肺纖維化是一類可由多種原因引起的、慢性、纖維化性肺疾病，主要病理特征是正常肺組織結構破壞后的過度瘢痕修復，最終導致呼吸功能不全。雖然有關肺纖維化病理生理機制的研究已取得較大進展，但其發病機制尚未完全闡明，臨床上仍是無法治愈的。近年來，研究發現非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA）在肺纖維中發揮了重要作用，因此該文總結了 ncRNA 通過影響上皮-間質轉化、肺成纖維細胞的活化及巨噬細胞的功能進而調控肺纖維化的相關進展，以期為肺纖維化的治療提供新思路。
引用本文： 張世杰, 張田利, 童翔, 黃吉楨, 范紅. 非編碼 RNA 在肺纖維化中作用機制的研究進展. 華西醫學, 2021, 36(1): 91-96. doi: 10.7507/1002-0179.202012309 復制
肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一類全球范圍內廣泛關注的健康問題，其主要表現為干咳以及進行性的呼吸困難，預后較差，目前仍是難以治愈的[1]。PF 的主要病理特征是正常肺泡組織結構在受損傷刺激后經異常纖維修復導致的結構異常（瘢痕形成），是肺組織受損后纖維修復過程的一個最終結果，目前尚缺乏特異性的治療藥物，多數患者最終死于進行性呼吸功能衰竭[2]。利用基因組學技術探索肺纖維化的相關分子機制，是目前的一大研究熱點。在人類基因組中存在大量不編碼蛋白質的基因，但其可轉錄成為非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA），且具有多種生物學功能。近年來，研究發現 ncRNA 也參與了 PF 的病理進程[3]，因此本文就 ncRNA 在肺纖維化疾病中的作用作一綜述，旨在為 PF 的治療尋找一種新的有效方式。
1 非編碼 RNA 概述
1.1 非編碼 RNA
ncRNA 是一類從基因組中轉錄而來、但不具備蛋白質編碼功能的 RNA，存在于各種組織細胞中，具有多樣化的生物學功能。根據核苷酸長度，ncRNA 可分為兩大類：① 小于 200 個核苷酸的短 ncRNA，如微小 RNA（microRNA，miRNA）、PIWI 相互作用 RNA，小干擾 RNA；② 大于 200 個核苷酸的長 ncRNA，如長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。此外，還有一種封閉環狀結構的 RNA，稱為環狀 RNA（circular RNA，circRNA）。許多 ncRNA 僅在機體特定發育階段表達，且具有組織特異性和細胞特異性，在促進或維持組織細胞功能特性方面發揮重要作用。本文將主要討論 ncRNA 中的 miRNA、lncRNA 和 circRNA 與肺纖維化之間的關系。
1.2 miRNA
miRNA 是一類廣泛存在于自然界、進化上高度保守、平均長度約為 18～24 個核苷酸的單鏈非編碼 RNA，主要通過與靶信使 RNA（messenger RNA，mRNA）序列的 3′-非翻譯區結合，從而阻斷 mRNA 的翻譯或促進 mRNA 的降解，調節轉錄后的基因表達[4-7]。miRNA 最早于 1993 年在秀麗隱桿線蟲中首次被發現，然而在之后的 10 年，miRNA 在人類疾病中的作用都未得到重視[8]。近年研究發現，>60% 的蛋白質編碼基因直接受 miRNA 調控[9]；此外，一個 miRNA 可以參與調節數個靶 mRNA，一個 miRNA 還可與靶 mRNA 的 3′-非翻譯區內幾個不同的 miRNA 結合位點結合[10]。因此 miRNA 可作為病理生理條件刺激下基因表達模式的微調器。
1.3 lncRNA
lncRNA 是一類長度超過 200 個核苷酸的非編碼 RNA 分子，它們中的大多數都是由 RNA 聚合酶 II 轉錄而來，因此 lncRNA 與 mRNA 相似，均有 5′端 7-甲基鳥苷帽和 3′端多聚腺苷酸尾巴[11]。早期，lncRNA 曾被認為是生物學進化過程中遺留的“垃圾序列”，但是隨著研究的深入，發現它們參與了機體多種生物學過程的調控[12-13]，如 lncRNA 可以通過組蛋白修飾、DNA 甲基化和染色質重塑等形式調控生物體的表觀遺傳；部分 lncRNA 可在轉錄后充當 mRNA 剪切、蛋白質翻譯以及蛋白質穩定的調節劑；此外 lncRNA 還可作為競爭性內源 RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）吸附特定的 miRNA[14]，參與靶基因的表達調控。
1.4 circRNA
circRNA 是一類共價閉合、沒有 5′端帽子和 3′端多聚腺苷酸尾巴的環狀內源性非編碼 RNA[15]。2012 年，科學家通過轉錄組學測序技術發現：傳統上認為僅表達 mRNA 或線性 ncRNA 的真核基因普遍表達 circRNA。circRNA 的表達豐度因細胞種類而異，可能超過傳統的線性 mRNA 轉錄本的豐度。在功能上，circRNA 參與調控基因的轉錄和剪接，可以參與調節蛋白質-蛋白質之間的相互作用，還可以抑制核糖體 RNA 的成熟[16-17]；此外，circRNA 也可作為 ceRNA 競爭性結合特定的 miRNA，調節靶基因的表達。因此，在 miRNA、lncRNA 以及 circRNA 之間存在一個精密的調控網絡，使得 ncRNA 在肺纖維化中的作用變得更加復雜。
2 miRNA 在肺纖維化中的研究現狀
肺纖維化的主要特征是肺組織過度瘢痕修復，肺泡間隔損傷、上皮細胞異常增生，成纖維細胞增殖分化、轉化為肌成纖維細胞，大量細胞外基質沉積，正常肺組織結構破壞，最終導致呼吸功能不全[2, 18]。近年來有關 miRNA 在肺纖維化中的作用吸引了大批研究者的注意，且相關研究已取得階段性成果。
2.1 miRNA 參與肺纖維化的上皮-間質轉化過程
上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。當肺組織遭受損傷刺激時，肺泡上皮細胞受損，上皮細胞標志物表達下調，間質細胞標志物表達上調，細胞黏附功能減弱、遷移和侵襲能力增強，從而釋放促纖維化細胞因子，產生大量細胞外基質，促進肺纖維化的進展[19]。
Let-7 是最早在人類中發現的 miRNA 之一。高遷移率族蛋白 A2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）是 EMT 的一個重要激活劑，也是 let-7 的重要靶基因。在肺纖維化中，let-7 可以通過靶向抑制 HMGA2 基因的表達，進而抑制 EMT 的過程，阻止肺纖維化[20]。此外，癌基因的 RAS 家族也被證實是 let-7 的靶基因，其同樣參與 let-7 的抗 EMT 效應[21]。因此 Let-7 是肺纖維化進展過程中的負調控因子，可作為肺纖維化干預的重要靶點。
miRNA-200 家族包括 3 個成員：miRNA-200a、miRNA-200b 和 miRNA-200c，均參與維持肺泡上皮細胞表型，在小鼠和人纖維化肺組織中均顯著下調[22-23]。有文獻報道，miRNA-200b/c 可靶向調節基因 zeb1/2 的表達，進而通過 p38 絲裂原活化蛋白激酶和轉化生長因子 β1（transforming growth factor，TGF-β1）/SMAD 信號通路，阻止 EMT 進程，從而減輕脂多糖誘導的早期肺纖維化[24]。此外 miRNA-200 家族還可逆轉特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）中Ⅱ型肺泡上皮細胞轉分化為 Ⅰ型肺泡上皮細胞，進而減輕肺纖維化[25]。因此 miRNA-200 家族對肺纖維化的診斷和治療有重要價值。
此外，有研究表明在 IPF 中，miRNA-185 和 miRNA-186 表達明顯下調；在 A549 細胞中，上調 miRNA-185 和 miRNA-186 可抑制 TGF-β 誘導的 EMT 進程，減少膠原蛋白產生[26]。在射線相關肺纖維化中，肺泡上皮細胞 miRNA-155 表達下調，miRNA-155 可通過糖原合成酶激酶-3 /NF-κB 信號通路抑制 EMT 過程，因此射線輻照可通過抑制 miRNA-155 的作用進而加速肺纖維化[27]。在二氧化硅導致的肺纖維化中，miRNA-34a 通過抑制 SMAD4 蛋白表達，從而阻斷 EMT 過程，起到減輕肺纖維化的作用[28]。而 miRNA-503 通過靶向胞內磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/p85 抑制二氧化硅導致的肺泡上皮細胞 EMT 過程，但其作用可被 lncRNA MALAT1 削弱[29]。在藥物（TGF-β、博來霉素）刺激的 RLE/Abca3 細胞（具有肺泡Ⅱ型細胞表型的細胞系）中，miRNA-34a 表達明顯上調；通過 RLE/Abca3 細胞過表達 miRNA-34a，即可誘導細胞 EMT 發生[30]。以上研究表明，在不同原因導致的肺纖維化中，miRNA 均可通過調節 EMT 相關蛋白的表達進而影響肺纖維化的進程，提示其可作為肺纖維化診斷和治療的重要靶點。
2.2 miRNA 參與肺纖維化中成纖維細胞的活化過程
在肺纖維化過程中，成纖維細胞活化，增殖、分化為肌成纖維細胞，對肺纖維化的進展有極大的促進作用。大量研究表明，在肺纖維化中，miRNA 可以影響成纖維細胞的活化[31-35]。miRNA-27b 是一種抗纖維化的 miRNA，其在肺纖維化動物模型以及從纖維化肺組織提取的成纖維細胞中均表達下調。在人肺成纖維細胞中，過表達 miRNA-27b 可通過靶向 TGF-β 受體 1 和 SMAD2 抑制 TGF-β 誘導的細胞膠原蛋白和 α 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的產生，抑制成纖維細胞的活化[35]。在二氧化硅誘導的小鼠肺纖維化中，miRNA-542 表達顯著降低；在小鼠體內上調 miRNA-542 的表達能明顯改善肺纖維化病變，包括肺泡結構損傷、肺泡間質增厚和二氧化硅結節的形成；同時在成纖維細胞中過表達 miRNA-542 能明顯抑制其活化[33]。此外，在肺成纖維細胞中，miRNA-340、miRNA-30a 以及 miRNA-19a/19b/20a 均可以抑制 TGF-β1 誘導的肺成纖維細胞的活化[31-34]。由此可見，miRNA 的異常表達可以通過影響肺成纖維細胞的活化進而影響肺纖維化的進程。
2.3 miRNA 參與巨噬細胞誘導的肺纖維化過程
巨噬細胞在組織纖維化過程中發揮了重要作用，但其具體機制尚未完全闡明。在肺纖維化中，有研究表明巨噬細胞可通過外泌體釋放 miRNA，進而間接調節肺纖維化的進程[34]。Yao 等[36]研究表明，在博來霉素誘導的大鼠肺纖維化模型中，M2 型巨噬細胞通過外泌體釋放 miRNA-328，靶向降低 FAM13A 蛋白表達水平，進而促進肺間質成纖維細胞增殖以及膠原蛋白和 a-SMA 的表達，從而促進肺纖維化的進展。
此外，Su 等[37]研究發現，在 IPF 患者肺組織巨噬細胞中 miRNA-142-5p 表達升高、miRNA-130a-3p 表達降低，而下調 miRNA-142-5p 的表達水平以及上調 miRNA-130a-3p 的表達水平均可減輕博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化；此外，在巨噬細胞中，白細胞介素 4 和白細胞介素 13 能上調 miRNA-142-5p、下調 miRNA-130a-3p 的表達水平，從而有助于發揮巨噬細胞的促纖維作用。另外，有研究表明 STAT6 能介導 M2 型巨噬細胞的激活[38]，在體外實驗中，上調 miRNA-142-5p 可通過細胞因子信號 1、下調 miRNA-130a-3p 可通過過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 調節 STAT6 信號，調節 M2 型巨噬細胞的活化，最終參與調控肺纖維化[37]。以上研究表明，在巨噬細胞調節肺纖維化的過程中，miRNA 發揮了重要作用。
3 lncRNA 在肺纖維化中的研究現狀
近年來，有關 lncRNA 在肺纖維化中的作用的研究取得了一定成果。研究證實在纖維化肺組織中存在大量異常表達的 lncRNA，且其對肺纖維化的發生發展起著重要的調節作用[39-40]。Cao 等[40]通過基因芯片技術，發現在博來霉素誘導的肺纖維化大鼠與正常對照組之間有 568 個差異表達的 lncRNA。與此類似，Huang 等[39]發現，在人 IPF 肺組織中有 9 個 lncRNA 也出現了異常表達。lncRNA 可在轉錄前、轉錄過程及轉錄后調節基因的表達，發揮多種生物學作用。
3.1 lncRNA 參與肺纖維化的上皮-間質轉化過程
EMT 過程在肺纖維化進展中起到了至關重要的作用，研究表明 lncRNA 可調節 EMT 的過程，進而參與調控肺纖維化。Sun 等[41]在百草枯誘導的肺間質纖維化小鼠中，發現 717 個 lncRNA 出現異常表達，其中，lncRNA uc.77 和 2700086A05Rik 通過調節靶基因 zeb2 和 hoxa3 的表達從而誘導 EMT，促進肺纖維化的發生。在二氧化硅誘導的肺纖維化模型中，肺上皮細胞大量表達 lncRNA ATB，繼而通過與 miRNA-200c 結合，啟動肺 EMT 過程，加速肺纖維化的發生[42]。此外，sirt1 基因過表達可通過抑制 EMT 進展而減輕肺纖維化程度，反義 lncRNA sirt1 則可以通過增強 sirt1 的穩定性、增加 sirt1 的表達，進而抑制 EMT，減輕肺纖維化[43]。Yang 等[44]研究發現 lncRNA H19 可通過 PI3K/AKT 信號通路調節 EMT 過程。以上研究表明 lncRNA 在肺纖維化的 EMT 過程中發揮了重要調節作用。
3.2 lncRNA 參與肺纖維化中成纖維細胞的活化過程
成纖維細胞的活化在肺纖維化中起到了重要作用，lncRNA 同樣也可參與調控成纖維細胞的活化。Cai 等[45]通過轉錄組學測序技術，在大鼠硅肺肺組織中找到 306 個差異表達的 lncRNA，其中 lncRNA LOC103691771 表達明顯上調；在肺成纖維細胞中，下調 LOC103691771 表達能通過 TGF-β1/SMAD 信號通路抑制 TGF-β 誘導的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，而過表達 LOC103691771 則可促進肌成纖維細胞的分化。Xiao 等[46]通過建立砷暴露引起的小鼠肺纖維化模型，發現纖維化肺組織中，lncRNA H19 表達明顯上調；對于 THP-1 巨噬細胞和骨髓源性巨噬細胞，亞砷酸鹽可使 lncRNA H19 表達升高，并誘導巨噬細胞 M2 極化，導致促纖維化細胞因子 TGF-β1 分泌增加；將亞砷酸鹽處理的 THP-1 巨噬細胞與肺成纖維細胞共培養時，肺成纖維細胞中的 a-SMA 和膠原蛋白水平明顯升高，導致肺成纖維細胞的激活。以上研究表明，lncRNA 能通過影響肺成纖維細胞的活化，進而調控肺纖維化的進程。
3.3 lncRNA 通過 miRNA 間接調控肺纖維化
前文已綜述 miRNA 及 lncRNA 在肺纖維化中均起到了重要作用。而有研究報道，lncRNA 可作為 ceRNA 吸附特定 miRNA，降低 miRNA 對靶基因的抑制作用，通過 miRNA 間接參與調控肺纖維化。Song 等[47]于 2014 年首次文獻報道在博來霉素誘導的大鼠肺纖維化模型中 lncRNA MRAK088388 和 MRAK081523 均表達上調，并可作為 ceRNA 發揮作用；其中 MRAK088388 通過結合 miRNA-29b-3p 調節下游的 N4bp2 蛋白水平，而 MRAK081523 通過競爭性結合 let-7i-5p 調控 Plxna4 的蛋白表達，促進成纖維細胞的增殖分化，進而調節肺纖維化。lncRNA fendrr 可通過競爭性結合 miRNA-214，抑制成纖維細胞的活化，從而減輕肺纖維化[48]。不同的是，在心臟中 lncRNA fendrr 直接靶向 miRNA-106b，從而促進心臟纖維化的發生[49]。Lu 等[50]報道 lncRNA H19 通過調節 miR-196a 加速肺纖維化。敲低 lncRNA H19 可通過 miRNA-140-TGF-β/SMAD3 信號通路減輕肺纖維化[51]。以上研究表明，lncRNA 可作為 ceRNA 競爭性結合 miRNA，進而從轉錄后水平調節基因表達或影響相關信號通路來調控肺纖維化的病理生理過程，這為研究肺纖維化的發病機制提供了新的線索。
4 circRNA 在肺纖維化中的研究現狀
不同于 miRNA 和 lncRNA 的研究深度，circRNA 近幾年才掀起研究熱潮。功能上，circRNA 在哺乳動物中起著基因調節劑的作用，特別是通過充當 miRNA 海綿或 mRNA 翻譯模板，通過與 RNA 聚合酶Ⅱ直接結合或形成蛋白質相互作用的平臺來促進基因的轉錄[52-53]。目前有關 circRNA 在肺纖維化中的相關研究還比較缺乏。
Li 等[53]通過 circRNA 微陣列分析技術在 IPF 患者血漿中發現了 67 個異常表達的 circRNA，并且大多數均產生于外顯子區；其中 circRNA 100906 和 circRNA 102348 的表達明顯上調，并可以分別靶向作用于 miRNA-324-5p 和 miRNA-630，因此 circRNA 100906 和 circRNA 102348 可作為肺纖維化潛在的治療靶點。此外，Li 等[54]發現在 IPF 中，circRNA TADA2A 可通過競爭性結合 miRNA-526b 和 miRNA-203 促進 Caveolin-1 和 Caveolin-2 的表達，進而抑制肺成纖維細胞的活化和增殖，抑制肺纖維化的進展。
矽肺是由于長期吸入含大量二氧化硅的粉塵，繼而導致肺內一系列病理生理改變，最終導致肺纖維化改變。研究報道，circRNA 在矽肺相關的肺纖維化中起到了重要的調節作用。在二氧化硅刺激的肺成纖維細胞中，circRNA 012091 可以通過調節下游 PPP1R13B 蛋白的表達水平，影響成纖維細胞的增殖和遷移能力[55]。同樣，Yao 等[56]的研究表明，二氧化硅誘導的肺纖維化動物模型中，circRNA CDR1as 表達上調，其可以通過競爭性結合 miRNA-7，促進 TGFBR2 蛋白的表達，啟動 EMT，從而促進肺纖維化的形成。此外，Zhou 等[57]的研究表明，circRNA HECTD1 能夠逆轉二氧化硅導致的巨噬細胞活力下降，而巨噬細胞活化在肺纖維化的發病中起著重要作用。
綜上所述，在纖維化肺組織中存在 circRNA 的異常表達，其可通過影響成纖維細胞的增殖分化、巨噬細胞功能以及 EMT 的過程，進而在肺纖維化的進程中發揮作用。
5 小結和展望
近年來，有關 ncRNA 在肺纖維化中的作用激起了一陣研究熱潮。研究表明，在纖維化肺組織中存在大量異常表達的 miRNA、lncRNA 和 circRNA，其均可通過影響 EMT、肺成纖維細胞的活化及巨噬細胞的功能從而調控肺纖維化過程。此外，miRNA、lncRNA 和 circRNA 之間還存在相互調節網絡，使得 ncRNA 在肺纖維化中的作用機制變得更加復雜，遠不止我們目前所發現的，還有待更深層次的研究。本文通過綜述 ncRNA 在肺纖維化中的作用機制，希望為肺纖維化這一目前不可治愈的疾病尋找新的治療措施。目前，雖然 ncRNA 未作為肺纖維化的診斷和治療靶點應用于臨床，但是上述研究為明確肺纖維化的發病機制奠定了一定的理論基礎，為肺纖維化的治療帶來了新的曙光。
肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一類全球范圍內廣泛關注的健康問題，其主要表現為干咳以及進行性的呼吸困難，預后較差，目前仍是難以治愈的[1]。PF 的主要病理特征是正常肺泡組織結構在受損傷刺激后經異常纖維修復導致的結構異常（瘢痕形成），是肺組織受損后纖維修復過程的一個最終結果，目前尚缺乏特異性的治療藥物，多數患者最終死于進行性呼吸功能衰竭[2]。利用基因組學技術探索肺纖維化的相關分子機制，是目前的一大研究熱點。在人類基因組中存在大量不編碼蛋白質的基因，但其可轉錄成為非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA），且具有多種生物學功能。近年來，研究發現 ncRNA 也參與了 PF 的病理進程[3]，因此本文就 ncRNA 在肺纖維化疾病中的作用作一綜述，旨在為 PF 的治療尋找一種新的有效方式。
1 非編碼 RNA 概述
1.1 非編碼 RNA
ncRNA 是一類從基因組中轉錄而來、但不具備蛋白質編碼功能的 RNA，存在于各種組織細胞中，具有多樣化的生物學功能。根據核苷酸長度，ncRNA 可分為兩大類：① 小于 200 個核苷酸的短 ncRNA，如微小 RNA（microRNA，miRNA）、PIWI 相互作用 RNA，小干擾 RNA；② 大于 200 個核苷酸的長 ncRNA，如長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。此外，還有一種封閉環狀結構的 RNA，稱為環狀 RNA（circular RNA，circRNA）。許多 ncRNA 僅在機體特定發育階段表達，且具有組織特異性和細胞特異性，在促進或維持組織細胞功能特性方面發揮重要作用。本文將主要討論 ncRNA 中的 miRNA、lncRNA 和 circRNA 與肺纖維化之間的關系。
1.2 miRNA
miRNA 是一類廣泛存在于自然界、進化上高度保守、平均長度約為 18～24 個核苷酸的單鏈非編碼 RNA，主要通過與靶信使 RNA（messenger RNA，mRNA）序列的 3′-非翻譯區結合，從而阻斷 mRNA 的翻譯或促進 mRNA 的降解，調節轉錄后的基因表達[4-7]。miRNA 最早于 1993 年在秀麗隱桿線蟲中首次被發現，然而在之后的 10 年，miRNA 在人類疾病中的作用都未得到重視[8]。近年研究發現，>60% 的蛋白質編碼基因直接受 miRNA 調控[9]；此外，一個 miRNA 可以參與調節數個靶 mRNA，一個 miRNA 還可與靶 mRNA 的 3′-非翻譯區內幾個不同的 miRNA 結合位點結合[10]。因此 miRNA 可作為病理生理條件刺激下基因表達模式的微調器。
1.3 lncRNA
lncRNA 是一類長度超過 200 個核苷酸的非編碼 RNA 分子，它們中的大多數都是由 RNA 聚合酶 II 轉錄而來，因此 lncRNA 與 mRNA 相似，均有 5′端 7-甲基鳥苷帽和 3′端多聚腺苷酸尾巴[11]。早期，lncRNA 曾被認為是生物學進化過程中遺留的“垃圾序列”，但是隨著研究的深入，發現它們參與了機體多種生物學過程的調控[12-13]，如 lncRNA 可以通過組蛋白修飾、DNA 甲基化和染色質重塑等形式調控生物體的表觀遺傳；部分 lncRNA 可在轉錄后充當 mRNA 剪切、蛋白質翻譯以及蛋白質穩定的調節劑；此外 lncRNA 還可作為競爭性內源 RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）吸附特定的 miRNA[14]，參與靶基因的表達調控。
1.4 circRNA
circRNA 是一類共價閉合、沒有 5′端帽子和 3′端多聚腺苷酸尾巴的環狀內源性非編碼 RNA[15]。2012 年，科學家通過轉錄組學測序技術發現：傳統上認為僅表達 mRNA 或線性 ncRNA 的真核基因普遍表達 circRNA。circRNA 的表達豐度因細胞種類而異，可能超過傳統的線性 mRNA 轉錄本的豐度。在功能上，circRNA 參與調控基因的轉錄和剪接，可以參與調節蛋白質-蛋白質之間的相互作用，還可以抑制核糖體 RNA 的成熟[16-17]；此外，circRNA 也可作為 ceRNA 競爭性結合特定的 miRNA，調節靶基因的表達。因此，在 miRNA、lncRNA 以及 circRNA 之間存在一個精密的調控網絡，使得 ncRNA 在肺纖維化中的作用變得更加復雜。
2 miRNA 在肺纖維化中的研究現狀
肺纖維化的主要特征是肺組織過度瘢痕修復，肺泡間隔損傷、上皮細胞異常增生，成纖維細胞增殖分化、轉化為肌成纖維細胞，大量細胞外基質沉積，正常肺組織結構破壞，最終導致呼吸功能不全[2, 18]。近年來有關 miRNA 在肺纖維化中的作用吸引了大批研究者的注意，且相關研究已取得階段性成果。
2.1 miRNA 參與肺纖維化的上皮-間質轉化過程
上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。當肺組織遭受損傷刺激時，肺泡上皮細胞受損，上皮細胞標志物表達下調，間質細胞標志物表達上調，細胞黏附功能減弱、遷移和侵襲能力增強，從而釋放促纖維化細胞因子，產生大量細胞外基質，促進肺纖維化的進展[19]。
Let-7 是最早在人類中發現的 miRNA 之一。高遷移率族蛋白 A2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）是 EMT 的一個重要激活劑，也是 let-7 的重要靶基因。在肺纖維化中，let-7 可以通過靶向抑制 HMGA2 基因的表達，進而抑制 EMT 的過程，阻止肺纖維化[20]。此外，癌基因的 RAS 家族也被證實是 let-7 的靶基因，其同樣參與 let-7 的抗 EMT 效應[21]。因此 Let-7 是肺纖維化進展過程中的負調控因子，可作為肺纖維化干預的重要靶點。
miRNA-200 家族包括 3 個成員：miRNA-200a、miRNA-200b 和 miRNA-200c，均參與維持肺泡上皮細胞表型，在小鼠和人纖維化肺組織中均顯著下調[22-23]。有文獻報道，miRNA-200b/c 可靶向調節基因 zeb1/2 的表達，進而通過 p38 絲裂原活化蛋白激酶和轉化生長因子 β1（transforming growth factor，TGF-β1）/SMAD 信號通路，阻止 EMT 進程，從而減輕脂多糖誘導的早期肺纖維化[24]。此外 miRNA-200 家族還可逆轉特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）中Ⅱ型肺泡上皮細胞轉分化為 Ⅰ型肺泡上皮細胞，進而減輕肺纖維化[25]。因此 miRNA-200 家族對肺纖維化的診斷和治療有重要價值。
此外，有研究表明在 IPF 中，miRNA-185 和 miRNA-186 表達明顯下調；在 A549 細胞中，上調 miRNA-185 和 miRNA-186 可抑制 TGF-β 誘導的 EMT 進程，減少膠原蛋白產生[26]。在射線相關肺纖維化中，肺泡上皮細胞 miRNA-155 表達下調，miRNA-155 可通過糖原合成酶激酶-3 /NF-κB 信號通路抑制 EMT 過程，因此射線輻照可通過抑制 miRNA-155 的作用進而加速肺纖維化[27]。在二氧化硅導致的肺纖維化中，miRNA-34a 通過抑制 SMAD4 蛋白表達，從而阻斷 EMT 過程，起到減輕肺纖維化的作用[28]。而 miRNA-503 通過靶向胞內磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/p85 抑制二氧化硅導致的肺泡上皮細胞 EMT 過程，但其作用可被 lncRNA MALAT1 削弱[29]。在藥物（TGF-β、博來霉素）刺激的 RLE/Abca3 細胞（具有肺泡Ⅱ型細胞表型的細胞系）中，miRNA-34a 表達明顯上調；通過 RLE/Abca3 細胞過表達 miRNA-34a，即可誘導細胞 EMT 發生[30]。以上研究表明，在不同原因導致的肺纖維化中，miRNA 均可通過調節 EMT 相關蛋白的表達進而影響肺纖維化的進程，提示其可作為肺纖維化診斷和治療的重要靶點。
2.2 miRNA 參與肺纖維化中成纖維細胞的活化過程
在肺纖維化過程中，成纖維細胞活化，增殖、分化為肌成纖維細胞，對肺纖維化的進展有極大的促進作用。大量研究表明，在肺纖維化中，miRNA 可以影響成纖維細胞的活化[31-35]。miRNA-27b 是一種抗纖維化的 miRNA，其在肺纖維化動物模型以及從纖維化肺組織提取的成纖維細胞中均表達下調。在人肺成纖維細胞中，過表達 miRNA-27b 可通過靶向 TGF-β 受體 1 和 SMAD2 抑制 TGF-β 誘導的細胞膠原蛋白和 α 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的產生，抑制成纖維細胞的活化[35]。在二氧化硅誘導的小鼠肺纖維化中，miRNA-542 表達顯著降低；在小鼠體內上調 miRNA-542 的表達能明顯改善肺纖維化病變，包括肺泡結構損傷、肺泡間質增厚和二氧化硅結節的形成；同時在成纖維細胞中過表達 miRNA-542 能明顯抑制其活化[33]。此外，在肺成纖維細胞中，miRNA-340、miRNA-30a 以及 miRNA-19a/19b/20a 均可以抑制 TGF-β1 誘導的肺成纖維細胞的活化[31-34]。由此可見，miRNA 的異常表達可以通過影響肺成纖維細胞的活化進而影響肺纖維化的進程。
2.3 miRNA 參與巨噬細胞誘導的肺纖維化過程
巨噬細胞在組織纖維化過程中發揮了重要作用，但其具體機制尚未完全闡明。在肺纖維化中，有研究表明巨噬細胞可通過外泌體釋放 miRNA，進而間接調節肺纖維化的進程[34]。Yao 等[36]研究表明，在博來霉素誘導的大鼠肺纖維化模型中，M2 型巨噬細胞通過外泌體釋放 miRNA-328，靶向降低 FAM13A 蛋白表達水平，進而促進肺間質成纖維細胞增殖以及膠原蛋白和 a-SMA 的表達，從而促進肺纖維化的進展。
此外，Su 等[37]研究發現，在 IPF 患者肺組織巨噬細胞中 miRNA-142-5p 表達升高、miRNA-130a-3p 表達降低，而下調 miRNA-142-5p 的表達水平以及上調 miRNA-130a-3p 的表達水平均可減輕博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化；此外，在巨噬細胞中，白細胞介素 4 和白細胞介素 13 能上調 miRNA-142-5p、下調 miRNA-130a-3p 的表達水平，從而有助于發揮巨噬細胞的促纖維作用。另外，有研究表明 STAT6 能介導 M2 型巨噬細胞的激活[38]，在體外實驗中，上調 miRNA-142-5p 可通過細胞因子信號 1、下調 miRNA-130a-3p 可通過過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 調節 STAT6 信號，調節 M2 型巨噬細胞的活化，最終參與調控肺纖維化[37]。以上研究表明，在巨噬細胞調節肺纖維化的過程中，miRNA 發揮了重要作用。
3 lncRNA 在肺纖維化中的研究現狀
近年來，有關 lncRNA 在肺纖維化中的作用的研究取得了一定成果。研究證實在纖維化肺組織中存在大量異常表達的 lncRNA，且其對肺纖維化的發生發展起著重要的調節作用[39-40]。Cao 等[40]通過基因芯片技術，發現在博來霉素誘導的肺纖維化大鼠與正常對照組之間有 568 個差異表達的 lncRNA。與此類似，Huang 等[39]發現，在人 IPF 肺組織中有 9 個 lncRNA 也出現了異常表達。lncRNA 可在轉錄前、轉錄過程及轉錄后調節基因的表達，發揮多種生物學作用。
3.1 lncRNA 參與肺纖維化的上皮-間質轉化過程
EMT 過程在肺纖維化進展中起到了至關重要的作用，研究表明 lncRNA 可調節 EMT 的過程，進而參與調控肺纖維化。Sun 等[41]在百草枯誘導的肺間質纖維化小鼠中，發現 717 個 lncRNA 出現異常表達，其中，lncRNA uc.77 和 2700086A05Rik 通過調節靶基因 zeb2 和 hoxa3 的表達從而誘導 EMT，促進肺纖維化的發生。在二氧化硅誘導的肺纖維化模型中，肺上皮細胞大量表達 lncRNA ATB，繼而通過與 miRNA-200c 結合，啟動肺 EMT 過程，加速肺纖維化的發生[42]。此外，sirt1 基因過表達可通過抑制 EMT 進展而減輕肺纖維化程度，反義 lncRNA sirt1 則可以通過增強 sirt1 的穩定性、增加 sirt1 的表達，進而抑制 EMT，減輕肺纖維化[43]。Yang 等[44]研究發現 lncRNA H19 可通過 PI3K/AKT 信號通路調節 EMT 過程。以上研究表明 lncRNA 在肺纖維化的 EMT 過程中發揮了重要調節作用。
3.2 lncRNA 參與肺纖維化中成纖維細胞的活化過程
成纖維細胞的活化在肺纖維化中起到了重要作用，lncRNA 同樣也可參與調控成纖維細胞的活化。Cai 等[45]通過轉錄組學測序技術，在大鼠硅肺肺組織中找到 306 個差異表達的 lncRNA，其中 lncRNA LOC103691771 表達明顯上調；在肺成纖維細胞中，下調 LOC103691771 表達能通過 TGF-β1/SMAD 信號通路抑制 TGF-β 誘導的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，而過表達 LOC103691771 則可促進肌成纖維細胞的分化。Xiao 等[46]通過建立砷暴露引起的小鼠肺纖維化模型，發現纖維化肺組織中，lncRNA H19 表達明顯上調；對于 THP-1 巨噬細胞和骨髓源性巨噬細胞，亞砷酸鹽可使 lncRNA H19 表達升高，并誘導巨噬細胞 M2 極化，導致促纖維化細胞因子 TGF-β1 分泌增加；將亞砷酸鹽處理的 THP-1 巨噬細胞與肺成纖維細胞共培養時，肺成纖維細胞中的 a-SMA 和膠原蛋白水平明顯升高，導致肺成纖維細胞的激活。以上研究表明，lncRNA 能通過影響肺成纖維細胞的活化，進而調控肺纖維化的進程。
3.3 lncRNA 通過 miRNA 間接調控肺纖維化
前文已綜述 miRNA 及 lncRNA 在肺纖維化中均起到了重要作用。而有研究報道，lncRNA 可作為 ceRNA 吸附特定 miRNA，降低 miRNA 對靶基因的抑制作用，通過 miRNA 間接參與調控肺纖維化。Song 等[47]于 2014 年首次文獻報道在博來霉素誘導的大鼠肺纖維化模型中 lncRNA MRAK088388 和 MRAK081523 均表達上調，并可作為 ceRNA 發揮作用；其中 MRAK088388 通過結合 miRNA-29b-3p 調節下游的 N4bp2 蛋白水平，而 MRAK081523 通過競爭性結合 let-7i-5p 調控 Plxna4 的蛋白表達，促進成纖維細胞的增殖分化，進而調節肺纖維化。lncRNA fendrr 可通過競爭性結合 miRNA-214，抑制成纖維細胞的活化，從而減輕肺纖維化[48]。不同的是，在心臟中 lncRNA fendrr 直接靶向 miRNA-106b，從而促進心臟纖維化的發生[49]。Lu 等[50]報道 lncRNA H19 通過調節 miR-196a 加速肺纖維化。敲低 lncRNA H19 可通過 miRNA-140-TGF-β/SMAD3 信號通路減輕肺纖維化[51]。以上研究表明，lncRNA 可作為 ceRNA 競爭性結合 miRNA，進而從轉錄后水平調節基因表達或影響相關信號通路來調控肺纖維化的病理生理過程，這為研究肺纖維化的發病機制提供了新的線索。
4 circRNA 在肺纖維化中的研究現狀
不同于 miRNA 和 lncRNA 的研究深度，circRNA 近幾年才掀起研究熱潮。功能上，circRNA 在哺乳動物中起著基因調節劑的作用，特別是通過充當 miRNA 海綿或 mRNA 翻譯模板，通過與 RNA 聚合酶Ⅱ直接結合或形成蛋白質相互作用的平臺來促進基因的轉錄[52-53]。目前有關 circRNA 在肺纖維化中的相關研究還比較缺乏。
Li 等[53]通過 circRNA 微陣列分析技術在 IPF 患者血漿中發現了 67 個異常表達的 circRNA，并且大多數均產生于外顯子區；其中 circRNA 100906 和 circRNA 102348 的表達明顯上調，并可以分別靶向作用于 miRNA-324-5p 和 miRNA-630，因此 circRNA 100906 和 circRNA 102348 可作為肺纖維化潛在的治療靶點。此外，Li 等[54]發現在 IPF 中，circRNA TADA2A 可通過競爭性結合 miRNA-526b 和 miRNA-203 促進 Caveolin-1 和 Caveolin-2 的表達，進而抑制肺成纖維細胞的活化和增殖，抑制肺纖維化的進展。
矽肺是由于長期吸入含大量二氧化硅的粉塵，繼而導致肺內一系列病理生理改變，最終導致肺纖維化改變。研究報道，circRNA 在矽肺相關的肺纖維化中起到了重要的調節作用。在二氧化硅刺激的肺成纖維細胞中，circRNA 012091 可以通過調節下游 PPP1R13B 蛋白的表達水平，影響成纖維細胞的增殖和遷移能力[55]。同樣，Yao 等[56]的研究表明，二氧化硅誘導的肺纖維化動物模型中，circRNA CDR1as 表達上調，其可以通過競爭性結合 miRNA-7，促進 TGFBR2 蛋白的表達，啟動 EMT，從而促進肺纖維化的形成。此外，Zhou 等[57]的研究表明，circRNA HECTD1 能夠逆轉二氧化硅導致的巨噬細胞活力下降，而巨噬細胞活化在肺纖維化的發病中起著重要作用。
綜上所述，在纖維化肺組織中存在 circRNA 的異常表達，其可通過影響成纖維細胞的增殖分化、巨噬細胞功能以及 EMT 的過程，進而在肺纖維化的進程中發揮作用。
5 小結和展望
近年來，有關 ncRNA 在肺纖維化中的作用激起了一陣研究熱潮。研究表明，在纖維化肺組織中存在大量異常表達的 miRNA、lncRNA 和 circRNA，其均可通過影響 EMT、肺成纖維細胞的活化及巨噬細胞的功能從而調控肺纖維化過程。此外，miRNA、lncRNA 和 circRNA 之間還存在相互調節網絡，使得 ncRNA 在肺纖維化中的作用機制變得更加復雜，遠不止我們目前所發現的，還有待更深層次的研究。本文通過綜述 ncRNA 在肺纖維化中的作用機制，希望為肺纖維化這一目前不可治愈的疾病尋找新的治療措施。目前，雖然 ncRNA 未作為肺纖維化的診斷和治療靶點應用于臨床，但是上述研究為明確肺纖維化的發病機制奠定了一定的理論基礎，為肺纖維化的治療帶來了新的曙光。