膠原酶能促進創面愈合，其作用依賴于膠原酶對壞死組織降解作用及產生的膠原蛋白降解產物，可能作用機制包括加速再上皮化、促進創面肉芽組織和血管形成、調節炎癥反應等。目前，臨床研究結果顯示膠原酶與機械清創或負壓吸引聯用能顯著促進糖尿病足潰瘍愈合，療效與水凝膠及銀離子敷料相近。膠原酶能夠促進糖尿病足潰瘍修復，但其效果受到多種因素的影響，仍需大樣本多中心隨機對照試驗探討其療效和合適的使用條件。該文從機制及臨床效果方面闡述了膠原酶是治療糖尿病足潰瘍的選擇之一。
引用本文： 孫世怡, 冉興無. 膠原酶治療糖尿病足潰瘍的研究進展. 華西醫學, 2021, 36(4): 510-513. doi: 10.7507/1002-0179.202103019 復制
糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者的嚴重并發癥之一，約 20% 的糖尿病患者一生中會至少發生 1 次 DFU。與其他原因所致足潰瘍相比，DFU 截肢風險極高，占非創傷性截肢的 40%～70%[1]。DFU 創面壞死組織是影響創面愈合的重要因素，一方面壞死組織自溶后形成的毒素會被組織局部吸收并形成細菌培養基；另一方面，壞死組織會影響創面組織血管生成，從而阻礙肉芽組織的形成及上皮組織再生[2]。清創術是指在不損害或較少損害存活組織的情況下將壞死組織從創面清除的過程，其作用包括但不僅限于[3]：減少壞死組織產生的炎性細胞因子和金屬蛋白酶；解除炎癥產物對角質形成細胞的抑制，促進角質形成細胞 DNA 合成與生長；減少與創面壞死組織相關的細菌負荷。常用的清創方法包括生物、機械、自溶、手術和酶清創術等[4]。酶法清創是將外源酶應用于創面后使失活組織通過降解作用降解，從而達到清除失活組織的目的。有的酶類可能存在清創不徹底或過度清創而損傷存活組織的缺點，而溶組織梭菌來源的膠原酶具有高選擇性，是唯一被美國食品和藥物管理局批準的酶清創軟膏的活性成分[5]。系列臨床研究顯示膠原酶可以促進 DFU 愈合，提示其有望成為 DFU 的輔助治療手段之一[6]。現將膠原酶治療慢性創面的機制及其在 DFU 中的應用進行總結，為今后優化 DFU 的治療方案提供參考。
1 膠原酶治療創面的機制
DFU 以壞死組織為基礎，其細胞碎片嵌在由Ⅰ型和Ⅲ型膠原、糖蛋白和蛋白多糖組成的細胞外基質中[6]。壞死組織通過變性膠原束固定在傷口上阻礙肉芽組織形成，導致創面無法形成再上皮化所需平臺[7]。細菌膠原酶是一種具有高度特異性的蛋白酶，其只能識別少數肽序列并將人變性膠原的三螺旋區域水解，去除壞死組織[6]。研究表明膠原酶比木瓜蛋白酶（酶清創中常用酶之一）具有更高的膠原溶解活性和更低的彈性蛋白和纖維蛋白溶解活性，這種高特異性減少了創面出血風險及對周圍組織的潛在傷害[5]。
體外和體內研究均表明，被細菌膠原酶降解的人焦痂碎片能刺激人成纖維細胞增殖并對巨噬細胞有趨化作用[8]；進一步研究發現其降解產生的二肽和三肽還可以促進人成纖維細胞向創面中心移動，且依賴于肽鏈中的羥脯氨酸[9]。Laskin 等[10]證實羥脯氨酸并非促進中性粒細胞趨化的膠原酶降解多肽片段所必須。體外研究發現在角質形成細胞培養基中加入膠原酶后角質形成細胞的遷移速度和增殖能力提高了 5 倍[11]；溶組織梭菌來源的膠原酶降解細胞外基質后可以產生高（120×103）、中（45×103～50×103 和 80×103）、低（35×103）相對分子質量的多肽；其中 Col4-1、Fibr2、Ten1 和 Comb1 片段能促進內皮細胞的增殖；Col4-1、Col4-2、Fibr2、Fibr3、Ten2、Ten4 和 Comb1 片段能促進血管形成，又以 Col4-1、Ten2 和 Comb1 的作用最為顯著[11]。
炎癥反應是創面愈合的重要環節， 在 Th1 細胞因子的介導下巨噬細胞向 M1 極化，發揮著促炎功能；相反地，在 Th2 細胞因子的介導下出現 M2 極化，表現出抗炎、促進組織修復再生的作用。Galperin 等[12]發現膠原酶治療 DFU 患者 2～4 周后創面滲出物中的促炎因子如白細胞介素（interleukin，IL）-6 和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）表達減少，體外試驗證實膠原酶降解產物可以抑制巨噬細胞 M1 極化從而減少 IL-6 和 TNF-α 的產生。Das 等[13]認為膠原酶分別通過激活IL-4/IL-4 受體 α/酪氨酸激酶/信號轉換器和轉錄激活器 6 和前列腺素 E2/前列腺素 E 受體 4/環磷酸腺苷/環磷酸腺苷效應元件結合蛋白/信號轉換器和轉錄激活器 6 途徑促進巨噬細胞向 M2 極化從而增加抑炎因子 IL-10 和轉化生長因子 β 的產生；另外膠原酶還通過抑制微小 RNA-21/人第 10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的蛋白/糖原合成酶激酶 3 β/核因子 κB 通路進而抑制巨噬細胞向 M1 極化，減少炎性因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 和一氧化氮合酶 2 的產生[14]。
2 膠原酶治療 DFU 的療效
有研究顯示，每日 1 次在慢性創面表面上涂抹 2 mm 厚的膠原酶軟膏（創面面積越大，所需的膠原酶軟膏越多），膠原酶組（n=24）治療 1 周后潰瘍開始改善，而生理鹽水紗布組（n=24）在 2 周時才顯示出療效。在治療 4 周內，膠原酶組每周的傷口總評分和滲液評分與生理鹽水紗布組相比，差異無統計學意義；但在膠原酶治療第 4 周和治療結束后第 8 周潰瘍面積分別縮小 44.9% 與 53.8%，生理鹽水紗布組反而增加 0.78% 與 8.13%；不僅如此，在治療結束后第 8 周膠原酶組中潰瘍無改善和中度改善的患者分別為 1 例和 6 例，生理鹽水紗布組分別為 5 例與 1 例，兩者比較差異均有統計學意義（P<0.05）[15]。
Motley 等[16]每日 1 次在慢性創面表面上涂抹 2 mm 厚的膠原酶與機械清創聯合（聯合治療組，n=28）用于治療 DFU，結果顯示與單純機械清創組（n=27）相比，聯合治療組在治療 6 周后潰瘍面積與基線值相比縮小 68%（P<0.001），而單純機械清創組只縮小了 33%（P=0.31）；治療結束后第 6 周隨訪時聯合治療組仍表現出優勢，且 1 年內預期上皮化周數（1 年內維持完全愈合狀態的周數）比單純機械清創組增加 25%。Galperin 等[12]比較了每日 1 次在慢性創面表面上涂抹 2 mm 厚的膠原酶軟膏（n=9）與水凝膠敷料（n=8）治療瓦格納（Wagner）分級為 1～2 級 DFU 的療效，結果顯示治療 4 周后兩者的潰瘍縮小面積、滲液評分沒有明顯差異。Jimenez 等[17]進一步證實了在創面上涂抹 2 mm 的膠原酶軟膏（n=106）和水凝膠敷料（n=109）治療 6 周和 12 周時潰瘍縮小面積（P=0.3801，0.3606）、愈合率（P=0.3705，0.2358）和需要機械清創的次數無明顯差異，但膠原酶治療 1 周后潰瘍明顯改善，水凝膠則需要 2 周，而且水凝膠組感染發生率大于膠原酶組（13.8% vs. 8.5%）。研究顯示每日 1 次在創面上涂抹 2 mm 的膠原酶軟膏（n=51）或給予銀離子敷料（n=51）治療 6 周后潰瘍面積明顯縮小，兩者差異無統計學意義（P=0.071）；且膠原酶治療組的潰瘍感染發生率與銀離子組相似（P=0.208）[18]。有學者將負壓吸引與膠原酶聯合治療 5 例 Wagner 分級為 3 級和 1 例 Wagner 分級為 4 級的截肢術后患者，1 個月后所有潰瘍均出現明顯的肉芽組織生長甚至愈合[19]。Lantis 等[6]研究了膠原酶治療 DFU 的 4 篇隨機對照試驗并總結出膠原酶在 DFU 人群中使用的最佳臨床標準：初次機械清創術后的 4～6 周應每天應用膠原酶；對于具有大量壞死碎片的潰瘍，膠原酶聯合每周 1 次機械清創術可以獲得更好療效。對于愈合十分緩慢甚至停止的潰瘍以及面積>2 cm2和位于足底表面的潰瘍，使用膠原酶治療能更好的獲益。
3 不良反應及注意事項
過敏是膠原酶最常發生的不良反應，研究顯示將膠原酶用于傷口周圍時可能會出現瘙癢、灼燒感、水腫及皮疹，最嚴重的 1 例患者在膠原酶治療后發生了需激素治療的全身過敏反應[20-23]。當患者發生過敏反應時可用聚維酮碘清洗創面使酶失活；此外，膠原酶治療時可能會出現過度的肉芽組織增生影響創緣上皮爬行，此時可應用硝酸銀燒灼治療[24]；蜂窩織炎也是膠原酶的不良反應之一，因此對于全身狀態較差的患者應密切監測感染情況[25]。
臨床上大多采用每日 1 次 2 mm 厚膠原酶軟膏治療創面，如果滲液較多應及時增加頻次。Burgos 等[26]將膠原酶用于治療 86 例 3 級壓瘡患者時發現當肉芽組織覆蓋了 11%～30% 的潰瘍床時每日 1 次和每 2 日 1 次的膠原酶軟膏效果無明顯差異（P=0.451）；膠原酶最合適的 pH 值范圍為 6～8，較高或較低的 pH 值都會降低酶活性；另外，酶活性也會受到金屬離子的影響，重金屬如銀離子、二價鐵離子和鎳離子會抑制膠原酶活性，輕金屬離子如鈉離子、鉀離子和鎂離子能提高膠原酶活性[5]。在使用膠原酶之前應用生理鹽水沖洗掉創面壞死組織碎片；如果創面存在局部感染，應全身使用抗菌藥物抗感染，待感染得到基本控制后再使用膠原酶軟膏；如果創面感染未緩解或者加重，應停止使用膠原酶軟膏，直到感染緩解；當壞死組織被完全清除，肉芽組織生長良好時，應終止使用膠原酶軟膏[20]。研究顯示聚乙烯醇及膠原敷料對膠原酶有促進作用，濕性創面優于干燥創面，而含碘敷料與含銀敷料對膠原酶具有抑制作用，臨床上應避免混合使用[5]。
4 展望
膠原酶通過自身及其膠原降解產物發揮促進潰瘍愈合作用，在選擇性去除壞死組織的同時也起到抗炎、促進成纖維細胞和角質形成細胞增殖及血管再生作用。上述臨床研究表明每日 1 次膠原酶軟膏能有效促進 DFU 愈合，其嚴重不良反應較罕見，提示其可以作為治療 DFU 的輔助手段之一。然而，膠原酶的清創活性受到創面敷料的影響，選擇合適的創面敷料以保證最佳活性非常重要。因此仍需更多的基礎和臨床試驗進一步明確其作用機制、使用條件與標準化流程。
糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者的嚴重并發癥之一，約 20% 的糖尿病患者一生中會至少發生 1 次 DFU。與其他原因所致足潰瘍相比，DFU 截肢風險極高，占非創傷性截肢的 40%～70%[1]。DFU 創面壞死組織是影響創面愈合的重要因素，一方面壞死組織自溶后形成的毒素會被組織局部吸收并形成細菌培養基；另一方面，壞死組織會影響創面組織血管生成，從而阻礙肉芽組織的形成及上皮組織再生[2]。清創術是指在不損害或較少損害存活組織的情況下將壞死組織從創面清除的過程，其作用包括但不僅限于[3]：減少壞死組織產生的炎性細胞因子和金屬蛋白酶；解除炎癥產物對角質形成細胞的抑制，促進角質形成細胞 DNA 合成與生長；減少與創面壞死組織相關的細菌負荷。常用的清創方法包括生物、機械、自溶、手術和酶清創術等[4]。酶法清創是將外源酶應用于創面后使失活組織通過降解作用降解，從而達到清除失活組織的目的。有的酶類可能存在清創不徹底或過度清創而損傷存活組織的缺點，而溶組織梭菌來源的膠原酶具有高選擇性，是唯一被美國食品和藥物管理局批準的酶清創軟膏的活性成分[5]。系列臨床研究顯示膠原酶可以促進 DFU 愈合，提示其有望成為 DFU 的輔助治療手段之一[6]。現將膠原酶治療慢性創面的機制及其在 DFU 中的應用進行總結，為今后優化 DFU 的治療方案提供參考。
1 膠原酶治療創面的機制
DFU 以壞死組織為基礎，其細胞碎片嵌在由Ⅰ型和Ⅲ型膠原、糖蛋白和蛋白多糖組成的細胞外基質中[6]。壞死組織通過變性膠原束固定在傷口上阻礙肉芽組織形成，導致創面無法形成再上皮化所需平臺[7]。細菌膠原酶是一種具有高度特異性的蛋白酶，其只能識別少數肽序列并將人變性膠原的三螺旋區域水解，去除壞死組織[6]。研究表明膠原酶比木瓜蛋白酶（酶清創中常用酶之一）具有更高的膠原溶解活性和更低的彈性蛋白和纖維蛋白溶解活性，這種高特異性減少了創面出血風險及對周圍組織的潛在傷害[5]。
體外和體內研究均表明，被細菌膠原酶降解的人焦痂碎片能刺激人成纖維細胞增殖并對巨噬細胞有趨化作用[8]；進一步研究發現其降解產生的二肽和三肽還可以促進人成纖維細胞向創面中心移動，且依賴于肽鏈中的羥脯氨酸[9]。Laskin 等[10]證實羥脯氨酸并非促進中性粒細胞趨化的膠原酶降解多肽片段所必須。體外研究發現在角質形成細胞培養基中加入膠原酶后角質形成細胞的遷移速度和增殖能力提高了 5 倍[11]；溶組織梭菌來源的膠原酶降解細胞外基質后可以產生高（120×103）、中（45×103～50×103 和 80×103）、低（35×103）相對分子質量的多肽；其中 Col4-1、Fibr2、Ten1 和 Comb1 片段能促進內皮細胞的增殖；Col4-1、Col4-2、Fibr2、Fibr3、Ten2、Ten4 和 Comb1 片段能促進血管形成，又以 Col4-1、Ten2 和 Comb1 的作用最為顯著[11]。
炎癥反應是創面愈合的重要環節， 在 Th1 細胞因子的介導下巨噬細胞向 M1 極化，發揮著促炎功能；相反地，在 Th2 細胞因子的介導下出現 M2 極化，表現出抗炎、促進組織修復再生的作用。Galperin 等[12]發現膠原酶治療 DFU 患者 2～4 周后創面滲出物中的促炎因子如白細胞介素（interleukin，IL）-6 和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）表達減少，體外試驗證實膠原酶降解產物可以抑制巨噬細胞 M1 極化從而減少 IL-6 和 TNF-α 的產生。Das 等[13]認為膠原酶分別通過激活IL-4/IL-4 受體 α/酪氨酸激酶/信號轉換器和轉錄激活器 6 和前列腺素 E2/前列腺素 E 受體 4/環磷酸腺苷/環磷酸腺苷效應元件結合蛋白/信號轉換器和轉錄激活器 6 途徑促進巨噬細胞向 M2 極化從而增加抑炎因子 IL-10 和轉化生長因子 β 的產生；另外膠原酶還通過抑制微小 RNA-21/人第 10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的蛋白/糖原合成酶激酶 3 β/核因子 κB 通路進而抑制巨噬細胞向 M1 極化，減少炎性因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 和一氧化氮合酶 2 的產生[14]。
2 膠原酶治療 DFU 的療效
有研究顯示，每日 1 次在慢性創面表面上涂抹 2 mm 厚的膠原酶軟膏（創面面積越大，所需的膠原酶軟膏越多），膠原酶組（n=24）治療 1 周后潰瘍開始改善，而生理鹽水紗布組（n=24）在 2 周時才顯示出療效。在治療 4 周內，膠原酶組每周的傷口總評分和滲液評分與生理鹽水紗布組相比，差異無統計學意義；但在膠原酶治療第 4 周和治療結束后第 8 周潰瘍面積分別縮小 44.9% 與 53.8%，生理鹽水紗布組反而增加 0.78% 與 8.13%；不僅如此，在治療結束后第 8 周膠原酶組中潰瘍無改善和中度改善的患者分別為 1 例和 6 例，生理鹽水紗布組分別為 5 例與 1 例，兩者比較差異均有統計學意義（P<0.05）[15]。
Motley 等[16]每日 1 次在慢性創面表面上涂抹 2 mm 厚的膠原酶與機械清創聯合（聯合治療組，n=28）用于治療 DFU，結果顯示與單純機械清創組（n=27）相比，聯合治療組在治療 6 周后潰瘍面積與基線值相比縮小 68%（P<0.001），而單純機械清創組只縮小了 33%（P=0.31）；治療結束后第 6 周隨訪時聯合治療組仍表現出優勢，且 1 年內預期上皮化周數（1 年內維持完全愈合狀態的周數）比單純機械清創組增加 25%。Galperin 等[12]比較了每日 1 次在慢性創面表面上涂抹 2 mm 厚的膠原酶軟膏（n=9）與水凝膠敷料（n=8）治療瓦格納（Wagner）分級為 1～2 級 DFU 的療效，結果顯示治療 4 周后兩者的潰瘍縮小面積、滲液評分沒有明顯差異。Jimenez 等[17]進一步證實了在創面上涂抹 2 mm 的膠原酶軟膏（n=106）和水凝膠敷料（n=109）治療 6 周和 12 周時潰瘍縮小面積（P=0.3801，0.3606）、愈合率（P=0.3705，0.2358）和需要機械清創的次數無明顯差異，但膠原酶治療 1 周后潰瘍明顯改善，水凝膠則需要 2 周，而且水凝膠組感染發生率大于膠原酶組（13.8% vs. 8.5%）。研究顯示每日 1 次在創面上涂抹 2 mm 的膠原酶軟膏（n=51）或給予銀離子敷料（n=51）治療 6 周后潰瘍面積明顯縮小，兩者差異無統計學意義（P=0.071）；且膠原酶治療組的潰瘍感染發生率與銀離子組相似（P=0.208）[18]。有學者將負壓吸引與膠原酶聯合治療 5 例 Wagner 分級為 3 級和 1 例 Wagner 分級為 4 級的截肢術后患者，1 個月后所有潰瘍均出現明顯的肉芽組織生長甚至愈合[19]。Lantis 等[6]研究了膠原酶治療 DFU 的 4 篇隨機對照試驗并總結出膠原酶在 DFU 人群中使用的最佳臨床標準：初次機械清創術后的 4～6 周應每天應用膠原酶；對于具有大量壞死碎片的潰瘍，膠原酶聯合每周 1 次機械清創術可以獲得更好療效。對于愈合十分緩慢甚至停止的潰瘍以及面積>2 cm2和位于足底表面的潰瘍，使用膠原酶治療能更好的獲益。
3 不良反應及注意事項
過敏是膠原酶最常發生的不良反應，研究顯示將膠原酶用于傷口周圍時可能會出現瘙癢、灼燒感、水腫及皮疹，最嚴重的 1 例患者在膠原酶治療后發生了需激素治療的全身過敏反應[20-23]。當患者發生過敏反應時可用聚維酮碘清洗創面使酶失活；此外，膠原酶治療時可能會出現過度的肉芽組織增生影響創緣上皮爬行，此時可應用硝酸銀燒灼治療[24]；蜂窩織炎也是膠原酶的不良反應之一，因此對于全身狀態較差的患者應密切監測感染情況[25]。
臨床上大多采用每日 1 次 2 mm 厚膠原酶軟膏治療創面，如果滲液較多應及時增加頻次。Burgos 等[26]將膠原酶用于治療 86 例 3 級壓瘡患者時發現當肉芽組織覆蓋了 11%～30% 的潰瘍床時每日 1 次和每 2 日 1 次的膠原酶軟膏效果無明顯差異（P=0.451）；膠原酶最合適的 pH 值范圍為 6～8，較高或較低的 pH 值都會降低酶活性；另外，酶活性也會受到金屬離子的影響，重金屬如銀離子、二價鐵離子和鎳離子會抑制膠原酶活性，輕金屬離子如鈉離子、鉀離子和鎂離子能提高膠原酶活性[5]。在使用膠原酶之前應用生理鹽水沖洗掉創面壞死組織碎片；如果創面存在局部感染，應全身使用抗菌藥物抗感染，待感染得到基本控制后再使用膠原酶軟膏；如果創面感染未緩解或者加重，應停止使用膠原酶軟膏，直到感染緩解；當壞死組織被完全清除，肉芽組織生長良好時，應終止使用膠原酶軟膏[20]。研究顯示聚乙烯醇及膠原敷料對膠原酶有促進作用，濕性創面優于干燥創面，而含碘敷料與含銀敷料對膠原酶具有抑制作用，臨床上應避免混合使用[5]。
4 展望
膠原酶通過自身及其膠原降解產物發揮促進潰瘍愈合作用，在選擇性去除壞死組織的同時也起到抗炎、促進成纖維細胞和角質形成細胞增殖及血管再生作用。上述臨床研究表明每日 1 次膠原酶軟膏能有效促進 DFU 愈合，其嚴重不良反應較罕見，提示其可以作為治療 DFU 的輔助手段之一。然而，膠原酶的清創活性受到創面敷料的影響，選擇合適的創面敷料以保證最佳活性非常重要。因此仍需更多的基礎和臨床試驗進一步明確其作用機制、使用條件與標準化流程。