前瞻性研究（n=46）通過微滴式數字聚合酶鏈反應追蹤腫瘤蛋白 TP53（tumor protein 53）突變以檢測接受 NAT 的三陰性乳腺癌患者的 ctDNA，在該研究中，接受 NAT 前基線時患者的 ctDNA 檢出率為 75%，患者在接受 NAT 前、期間、術前或術后是否檢測到 ctDNA 以及 ctDNA 水平的改變都與 pCR 無明顯相關性。Rothé 等[46]從Ⅲ期 NeoALTTO 臨床試驗中篩選出接受新輔助抗人表皮生長因子受體-2 靶向治療的人表皮生長因子受體-2 陽性的早期乳腺癌患者，通過滿足基線腫瘤樣本顯示 PIK3CA （phosphatidylino-sitol 3-kinase）和/或 TP53 突變等標準納入 69 例患者，使用微滴式數字聚合酶鏈反應技術檢測 PIK3CA 和 TP53 突變以評估 ctDNA，結果顯示接受 NAT 前、接受 NAT 后第 2 周以及術前的 ctDNA 陽性率分別為 41%、20%和 5%；接受 NAT 前 ctDNA 陰性患者的 pCR 率最高；接受 NAT 前和接受 NAT 后第 2 周時 ctDNA 持續陽性者的 pCR 率最低，但接受 2 周 NAT 后患者的 ctDNA 水平變化與 pCR 率無明顯相關[46]。McDonald 等[42]使用靶向數字測序的方法檢測完成 NAT 的乳腺癌患者（n=22）的 ctDNA，在 17 例 ctDNA 陽性者中，有 12 例未達到 pCR，5 例達到 pCR，pCR 患者的 ctDNA 濃度較未達到 pCR 患者的濃度低 5.7 倍。該研究認為結合影像學和臨床評估，ctDNA 的濃度或許可以指導個別患者的治療策略，如局部治療的選擇和程度（手術切除或放射治療），但需要更大型的臨床研究來驗證，并細化臨床相關的診斷閾值。Li 等[50]甚至發現動態監測 ctDNA 在預測患者對 NAT 的整體反應方面優于影像檢查（n=44）。Magbanua 等[49]的回顧性研究對來源于 I-SPY2 試驗[55]的接受 NAT 的高危早期乳腺癌患者（n=84）在不同時間點進行了血液樣本的檢測和分析，發現 ctDNA 陽性患者的比例隨時間的推移而下降，治療前該比例為 73%，啟用紫杉醇后 3 周時為 35%，在啟用紫杉醇與啟用蒽環類藥物之間為 14%，手術前為 9%；與啟用紫杉醇后 3 周時 ctDNA 轉陰者相比，此時保持 ctDNA 陽性的患者在接受 NAT 后未達 pCR 的比例顯著增加（52% vs. 83%），且所有達到 pCR 的患者在手術前均未檢測到 ctDNA。Takahashi 等[54]的研究納入接受 NAT 的Ⅱ～Ⅲ期乳腺癌患者（n=87），并檢測其接受 NAT 前、接受 NAT 后及術后 1 年時的甲基化 ctDNA，結果顯示在接受 NAT 前，患者的甲基化 ctDNA 陽性率（23.0%）顯著高于癌胚抗原（8.6%）和癌抗原 15-3（7.4%）的陽性率，提示甲基化 ctDNA 是比癌胚抗原和癌抗原 15-3 更敏感的腫瘤標志物，但在接受 NAT 前甲基化 ctDNA 陽性的患者中，對 NAT 有反應者的甲基化 ctDNA 水平在接受 NAT 后顯著降低，在無反應者中則未降低；令人困惑的是，在接受 NAT 前甲基化 ctDNA 陰性的患者中，對 NAT 有反應者的甲基化 ctDNA 水平在 NAT 后顯著增加，考慮可能是由于 NAT 促進腫瘤反應，從而進一步釋放了 ctDNA。
2.3 ctDNA 與患者預后的相關性
研究顯示，接受 NAT 前陽性 ctDNA 與更差的 DFS[35, 41, 50, 56]和總生存期[35, 50]顯著相關。接受 1 個周期的 NAT 后 ctDNA 陽性也與更差的 DFS、總生存期相關[43]。完成 NAT 后 ctDNA 陽性可預測顯著增加的復發風險[51, 53]、更差的無事件生存期[53]。接受 NAT 后術后陽性 ctDNA 者具有更差的 DFS[52]。Zhou 等[52]的前瞻性研究（n=32）顯示，有 7 例患者在接受 NAT 后術后 ctDNA 陽性，其中 5 例在隨訪期間發生病變遠處轉移，ctDNA 預測臨床復發的靈敏度為 71.4%。但關于 ctDNA 與患者預后相關性的結論也尚未達成一致，部分研究顯示接受 NAT 前是否檢測到 ctDNA 與總生存期、DFS[43, 48]、無事件生存期無關[46, 53]。此外，不同時間點的 ctDNA 檢測結果與患者預后的相關性也可能存在不同，Riva 等[43]的研究顯示盡管基線 ctDNA 狀態與 DFS 和總生存期無關，但在接受 1 個周期的 NAT 后檢測到 ctDNA 與更短的 DFS 和總生存期相關。Garcia-Murillas 等[56]的前瞻性、多中心臨床研究對接受 NAT 后序貫手術或是手術后序貫輔助化學治療的早期乳腺癌患者（n=101）進行隨訪，并通過數字聚合酶鏈反應動態檢測 ctDNA，發現 ctDNA 陽性與乳腺癌所有亞型的復發都相關，且與臨床復發時間相比，隨訪期間檢測到 ctDNA 的中位提前期為 10.7 個月。Ortolan 等[53]的研究（n=42）顯示，在隨訪過程中，除 1 例患者外，ctDNA 在其他非復發患者中未被檢測到；而在 11 例復發者中，8 例檢測到了 ctDNA，早于臨床診斷最長可達 13 個月。因此，分子復發檢測具有較高的臨床有效性，有必要開展臨床試驗探討是否在分子復發時立即啟動治療而無需等待發展到不治之癥時。Magbanua 等[49]的研究根據是否達到 pCR 和接受 NAT 后的術前 ctDNA 是否轉陰進行分層分析，發現未達 pCR 且 ctDNA 陽性者較 ctDNA 陰性者具有顯著更差的無遠處轉移生存期；未達 pCR 但 ctDNA 陰性者（86%）的預后則與 pCR 者相似。目前一項正在進行的Ⅱ期臨床研究對已接受標準治療的早期三陰性乳腺癌患者進行 ctDNA 監測，以指導強化治療[57]，其結果令人期待。
3 CTC 與 ctDNA 聯合分析在乳腺癌 NAT 中的臨床意義
Radovich 等[35]將Ⅱ期隨機臨床試驗 BRE12-158 中完成 NAT 后的未達 pCR 的三陰性乳腺癌女性患者作為研究對象，采集此類患者完成 NAT 后術后的血樣用于檢測 CTC（n=123）和 ctDNA（n=142），并分析其與預后的相關性，結果顯示 ctDNA 陽性預示了更差的無遠處轉移生存期、DFS 和總生存期；與 ctDNA、CTC 均為陰性組（n=31）相比，兩者均為陽性組（n=31）具有顯著更差的預后，兩組的 2 年無遠處轉移生存期分別為 89%和 52%。該研究表明 ctDNA 和 CTC 聯合預測生存結局可能是將來完成 NAT 后試驗開展的重要分層因素，亟待開展更多的相關臨床研究來說明在有分子腫瘤殘留的患者中，進行相應的治療干預是否能改善預后。
4 結語
綜上，CTC 和 ctDNA 是重要的液體活檢指標，在一定程度上可反映腫瘤負荷及生物學特性。目前較多的研究顯示接受 NAT 的乳腺癌患者的 CTC 或 ctDNA 與預后相關，但兩者與腫瘤對治療的反應的相關性爭議較大，尤其是 CTC。少量研究對 CTC、ctDNA 以及是否達到 pCR 進行了組合的分析并得到一定陽性發現，提示 CTC、ctDNA 等指標的聯合運用可能有助于更準確地監測患者的治療反應以及預測預后，為 NAT 完成后患者的復發風險分層提供了重要參考。然而，除了關注 CTC 計數，還需要考慮 NAT 對 CTC 異質性或表型的顯著影響，因為這可能增加血源性轉移的風險。此外，檢測 CTC 和 ctDNA 的時間點會影響預后的預測結果，提示應對患者進行長期的動態監測追蹤。尚待前瞻性研究來進一步驗證 CTC 或 ctDNA 在接受 NAT 乳腺癌患者中的臨床治療指導價值。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
研究顯示，7%～27%新診斷的乳腺癌患者接受了新輔助治療（neoadjuvant therapy，NAT）[1]，以期達到降期、保乳或了解藥物敏感情況的目的[2-3]。接受 NAT 后達到病理學完全緩解（pathologic complete response，pCR）的患者雖然預后好于未達到 pCR 的患者[4-5]，但仍有 7.1%～14.7%的患者在 5 年內出現腫瘤復發轉移[6-7]，故通過影像學和術后對病理組織的傳統評估尚不能完全滿足臨床判讀患者預后的需求。液體活檢是一系列敏感、實時的無創檢測方法，可分析從腫瘤原發灶或轉移灶釋放入血液或其他體液的腫瘤細胞或腫瘤細胞產物，有助于腫瘤早期檢測，可預測疾病復發風險及生存預后，監測療效，確定個體化治療的靶點和耐藥機制等。腫瘤患者的液體活檢檢測指標包括循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）和循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）等。2019 年，CTC 和 ctDNA 首次被寫入中國臨床腫瘤學會乳腺癌診療指南，該指南提出兩者作為循環腫瘤標志物預測早期和晚期乳腺癌預后的價值，但是并未說明其在 NAT 患者中的檢測意義[8]。本文綜述了在接受 NAT 的乳腺癌患者中，檢測 CTC 和 ctDNA 的相關研究進展及其臨床意義，旨在為 CTC 和 ctDNA 在乳腺癌 NAT 中的更合理應用提供參考。
1 CTC 在乳腺癌 NAT 中的臨床意義
CTC 指從腫瘤原發灶和轉移灶脫落并通過血管或淋巴管進入血液循環的腫瘤細胞，是腫瘤轉移的潛在來源[9-10]。目前有較多關于 CTC 的檢測方法[11]，如 CellSearch 系統是目前唯一被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床檢測 CTC 的方法，其采用免疫磁珠陽性富集的方式，計數全血中上皮來源的 CTC[12]；此外，還可通過實時熒光定量聚合酶鏈反應、逆轉錄聚合酶鏈反應等技術分析特定的 RNA 標記來反應 CTC[13-14]。不同檢測方法的靈敏度存在差異。在第 7 版美國癌癥聯合委員會腫瘤分期指南中，CTC 被作為一個新的 M 分期（遠處轉移）標準，在無臨床或影像學證據表明存在遠處轉移的乳腺癌患者中若檢測到 CTC 則列為 cM0（i+）分期，且該指南明確指出早期乳腺癌患者的 CTC≥1 個/7.5 mL 提示預后不良[15]。《中國臨床腫瘤學會（CSCO）乳腺癌診療指南 2021》[3]也指出，CTC 可作為補充手段輔助病理診斷、疾病監測、分子測序。CTC 不僅可動態監測，還可以用于判斷預后，其應用已經從計數走向了分子分型和細胞測序。目前已有較多明確證據表明 CTC 與晚期乳腺癌患者的預后相關[16-17]，CTC≥5 個/7.5 mL 提示預后不良[16]，但在接受 NAT 的早期乳腺癌患者中，CTC 與預后相關性的證據較少。
1.1 CTC 與患者臨床特征的相關性
乳腺癌患者在接受 NAT 前，其通過 CellSearch 系統檢測到的 CTC 陽性率在 25%左右[18-22]，但 CTC 計數與患者基線特征的相關性存在爭議。一項匯總分析顯示，與診斷時基線 CTC 陰性的乳腺癌患者相比，初診時 CTC 陽性患者的腫瘤更大，淋巴結受累更多，腫瘤組織學分級更高[19]。Ni 等[23]的研究也顯示 CTC 與部分臨床特征如腫瘤大小、分期、分子分型具有相關性。Bidard 等[18]的 meta 分析顯示早期乳腺癌患者（n=1 574）在接受 NAT 之前的 CTC 計數與腫瘤 T 分期顯著相關，但這主要是由于 CTC 在炎性乳腺癌患者中有更高的檢出率，在排除炎性乳腺癌患者后則無明顯相關性。但部分研究結果顯示 CTC 與原發腫瘤特征并無相關性[22, 24-27]。
1.2 CTC 與患者對 NAT 反應的相關性
CTC 計數與乳腺癌患者對 NAT 反應的相關性也存在爭議。Bidard 等[18]的 meta 分析顯示，在非炎性乳腺癌患者中，接受 NAT 前 CTC 陰性患者的 pCR 率高于陽性組（24.2% vs. 17.4%，P=0.01），而是否達到 pCR 與 CTC 計數降低無關。此外，CTC 在 pCR 患者中仍然可以檢測到[24]。多項研究顯示，接受 NAT 前后的 CTC 計數值及前后計數變化都與治療反應無明顯相關性[20, 22, 24, 28]。Kwan 等[29]的研究使用多基因 RNA 評分的方式來計算 CTC 評分，發現在接受 3 個周期的 NAT 后，CTC 信號評分升高者的術后病理檢查更可能顯示有殘留病灶。Ni 等[23]的研究則顯示在接受 NAT 后 CTC 轉陰的患者中，客觀緩解率明顯較高。而在早期乳腺癌患者中，ctDNA 和/或 CTC 的存在與否不一定是病變后續復發轉移的最佳閾值定義，還需要更多研究來進一步明確早期乳腺癌患者病變復發轉移的閾值[30]。Kaigorodova 等[31]的研究（n=27）根據 CTC 是否具有干細胞特性、上皮-間充質轉化特性將患者分為 6 個亞組，發現在接受第 3 個療程的 NAT 后，患者血液中 CTC 總計數顯著增加，而不同亞組對 NAT 的反應不同，具有干細胞特性和上皮-間充質轉化特性亞組的 CTC 計數大幅度增加。然而，CTC 計數的增減可能顯示了其進入外周血液循環的內滲、血管內死亡、外滲之間的優劣勢變化，這提示除了關注 CTC 計數，還需要考慮 NAT 對 CTC 異質性的顯著影響，因為這可能增加病變血源性轉移的風險。Mego 等[32]的研究顯示，乳腺癌患者中 NAT 對上皮-間充質轉化狀態下的 CTC 沒有作用。有趣的是，Hattori 等[33]在圍手術期從不同靜脈（外周靜脈、腫瘤引流靜脈即被切除乳腺癌組織側的胸靜脈）獲取患者血液樣本對 CTC 進行檢測，發現在接受 NAT 后未達 pCR 患者中，CTC 陽性率分別為 93.3%和 53.3%，CTC 中位數分別為 16.0 個/mL 和 1.0 個/10 mL，在接受 NAT 后達到 pCR 者中，上述指標分別為 75.0%和 50.0%、 11.0 個/mL 和 3.0 個/10 mL，提示腫瘤引流靜脈中的 CTC 陽性率和數量較外周靜脈顯著增加，考慮腫瘤引流靜脈可能更直接反映了來源于原發腫瘤的細胞，而外周靜脈除了原發部位外，還會受到其他轉移灶的影響。
1.3 CTC 與患者預后的相關性
大量研究顯示在乳腺癌患者診治過程中的不同時間節點（接受 NAT 前[21, 34]、接受 NAT 后[26, 35]、接受 NAT 前后同時[21, 25]、接受 NAT 前后之一[21, 34]或術前術后[27, 36]）的 CTC 陽性狀態[21, 25-26, 34-35]或者更多的 CTC 計數[27, 34-35]與更差的預后如無遠處轉移生存期、無病生存期（disease-free survival，DFS）、區域無復發間隔或總生存期顯著相關[20, 25-27, 35-37]。乳腺癌患者接受 NAT 后 CTC 陽性似乎與腫瘤細胞的腫瘤干細胞特征以及耐藥腫瘤細胞群體有關，這可能表明此類患者的預后更差[34]。Pierga 等[20]的研究（n=65）顯示，接受 NAT 前后 CTC 計數的變化似乎與復發轉移有關，但結果無統計學意義，可能是因為各組患者人數較少。Lucci 等[27]的研究表明，在未接受 NAT 的非轉移性乳腺癌患者中，術前血液中檢測到 1 個或多個 CTC 則預示更早復發和整體生存率降低，且隨著 CTC 數量的增加，風險也進一步增加。在非轉移性炎性乳腺癌的Ⅱ期前瞻性臨床試驗中，患者接受化學治療聯合貝伐珠單抗的 NAT 方案，結果顯示接受 NAT 前患者 CTC 陽性率為 39%，4 個周期后陽性率顯著下降至 9%，基線 CTC 陽性組的復發風險和死亡風險較陰性組顯著升高；此外，盡管 CTC 和 pCR 率無相關性，但兩者具有聯合預測的價值，基線 CTC 陰性且達到 pCR 組預后最好，而基線 CTC 陽性且未達到 pCR 組預后最差[38]，這也與 Riethdorf 等[34]的研究結果類似。另一項Ⅲ期新輔助臨床試驗納入了區域淋巴結陽性的局部晚期乳腺癌患者（n=213），結果顯示，基線 CTC 計數更高預示了更短的 DFS 和總生存期，但接受 NAT 后檢測到的 CTC 與 DFS 或總生存期無關；在三陰性乳腺癌患者中，基線 CTC 陽性提示更短的 DFS 和總生存期；在人表皮生長因子受體-2 陽性乳腺癌患者中，CTC≥2 個/7.5 mL 提示更短的 DFS[34]。Kasimir-Bauer 等[39]的研究也顯示接受 NAT 前后是否檢測到 CTC 與無進展生存期和總生存期無顯著相關性。
2 ctDNA 在乳腺癌 NAT 中的臨床意義
ctDNA 指由凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放到血管中的游離 DNA[40]。《中國臨床腫瘤學會（CSCO）乳腺癌診療指南 2021》指出 ctDNA 能反映短時間體內腫瘤負荷，實時、動態監測藥物療效，在保證較高靈敏度和特異度的同時能夠提早預測病情變化，在早期診斷、腫瘤負荷監測、藥物療效預測、復發轉移風險評估和預后分析方面發揮重要作用[3]。然而，ctDNA 的篩選存在難度，其檢測方法、標準、靈敏度也并不統一，因此目前臨床應用受限。目前有研究通過高通量測序技術或聚合酶鏈反應等技術檢測 ctDNA[41-44]，2018 年美國臨床腫瘤學會指出對于早期乳腺癌，尚沒有證據表明在臨床試驗之外，ctDNA 檢測對診斷或輔助治療有用[45]，但鑒于研究進展很快，或許不久后將需要重新評估。
2.1 ctDNA 與患者臨床特征的相關性
研究顯示，非轉移性乳腺癌患者的 ctDNA 濃度極低[42-43]，早期乳腺癌患者接受任何治療前的 ctDNA 檢出率為 40%～75%[43, 46-49]。接受 NAT 前基線 ctDNA 陽性的乳腺癌患者更有可能為雌激素受體陰性或孕激素受體陰性，但與腫瘤大小[46, 48, 50]、淋巴結狀態[48, 50]無相關性。不同分子分型患者的基線 ctDNA 陽性率不同，三陰性乳腺癌患者的 ctDNA 陽性率最高（86%），Luminal A 型乳腺癌患者最低（0%）[46]。此外，ctDNA 濃度與腫瘤大小和/或腫瘤分期顯著相關[43, 49, 51]。與 ctDNA 檢測結果陰性的患者相比，陽性患者淋巴結轉移的比例更高[47]。與接受 NAT 期間或者接受 NAT 后 ctDNA 陽性的患者相比，陰性患者的淋巴結受累個數更少[52]。但也有研究結果顯示，三陰性乳腺癌患者（n=42）在接受 NAT 前或后，ctDNA 陽性、陰性者的臨床病理學特征沒有差異[53]。
2.2 ctDNA 與患者對 NAT 反應的相關性
研究顯示，接受 NAT 前[46]、接受 NAT 期間[52]、完成 NAT 后[52]是否檢測到 ctDNA，接受 NAT 前和接受 2 個周期 NAT 后的 ctDNA 持續陽性狀態[46]，接受 NAT 后的 ctDNA 濃度水平[42, 50]，接受 NAT 前后 ctDNA 由陽轉陰的狀態[49]以及接受 NAT 前后 ctDNA 濃度水平變化程度[54]與腫瘤反應相關。但也有部分研究顯示，接受 NAT 的患者是否檢測到 ctDNA 及 ctDNA 濃度水平[43]、NAT 前后 ctDNA 由陽轉陰的狀態改變[53]與腫瘤反應無顯著相關。然而，這些研究中檢測 ctDNA 的時間點參差不齊，因此不同時間點的檢測結果與研究指標的相關性也可能不同。Riva 等[43]的前瞻性研究（n=46）通過微滴式數字聚合酶鏈反應追蹤腫瘤蛋白 TP53（tumor protein 53）突變以檢測接受 NAT 的三陰性乳腺癌患者的 ctDNA，在該研究中，接受 NAT 前基線時患者的 ctDNA 檢出率為 75%，患者在接受 NAT 前、期間、術前或術后是否檢測到 ctDNA 以及 ctDNA 水平的改變都與 pCR 無明顯相關性。Rothé 等[46]從Ⅲ期 NeoALTTO 臨床試驗中篩選出接受新輔助抗人表皮生長因子受體-2 靶向治療的人表皮生長因子受體-2 陽性的早期乳腺癌患者，通過滿足基線腫瘤樣本顯示 PIK3CA （phosphatidylino-sitol 3-kinase）和/或 TP53 突變等標準納入 69 例患者，使用微滴式數字聚合酶鏈反應技術檢測 PIK3CA 和 TP53 突變以評估 ctDNA，結果顯示接受 NAT 前、接受 NAT 后第 2 周以及術前的 ctDNA 陽性率分別為 41%、20%和 5%；接受 NAT 前 ctDNA 陰性患者的 pCR 率最高；接受 NAT 前和接受 NAT 后第 2 周時 ctDNA 持續陽性者的 pCR 率最低，但接受 2 周 NAT 后患者的 ctDNA 水平變化與 pCR 率無明顯相關[46]。McDonald 等[42]使用靶向數字測序的方法檢測完成 NAT 的乳腺癌患者（n=22）的 ctDNA，在 17 例 ctDNA 陽性者中，有 12 例未達到 pCR，5 例達到 pCR，pCR 患者的 ctDNA 濃度較未達到 pCR 患者的濃度低 5.7 倍。該研究認為結合影像學和臨床評估，ctDNA 的濃度或許可以指導個別患者的治療策略，如局部治療的選擇和程度（手術切除或放射治療），但需要更大型的臨床研究來驗證，并細化臨床相關的診斷閾值。Li 等[50]甚至發現動態監測 ctDNA 在預測患者對 NAT 的整體反應方面優于影像檢查（n=44）。Magbanua 等[49]的回顧性研究對來源于 I-SPY2 試驗[55]的接受 NAT 的高危早期乳腺癌患者（n=84）在不同時間點進行了血液樣本的檢測和分析，發現 ctDNA 陽性患者的比例隨時間的推移而下降，治療前該比例為 73%，啟用紫杉醇后 3 周時為 35%，在啟用紫杉醇與啟用蒽環類藥物之間為 14%，手術前為 9%；與啟用紫杉醇后 3 周時 ctDNA 轉陰者相比，此時保持 ctDNA 陽性的患者在接受 NAT 后未達 pCR 的比例顯著增加（52% vs. 83%），且所有達到 pCR 的患者在手術前均未檢測到 ctDNA。Takahashi 等[54]的研究納入接受 NAT 的Ⅱ～Ⅲ期乳腺癌患者（n=87），并檢測其接受 NAT 前、接受 NAT 后及術后 1 年時的甲基化 ctDNA，結果顯示在接受 NAT 前，患者的甲基化 ctDNA 陽性率（23.0%）顯著高于癌胚抗原（8.6%）和癌抗原 15-3（7.4%）的陽性率，提示甲基化 ctDNA 是比癌胚抗原和癌抗原 15-3 更敏感的腫瘤標志物，但在接受 NAT 前甲基化 ctDNA 陽性的患者中，對 NAT 有反應者的甲基化 ctDNA 水平在接受 NAT 后顯著降低，在無反應者中則未降低；令人困惑的是，在接受 NAT 前甲基化 ctDNA 陰性的患者中，對 NAT 有反應者的甲基化 ctDNA 水平在 NAT 后顯著增加，考慮可能是由于 NAT 促進腫瘤反應，從而進一步釋放了 ctDNA。
2.3 ctDNA 與患者預后的相關性
研究顯示，接受 NAT 前陽性 ctDNA 與更差的 DFS[35, 41, 50, 56]和總生存期[35, 50]顯著相關。接受 1 個周期的 NAT 后 ctDNA 陽性也與更差的 DFS、總生存期相關[43]。完成 NAT 后 ctDNA 陽性可預測顯著增加的復發風險[51, 53]、更差的無事件生存期[53]。接受 NAT 后術后陽性 ctDNA 者具有更差的 DFS[52]。Zhou 等[52]的前瞻性研究（n=32）顯示，有 7 例患者在接受 NAT 后術后 ctDNA 陽性，其中 5 例在隨訪期間發生病變遠處轉移，ctDNA 預測臨床復發的靈敏度為 71.4%。但關于 ctDNA 與患者預后相關性的結論也尚未達成一致，部分研究顯示接受 NAT 前是否檢測到 ctDNA 與總生存期、DFS[43, 48]、無事件生存期無關[46, 53]。此外，不同時間點的 ctDNA 檢測結果與患者預后的相關性也可能存在不同，Riva 等[43]的研究顯示盡管基線 ctDNA 狀態與 DFS 和總生存期無關，但在接受 1 個周期的 NAT 后檢測到 ctDNA 與更短的 DFS 和總生存期相關。Garcia-Murillas 等[56]的前瞻性、多中心臨床研究對接受 NAT 后序貫手術或是手術后序貫輔助化學治療的早期乳腺癌患者（n=101）進行隨訪，并通過數字聚合酶鏈反應動態檢測 ctDNA，發現 ctDNA 陽性與乳腺癌所有亞型的復發都相關，且與臨床復發時間相比，隨訪期間檢測到 ctDNA 的中位提前期為 10.7 個月。Ortolan 等[53]的研究（n=42）顯示，在隨訪過程中，除 1 例患者外，ctDNA 在其他非復發患者中未被檢測到；而在 11 例復發者中，8 例檢測到了 ctDNA，早于臨床診斷最長可達 13 個月。因此，分子復發檢測具有較高的臨床有效性，有必要開展臨床試驗探討是否在分子復發時立即啟動治療而無需等待發展到不治之癥時。Magbanua 等[49]的研究根據是否達到 pCR 和接受 NAT 后的術前 ctDNA 是否轉陰進行分層分析，發現未達 pCR 且 ctDNA 陽性者較 ctDNA 陰性者具有顯著更差的無遠處轉移生存期；未達 pCR 但 ctDNA 陰性者（86%）的預后則與 pCR 者相似。目前一項正在進行的Ⅱ期臨床研究對已接受標準治療的早期三陰性乳腺癌患者進行 ctDNA 監測，以指導強化治療[57]，其結果令人期待。
3 CTC 與 ctDNA 聯合分析在乳腺癌 NAT 中的臨床意義
Radovich 等[35]將Ⅱ期隨機臨床試驗 BRE12-158 中完成 NAT 后的未達 pCR 的三陰性乳腺癌女性患者作為研究對象，采集此類患者完成 NAT 后術后的血樣用于檢測 CTC（n=123）和 ctDNA（n=142），并分析其與預后的相關性，結果顯示 ctDNA 陽性預示了更差的無遠處轉移生存期、DFS 和總生存期；與 ctDNA、CTC 均為陰性組（n=31）相比，兩者均為陽性組（n=31）具有顯著更差的預后，兩組的 2 年無遠處轉移生存期分別為 89%和 52%。該研究表明 ctDNA 和 CTC 聯合預測生存結局可能是將來完成 NAT 后試驗開展的重要分層因素，亟待開展更多的相關臨床研究來說明在有分子腫瘤殘留的患者中，進行相應的治療干預是否能改善預后。
4 結語
綜上，CTC 和 ctDNA 是重要的液體活檢指標，在一定程度上可反映腫瘤負荷及生物學特性。目前較多的研究顯示接受 NAT 的乳腺癌患者的 CTC 或 ctDNA 與預后相關，但兩者與腫瘤對治療的反應的相關性爭議較大，尤其是 CTC。少量研究對 CTC、ctDNA 以及是否達到 pCR 進行了組合的分析并得到一定陽性發現，提示 CTC、ctDNA 等指標的聯合運用可能有助于更準確地監測患者的治療反應以及預測預后，為 NAT 完成后患者的復發風險分層提供了重要參考。然而，除了關注 CTC 計數，還需要考慮 NAT 對 CTC 異質性或表型的顯著影響，因為這可能增加血源性轉移的風險。此外，檢測 CTC 和 ctDNA 的時間點會影響預后的預測結果，提示應對患者進行長期的動態監測追蹤。尚待前瞻性研究來進一步驗證 CTC 或 ctDNA 在接受 NAT 乳腺癌患者中的臨床治療指導價值。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。