隱球菌在免疫能力低下與正常人群中均可引起感染。隨著檢測手段的提高與臨床認識的增加，隱球菌病發病率不斷提高，成為威脅人類健康的重要真菌之一。近年來，隱球菌的分類與命名、實驗室檢測手段與藥物敏感性試驗、臨床感染的特征與治療等都有了較大進展。該綜述對上述內容進行了總結，以期提高臨床與實驗室對該菌的認識，及時診斷，早期治療。
引用本文： 李艷冰, 魯炳懷. 隱球菌病的實驗室檢測與臨床研究進展. 華西醫學, 2020, 35(8): 894-900. doi: 10.7507/1002-0179.202007113 復制
近年來，隨著艾滋病感染者的增加，器官移植、皮質激素和免疫抑制劑的使用，腫瘤放射化學治療以及肝硬化、腎功能不全和糖尿病等基礎疾病患者的增加，隱球菌感染在全球范圍逐漸增加，且病死率居高不下。我國隱球菌感染有其較獨特的特點。首先，相當部分的隱球菌感染者并非伴有明顯的免疫缺陷，更似乎是免疫力正常的“健康人”；其次，與世界各地臨床分離隱球菌分子流行病學相比，我國有相對獨特的主要流行分子型別，但不明確是否與人種遺傳基因選擇性壓力或菌株的毒力與適應性相關；再次，我國部分地區已出現對傳統抗真菌藥物耐藥的菌株，并且耐藥率在地區間的分布存在差異，該菌的耐藥現象需引起臨床的重視。目前，尤其是近 10 年來，隱球菌病引起了臨床工作者及研究者高度的重視，無論是對隱球菌本身，還是隱球菌與人類宿主間相互作用的機制，都取得了較大的進展，但依然相對落后于對其他臨床常見病原菌的認識程度。本文將從近年來隱球菌的分類與命名、實驗室檢測手段、藥物敏感性試驗（藥敏試驗）、臨床感染的特征和治療方案等方面的進展進行綜述，以期提高臨床與實驗室對該菌的認識，及時診斷，早期治療，改善患者預后。
1 概述
隱球菌是一種條件致病菌，但又是嚴重威脅人類生命健康的深部真菌，它既感染免疫功能低下人群[1]，也能感染免疫力正常者[2-3]。免疫功能低下人群通常指艾滋病、器官移植、長期使用免疫抑制劑、惡性腫瘤患者，以及嚴重肝硬化、腎病、糖尿病等基礎疾病患者[1, 4]。隱球菌感染是艾滋病患者主要機會性感染和常見死亡原因之一。據報道，在撒哈拉地區，7% 的艾滋病患者會合并隱球菌感染[5]。隨著人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的流行，隱球菌病發病呈顯著增加趨勢。據報道，2014 年全球新發隱球菌性腦膜炎病例超過 22 萬例，死亡人數超過 18 萬人[6]。近年隨著高效抗逆轉錄病毒治療的應用，艾滋病相關隱球菌性腦膜炎的發病率已顯著下降。在我國，據調查，隱球菌病已經成為我國第二常見的侵襲性真菌感染性疾病[7]，但 50%～77% 的隱球菌性腦膜炎患者為免疫功能正常者[8-10]。而歐美、澳洲、南亞等地的流行病學數據顯示，在非艾滋病相關隱球菌性腦膜炎患者中，僅 7%～32% 的患者無明顯的免疫功能異常[11]。這是我國隱球菌病流行病學上與世界其他地區相比差異比較明顯的一個特性。另外，研究顯示，隱球菌病患者男性比例高于女性，年齡（>65 歲）是隱球菌病發生中樞神經受累的一個危險因素[12]。
2 隱球菌的分類
隱球菌屬于環境腐生菌，可從土壤和鴿糞中分離到。隱球菌屬至少包括 37 個種[13]。引起人類感染的隱球菌主要是新型隱球菌和格特隱球菌，其他種類隱球菌如羅倫隱球菌、淺白隱球菌等偶可引起人類感染。新型隱球菌和格特隱球菌常統稱為新型/格特隱球菌復合體（Cryptococcus gattii/neoformans species complexes）。新型隱球菌常感染免疫受損者，而格特隱球菌更好發于免疫功能正常人群[14-15]。根據傳統分型，新型隱球菌包括 3 個變種，即新型隱球菌格魯比變種（血清型 A 型，基因型 VNⅠ、VNⅡ 和 VNB）、新型隱球菌新生變種（血清型 D 型，基因型 VNⅣ）和新型隱球菌混合變種（血清型 AD 型，VNⅢ），分別命名為 Cryptococcus neoformans variety grubii、Cryptococcus neoformans variety neoformans 和 Cryptococcus neoformans AD hybrid。格特隱球菌不分變種統稱格特隱球菌，包括血清型 B 型和 C 型，基因型 VGⅠ-VGⅣ。但隨著研究方法的改進，有關隱球菌進化相關的研究越來越深入，新型/格特隱球菌復合體的分型問題引起了爭議。隱球菌分型的方法有隨機擴增 DNA 多態性技術[16]、小衛星（野生型噬菌體 M13）或微衛星［（GTG）5 和（GACA）4］特異引物擴增重復高變序列的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）指紋圖譜技術[17]、利用 EcoRⅠ和 MseⅠ限制性內切酶的擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分析技術[18]、URA5 基因的限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術、多位點微衛星類型分析技術[19]、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）技術[20]和全基因組序列分型技術[21]。其中 AFLP 技術和 MLST 技術分型效果得到公認。隨著新的隱球菌雜交體的發現，Hagen 等[22-23]總結了對新型/格特隱球菌復合體成員命名更新的建議，分別給新型/格特隱球菌復合體共 11 個種對應了新的命名，為菌名的正確書寫提供了全球范圍內通用的分類和命名規范，以期為隱球菌相關工作者和研究者提供參考。但就在 2019 年，Farrer 等[24]在贊比亞叢林又發現新型/格特隱球菌基因型 VGV，與 VGIV 有相同的 AFLP 圖譜。
目前認為，新型/格特隱球菌復合體中主要有 7 個菌種是人類和動物的病原菌，其中包括新型隱球菌的 2 個變種：Cryptococcus neoformans sensu stricto（血清型 A，基因型 AFLP1/VN Ⅰ、AFLP1A/VNB/VNⅡ和 AFLP1B/VNⅡ）和 Cryptococcus deneoformans（血清型 D，基因型 AFLP2/VNⅣ），以及格特隱球菌的 5 個變種[23-26]。研究表明，全球以新型隱球菌血清 A 型 VNⅠ基因型為臨床主要流行型別，我國同樣以新型隱球菌感染為主，格特隱球菌少見[27]。格特隱球菌主要分布在熱帶、亞熱帶地區，加拿大和美國西北太平洋沿岸等溫帶地區曾暴發流行，歐洲、美國東部地區也有發生[6]。但不同地區新型隱球菌和格特隱球菌所占的比例以及優勢型別不同，我國 Chen 等[14]收集中國 16 個省 1980 年—2006 年 300 株臨床分離隱球菌菌株，93.0% 為新型隱球菌 VNⅠ型，7.0% 為格特隱球菌 VGⅠ型。我國臺灣地區一項研究收集 1997 年—2010 年隱球菌臨床分離株，新型隱球菌和格特隱球菌分別占 95.9% 和 4.1%，同樣主要為 VNⅠ型（94.1%）[28]。而巴西一項研究收集 2006 年—2010 年隱球菌腦膜炎臨床分離株 62 株，其中格特隱球菌占比高達 21%[29]。在日本一次暴發性感染中分離到的是高毒力格特隱球菌 VGⅡa 型[30]。
核糖體 DNA 內轉錄間隔區（internal transcribed spacer region，ITS）測序和 MLST 分型不僅用于隱球菌的鑒定，也用于菌株間親緣關系的評價。MLST 技術能將大多數臨床隱球菌菌株分為不同的序列類型（sequence type，ST），MLST 技術用于隱球菌分型的研究有納入 4 個位點、7 個位點、10 個位點、11 個位點的[23]，目前 7 位點（CAP59、GPD1、LAC1、PLB1、SOD1、URA5 和 IGS1）MLST 分型法是國際人類和動物真菌學學會推薦的隱球菌分子分型方法。在不同人群中 ST 分布的差異已經被發現。我國以基因型 VNⅠ型和 ST5 型分布為主，一項包括 10 所醫院的多中心臨床研究 5 年共收集 303 株隱球菌臨床分離株，共鑒定 12 個 ST 型別，其中 ST5 占 89.2%[31]。
3 隱球菌的鑒定
隱球菌鑒定方法包括經典的墨汁染色法、培養鑒定法、分子鑒定法和蛋白鑒定法。
3.1 墨汁染色法
墨汁染色是快速鑒定新型隱球菌的重要方法之一。光學顯微鏡下可見新型隱球菌酵母細胞周圍有一圈透亮的厚莢膜。非 HIV 感染隱球菌腦膜炎患者腦脊液隱球菌墨汁染色靈敏度為 30%～50%，HIV 感染者靈敏度較其增高，可達 80%[32]。
3.2 培養鑒定法
新型/格特隱球菌在沙保羅培養基上 25℃ 和 37℃ 培養 2～4 d 均可見菌落生長。菌落生長后，通過 API-20C Aux、ID32C 和 VITEK2 微生物鑒定系統可以鑒定新型隱球菌和格特隱球菌。刀豆氨酸-甘氨酸-溴百里酚（canavanine-glycine-bromthymol，CGB）瓊脂能可靠地區分格特隱球菌（菌落產生藍色色素）和新型隱球菌（菌落顏色沒有變化），藍色是甘氨酸利用的結果[33]，但有些假絲酵母菌在 CGB 瓊脂上也呈藍色，需注意區分[34]。
3.3 分子鑒定法
在臨床實踐中，很少需要分子方法來確診疑似隱球菌病。然而，當培養不生長時（例如，在組織活檢切片中可見真菌但未生長純培養），或者當患者已接受大劑量抗真菌治療時，基于核酸的分子檢測法可以發揮很好的作用。在 PCR 體系中加入隱球菌的特異性引物，既可以對培養物進行鑒定，也可直接對血液、腦脊液、組織等樣本中的隱球菌進行鑒定。這些 PCR 方法有巢氏 PCR[35]、熒光 PCR[36]、多重 PCR[37]、恒溫擴增 PCR[38]、基于探針的微陣列法[39]，它們多以隱球菌 ITS 序列為靶標。當表型方法鑒定結果不明確時，還可以采用 DNA 測序法獲得核酸序列進行比對來鑒定菌種。
3.4 蛋白鑒定法
基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜分析鑒定系統是基于蛋白對菌種進行鑒別。很多實驗室自行擴增質譜數據庫以提高鑒定能力。研究表明，與傳統 AFLP、MLST 分型法相比較，質譜能很好地區分隱球菌不同血清型和分子型，對隱球菌有很好的鑒定效果，并能大大縮短鑒定時間[40]。
4 隱球菌感染部位與臨床特征
隱球菌可感染人的任何組織和器官，以中樞神經系統、肺部、皮膚以及播散感染為主，還可感染肝、腎、骨、關節等部位。
隱球菌在空氣中經呼吸道吸入肺部，多數健康人感染可以自愈或病變局限于肺部。但重度免疫抑制尤其是艾滋病患者，往往發生播散性隱球菌病，可發生急性重癥肺炎，表現為嚴重急性下呼吸道感染、高熱、呼吸困難，伴有明顯的低氧血癥，甚至發展為急性呼吸衰竭[41-42]。部分感染者發展為肺隱球菌病。肺隱球菌病臨床表現多種多樣，40% 為無癥狀性肺結節[43]，臨床癥狀可表現為咳嗽、咳少量黏液痰或血痰、伴發熱，部分患者可出現胸痛、咯血、乏力、盜汗等。肺隱球菌病孤立性病灶者，其外周血或血清隱球菌抗原檢測常為陰性[44]。
隱球菌在肺內被吞噬細胞吞噬后，經血液傳播，主要經跨細胞途徑[45]、“特洛伊木馬”轉運[46]和細胞旁通路[47-48]透過血腦屏障播散至腦，或隨神經或淋巴管入侵腦膜、蛛網膜下腔，形成病灶。隱球菌具有極強的嗜中樞性，與腦脊液內無抗隱球菌生長因子，高濃度的多巴胺、肌醇，以及隱球菌與膠質細胞存在受配體作用相關[49]。隱球菌腦膜炎常表現為亞急性或慢性病程，但有時表現為爆發性，早期癥狀和體征往往不特異，可表現為發熱、頭痛、咳嗽、呼吸困難，伴顱內壓增高引起的惡心、嘔吐、頸部僵硬、視覺癥狀、性格改變等[15, 50]。其他類型中樞神經系統隱球菌病如腦膜腦炎型、肉芽腫型和囊腫型，因有腦實質受累或占位，常伴有偏癱、失語或局限性癲癇發作等癥狀。中樞神經系統隱球菌病是隱球菌感染最常見的形式，而且預后嚴重，病死率高，即使經過正規的治療，仍有 25%～60% 的病死率[15, 50-52]。所以早期診斷非常重要。隱球菌莢膜多糖抗原（cryptococcal capsular polysaccharide antigen，CrAg）在隱球菌癥狀出現前 3 周就可以在血清中檢測到，血清或腦脊液中的莢膜多糖抗原陽性提示隱球菌感染，血清中 CrAg 滴度和患者的隱球菌腦膜炎發生率及病死率密切相關，滴度的高低提示疾病的嚴重程度[53]。
5 隱球菌藥敏試驗與藥物敏感性
隱球菌對棘白類抗真菌藥物天然耐藥，氟胞嘧啶、多烯類和三唑類均有抗隱球菌活性，但目前并沒有發布判定隱球菌對這些藥物敏感或非敏感的臨床折點。參考流行病學界值（epidemiological cut-off value，ECV），菌株可分為野生型與非野生型，非野生型通常被認為具有獲得性耐藥機制。但并非各種藥物均有 ECV，不同新型/格特隱球菌基因型對應的 ECV 也有差異。美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2020 年更新的 M59 提供了新型/格特隱球菌流行病學界值 ECV 參考表，藥敏試驗基于微量肉湯稀釋法[54]。該參考表僅提供了 VNⅠ、VGⅠ和 VGⅡ的 ECV，其他基因型暫無 ECV 參考信息。Espinel-Ingroff 等[55-56]的研究結果對新型/格特隱球菌復合體的 ECV 進行了補充，推薦的新型/格特隱球菌復合體各個種 ECV 范圍為：氟康唑 8～32 μg/mL，5-氟胞嘧啶 4～16 μg/mL，兩性霉素 B 0.5～1.0 μg/mL，而 VNⅣ對伏立康唑的 EVC 為 0.12 μg/mL。
臨床實驗室開展的隱球菌藥敏試驗包括微量肉湯稀釋法、E-test 真菌藥敏試條和 Rosco 紙片擴散法，可參照酵母菌肉湯稀釋法藥敏試驗標準方法[57]及酵母菌紙片擴散藥敏試驗方法[58]。常用的商品化微量肉湯稀釋法有 ATB Fungus 真菌藥敏試條和 Sensititre YeastOne?比色法真菌藥敏板。
世界多個地區都報道了隱球菌的藥物敏感性數據，結果存在一定地理差異性，但總體敏感性高[31, 59]，隱球菌出現獲得性耐藥是一種不常見的現象[60]。在我國一項 10 家醫院 5 年多的多中心研究中，303 株新型隱球菌菌株中，7.6%（23/303）的菌株對氟康唑為非野生型；7 株格特隱球菌菌株中，除 1 株對氟康唑最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）為 16 μg/mL 外，其他所有藥物均為野生型 MIC[31]。MIC 高于 ECV 的隱球菌菌株的出現值得關注，抗真菌藥物的 MIC 值升高與使用非標準治療方案有關，應引起更多的注意。
6 隱球菌病的治療
美國感染學會于 2000 年發布了隱球菌病的治療指南[61]，并于 2010 年對該指南進行了更新[62]，規范了隱球菌肺病與中樞神經系統隱球菌病的治療方案，將隱球菌腦膜腦炎患者更詳細地分為非 HIV 感染、非移植患者以及腎移植患者，調整了誘導期和鞏固期用藥時間，并且增加了維持期的用藥方案。我國 2010 年發布隱球菌感染診治專家共識[63]，對隱球菌病的治療與美國感染學會 2010 版相似。2018 年中華醫學會制訂針對隱球菌性腦膜炎的診治專家共識[27]，治療分為一般隱球菌腦膜炎的處理、難治性和復發性隱球菌性腦膜炎的處理，以及隱球菌性腦膜炎顱內高壓的處理；對一般隱球菌性腦膜炎的艾滋病患者和非艾滋病患者誘導期均首選兩性霉素 B［0.5～0.7 mg/（kg·d）］+氟胞嘧啶［100 mg/（kg·d）］治療至少 4 周，鞏固期首選氟康唑（600～800 mg/d）±氟胞嘧啶［100 mg/（kg·d）］或兩性霉素 B［0.5～0.7 mg/（kg·d）］±氟胞嘧啶［100 mg/（kg·d）］治療至少 6 周，非艾滋病患者未給出維持期治療方案，但艾滋病患者首選氟康唑 200 mg/d 維持治療至少 12 個月。
實驗室隱球菌抗原的檢測對 HIV 感染人群是否發生隱球菌感染以及指導隱球菌感染的治療有重要意義。世界衛生組織建議當 CD4 細胞<100 個/μL 時需監測血清 CrAg[6]。我國浙江省艾滋病患者隱球菌感染篩查專家共識建議當 CD4 細胞<200 個/μL 時需監測血清 CrAg[64]，若血清 CrAg 陽性，需對抗原的滴度進行定量檢測并進行腦脊液 CrAg 檢測。血清 CrAg 滴度<1∶160，且患者無癥狀時，可口服氟康唑控制滴度增高；患者有肺部癥狀，或分離到隱球菌，可終身口服氟康唑 200～400 mg/d 或口服伊曲康唑 200～400 mg/d，或服用氟康唑 400 mg/d 加氟胞嘧啶 100～150 mg/（kg·d）時長 10 周[61]。滴度>1∶160 時，需檢測腦脊液 CrAg，警惕腦膜炎發生當滴度>1∶512 時，按隱球菌腦膜炎治療[65]。
研究表明隱球菌病的持續感染和復發與氟康唑治療中耐藥性增高高度相關，誘導期單藥使用低劑量氟康唑是氟康唑耐藥性產生的最主要危險因素[66]，且導致復發率增高[67]。重新治療方案的制定需緊密聯系實驗室抗真菌藥物敏感性測定結果，應測定持續感染和復發菌株的 MIC，如果氟康唑 MIC≥16 mg/L 或氟胞嘧啶 MIC≥32 mg/L，或者治療過程出現 MIC 較前升高至少 3 個稀釋度，需考慮更換其他藥物治療。有推薦新的三唑類藥物與兩性霉素 B 或氟胞嘧啶聯合使用，如伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑[68]。伏立康唑還適應于腎功能不全、腎衰竭、兩性霉素 B 治療失敗的復雜隱球菌病腦膜炎患者的治療[69]。
7 結語
隱球菌病是一種嚴重威脅人類健康的疾病，近年來隱球菌病發病率有增高趨勢，引起了社會廣泛關注，實驗室檢測隱球菌感染的能力在逐步提高，包括近年來多種隱球菌抗原檢測技術、分子檢測技術及質譜技術的應用。分子技術既能檢測、鑒定隱球菌，還能對隱球菌進行基因分型。引起隱球菌病的隱球菌菌種、血清型、分子型別和抗藥譜具有地理特異性。近年來新型/格特隱球菌復合體內新的雜合體菌種被發現，命名隨著更新和進一步規范化。隱球菌感染部位多樣，播散性感染和累及中樞神經系統的感染預后嚴重，臨床不僅需要規范化抗真菌治療方案，還需要緊密結合實驗室藥物敏感性結果調整治療方案，一方面提高治療效果，另一方面減少不規范用藥誘導的抗藥性的增加。
近年來，隨著艾滋病感染者的增加，器官移植、皮質激素和免疫抑制劑的使用，腫瘤放射化學治療以及肝硬化、腎功能不全和糖尿病等基礎疾病患者的增加，隱球菌感染在全球范圍逐漸增加，且病死率居高不下。我國隱球菌感染有其較獨特的特點。首先，相當部分的隱球菌感染者并非伴有明顯的免疫缺陷，更似乎是免疫力正常的“健康人”；其次，與世界各地臨床分離隱球菌分子流行病學相比，我國有相對獨特的主要流行分子型別，但不明確是否與人種遺傳基因選擇性壓力或菌株的毒力與適應性相關；再次，我國部分地區已出現對傳統抗真菌藥物耐藥的菌株，并且耐藥率在地區間的分布存在差異，該菌的耐藥現象需引起臨床的重視。目前，尤其是近 10 年來，隱球菌病引起了臨床工作者及研究者高度的重視，無論是對隱球菌本身，還是隱球菌與人類宿主間相互作用的機制，都取得了較大的進展，但依然相對落后于對其他臨床常見病原菌的認識程度。本文將從近年來隱球菌的分類與命名、實驗室檢測手段、藥物敏感性試驗（藥敏試驗）、臨床感染的特征和治療方案等方面的進展進行綜述，以期提高臨床與實驗室對該菌的認識，及時診斷，早期治療，改善患者預后。
1 概述
隱球菌是一種條件致病菌，但又是嚴重威脅人類生命健康的深部真菌，它既感染免疫功能低下人群[1]，也能感染免疫力正常者[2-3]。免疫功能低下人群通常指艾滋病、器官移植、長期使用免疫抑制劑、惡性腫瘤患者，以及嚴重肝硬化、腎病、糖尿病等基礎疾病患者[1, 4]。隱球菌感染是艾滋病患者主要機會性感染和常見死亡原因之一。據報道，在撒哈拉地區，7% 的艾滋病患者會合并隱球菌感染[5]。隨著人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的流行，隱球菌病發病呈顯著增加趨勢。據報道，2014 年全球新發隱球菌性腦膜炎病例超過 22 萬例，死亡人數超過 18 萬人[6]。近年隨著高效抗逆轉錄病毒治療的應用，艾滋病相關隱球菌性腦膜炎的發病率已顯著下降。在我國，據調查，隱球菌病已經成為我國第二常見的侵襲性真菌感染性疾病[7]，但 50%～77% 的隱球菌性腦膜炎患者為免疫功能正常者[8-10]。而歐美、澳洲、南亞等地的流行病學數據顯示，在非艾滋病相關隱球菌性腦膜炎患者中，僅 7%～32% 的患者無明顯的免疫功能異常[11]。這是我國隱球菌病流行病學上與世界其他地區相比差異比較明顯的一個特性。另外，研究顯示，隱球菌病患者男性比例高于女性，年齡（>65 歲）是隱球菌病發生中樞神經受累的一個危險因素[12]。
2 隱球菌的分類
隱球菌屬于環境腐生菌，可從土壤和鴿糞中分離到。隱球菌屬至少包括 37 個種[13]。引起人類感染的隱球菌主要是新型隱球菌和格特隱球菌，其他種類隱球菌如羅倫隱球菌、淺白隱球菌等偶可引起人類感染。新型隱球菌和格特隱球菌常統稱為新型/格特隱球菌復合體（Cryptococcus gattii/neoformans species complexes）。新型隱球菌常感染免疫受損者，而格特隱球菌更好發于免疫功能正常人群[14-15]。根據傳統分型，新型隱球菌包括 3 個變種，即新型隱球菌格魯比變種（血清型 A 型，基因型 VNⅠ、VNⅡ 和 VNB）、新型隱球菌新生變種（血清型 D 型，基因型 VNⅣ）和新型隱球菌混合變種（血清型 AD 型，VNⅢ），分別命名為 Cryptococcus neoformans variety grubii、Cryptococcus neoformans variety neoformans 和 Cryptococcus neoformans AD hybrid。格特隱球菌不分變種統稱格特隱球菌，包括血清型 B 型和 C 型，基因型 VGⅠ-VGⅣ。但隨著研究方法的改進，有關隱球菌進化相關的研究越來越深入，新型/格特隱球菌復合體的分型問題引起了爭議。隱球菌分型的方法有隨機擴增 DNA 多態性技術[16]、小衛星（野生型噬菌體 M13）或微衛星［（GTG）5 和（GACA）4］特異引物擴增重復高變序列的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）指紋圖譜技術[17]、利用 EcoRⅠ和 MseⅠ限制性內切酶的擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分析技術[18]、URA5 基因的限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術、多位點微衛星類型分析技術[19]、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）技術[20]和全基因組序列分型技術[21]。其中 AFLP 技術和 MLST 技術分型效果得到公認。隨著新的隱球菌雜交體的發現，Hagen 等[22-23]總結了對新型/格特隱球菌復合體成員命名更新的建議，分別給新型/格特隱球菌復合體共 11 個種對應了新的命名，為菌名的正確書寫提供了全球范圍內通用的分類和命名規范，以期為隱球菌相關工作者和研究者提供參考。但就在 2019 年，Farrer 等[24]在贊比亞叢林又發現新型/格特隱球菌基因型 VGV，與 VGIV 有相同的 AFLP 圖譜。
目前認為，新型/格特隱球菌復合體中主要有 7 個菌種是人類和動物的病原菌，其中包括新型隱球菌的 2 個變種：Cryptococcus neoformans sensu stricto（血清型 A，基因型 AFLP1/VN Ⅰ、AFLP1A/VNB/VNⅡ和 AFLP1B/VNⅡ）和 Cryptococcus deneoformans（血清型 D，基因型 AFLP2/VNⅣ），以及格特隱球菌的 5 個變種[23-26]。研究表明，全球以新型隱球菌血清 A 型 VNⅠ基因型為臨床主要流行型別，我國同樣以新型隱球菌感染為主，格特隱球菌少見[27]。格特隱球菌主要分布在熱帶、亞熱帶地區，加拿大和美國西北太平洋沿岸等溫帶地區曾暴發流行，歐洲、美國東部地區也有發生[6]。但不同地區新型隱球菌和格特隱球菌所占的比例以及優勢型別不同，我國 Chen 等[14]收集中國 16 個省 1980 年—2006 年 300 株臨床分離隱球菌菌株，93.0% 為新型隱球菌 VNⅠ型，7.0% 為格特隱球菌 VGⅠ型。我國臺灣地區一項研究收集 1997 年—2010 年隱球菌臨床分離株，新型隱球菌和格特隱球菌分別占 95.9% 和 4.1%，同樣主要為 VNⅠ型（94.1%）[28]。而巴西一項研究收集 2006 年—2010 年隱球菌腦膜炎臨床分離株 62 株，其中格特隱球菌占比高達 21%[29]。在日本一次暴發性感染中分離到的是高毒力格特隱球菌 VGⅡa 型[30]。
核糖體 DNA 內轉錄間隔區（internal transcribed spacer region，ITS）測序和 MLST 分型不僅用于隱球菌的鑒定，也用于菌株間親緣關系的評價。MLST 技術能將大多數臨床隱球菌菌株分為不同的序列類型（sequence type，ST），MLST 技術用于隱球菌分型的研究有納入 4 個位點、7 個位點、10 個位點、11 個位點的[23]，目前 7 位點（CAP59、GPD1、LAC1、PLB1、SOD1、URA5 和 IGS1）MLST 分型法是國際人類和動物真菌學學會推薦的隱球菌分子分型方法。在不同人群中 ST 分布的差異已經被發現。我國以基因型 VNⅠ型和 ST5 型分布為主，一項包括 10 所醫院的多中心臨床研究 5 年共收集 303 株隱球菌臨床分離株，共鑒定 12 個 ST 型別，其中 ST5 占 89.2%[31]。
3 隱球菌的鑒定
隱球菌鑒定方法包括經典的墨汁染色法、培養鑒定法、分子鑒定法和蛋白鑒定法。
3.1 墨汁染色法
墨汁染色是快速鑒定新型隱球菌的重要方法之一。光學顯微鏡下可見新型隱球菌酵母細胞周圍有一圈透亮的厚莢膜。非 HIV 感染隱球菌腦膜炎患者腦脊液隱球菌墨汁染色靈敏度為 30%～50%，HIV 感染者靈敏度較其增高，可達 80%[32]。
3.2 培養鑒定法
新型/格特隱球菌在沙保羅培養基上 25℃ 和 37℃ 培養 2～4 d 均可見菌落生長。菌落生長后，通過 API-20C Aux、ID32C 和 VITEK2 微生物鑒定系統可以鑒定新型隱球菌和格特隱球菌。刀豆氨酸-甘氨酸-溴百里酚（canavanine-glycine-bromthymol，CGB）瓊脂能可靠地區分格特隱球菌（菌落產生藍色色素）和新型隱球菌（菌落顏色沒有變化），藍色是甘氨酸利用的結果[33]，但有些假絲酵母菌在 CGB 瓊脂上也呈藍色，需注意區分[34]。
3.3 分子鑒定法
在臨床實踐中，很少需要分子方法來確診疑似隱球菌病。然而，當培養不生長時（例如，在組織活檢切片中可見真菌但未生長純培養），或者當患者已接受大劑量抗真菌治療時，基于核酸的分子檢測法可以發揮很好的作用。在 PCR 體系中加入隱球菌的特異性引物，既可以對培養物進行鑒定，也可直接對血液、腦脊液、組織等樣本中的隱球菌進行鑒定。這些 PCR 方法有巢氏 PCR[35]、熒光 PCR[36]、多重 PCR[37]、恒溫擴增 PCR[38]、基于探針的微陣列法[39]，它們多以隱球菌 ITS 序列為靶標。當表型方法鑒定結果不明確時，還可以采用 DNA 測序法獲得核酸序列進行比對來鑒定菌種。
3.4 蛋白鑒定法
基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜分析鑒定系統是基于蛋白對菌種進行鑒別。很多實驗室自行擴增質譜數據庫以提高鑒定能力。研究表明，與傳統 AFLP、MLST 分型法相比較，質譜能很好地區分隱球菌不同血清型和分子型，對隱球菌有很好的鑒定效果，并能大大縮短鑒定時間[40]。
4 隱球菌感染部位與臨床特征
隱球菌可感染人的任何組織和器官，以中樞神經系統、肺部、皮膚以及播散感染為主，還可感染肝、腎、骨、關節等部位。
隱球菌在空氣中經呼吸道吸入肺部，多數健康人感染可以自愈或病變局限于肺部。但重度免疫抑制尤其是艾滋病患者，往往發生播散性隱球菌病，可發生急性重癥肺炎，表現為嚴重急性下呼吸道感染、高熱、呼吸困難，伴有明顯的低氧血癥，甚至發展為急性呼吸衰竭[41-42]。部分感染者發展為肺隱球菌病。肺隱球菌病臨床表現多種多樣，40% 為無癥狀性肺結節[43]，臨床癥狀可表現為咳嗽、咳少量黏液痰或血痰、伴發熱，部分患者可出現胸痛、咯血、乏力、盜汗等。肺隱球菌病孤立性病灶者，其外周血或血清隱球菌抗原檢測常為陰性[44]。
隱球菌在肺內被吞噬細胞吞噬后，經血液傳播，主要經跨細胞途徑[45]、“特洛伊木馬”轉運[46]和細胞旁通路[47-48]透過血腦屏障播散至腦，或隨神經或淋巴管入侵腦膜、蛛網膜下腔，形成病灶。隱球菌具有極強的嗜中樞性，與腦脊液內無抗隱球菌生長因子，高濃度的多巴胺、肌醇，以及隱球菌與膠質細胞存在受配體作用相關[49]。隱球菌腦膜炎常表現為亞急性或慢性病程，但有時表現為爆發性，早期癥狀和體征往往不特異，可表現為發熱、頭痛、咳嗽、呼吸困難，伴顱內壓增高引起的惡心、嘔吐、頸部僵硬、視覺癥狀、性格改變等[15, 50]。其他類型中樞神經系統隱球菌病如腦膜腦炎型、肉芽腫型和囊腫型，因有腦實質受累或占位，常伴有偏癱、失語或局限性癲癇發作等癥狀。中樞神經系統隱球菌病是隱球菌感染最常見的形式，而且預后嚴重，病死率高，即使經過正規的治療，仍有 25%～60% 的病死率[15, 50-52]。所以早期診斷非常重要。隱球菌莢膜多糖抗原（cryptococcal capsular polysaccharide antigen，CrAg）在隱球菌癥狀出現前 3 周就可以在血清中檢測到，血清或腦脊液中的莢膜多糖抗原陽性提示隱球菌感染，血清中 CrAg 滴度和患者的隱球菌腦膜炎發生率及病死率密切相關，滴度的高低提示疾病的嚴重程度[53]。
5 隱球菌藥敏試驗與藥物敏感性
隱球菌對棘白類抗真菌藥物天然耐藥，氟胞嘧啶、多烯類和三唑類均有抗隱球菌活性，但目前并沒有發布判定隱球菌對這些藥物敏感或非敏感的臨床折點。參考流行病學界值（epidemiological cut-off value，ECV），菌株可分為野生型與非野生型，非野生型通常被認為具有獲得性耐藥機制。但并非各種藥物均有 ECV，不同新型/格特隱球菌基因型對應的 ECV 也有差異。美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2020 年更新的 M59 提供了新型/格特隱球菌流行病學界值 ECV 參考表，藥敏試驗基于微量肉湯稀釋法[54]。該參考表僅提供了 VNⅠ、VGⅠ和 VGⅡ的 ECV，其他基因型暫無 ECV 參考信息。Espinel-Ingroff 等[55-56]的研究結果對新型/格特隱球菌復合體的 ECV 進行了補充，推薦的新型/格特隱球菌復合體各個種 ECV 范圍為：氟康唑 8～32 μg/mL，5-氟胞嘧啶 4～16 μg/mL，兩性霉素 B 0.5～1.0 μg/mL，而 VNⅣ對伏立康唑的 EVC 為 0.12 μg/mL。
臨床實驗室開展的隱球菌藥敏試驗包括微量肉湯稀釋法、E-test 真菌藥敏試條和 Rosco 紙片擴散法，可參照酵母菌肉湯稀釋法藥敏試驗標準方法[57]及酵母菌紙片擴散藥敏試驗方法[58]。常用的商品化微量肉湯稀釋法有 ATB Fungus 真菌藥敏試條和 Sensititre YeastOne?比色法真菌藥敏板。
世界多個地區都報道了隱球菌的藥物敏感性數據，結果存在一定地理差異性，但總體敏感性高[31, 59]，隱球菌出現獲得性耐藥是一種不常見的現象[60]。在我國一項 10 家醫院 5 年多的多中心研究中，303 株新型隱球菌菌株中，7.6%（23/303）的菌株對氟康唑為非野生型；7 株格特隱球菌菌株中，除 1 株對氟康唑最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）為 16 μg/mL 外，其他所有藥物均為野生型 MIC[31]。MIC 高于 ECV 的隱球菌菌株的出現值得關注，抗真菌藥物的 MIC 值升高與使用非標準治療方案有關，應引起更多的注意。
6 隱球菌病的治療
美國感染學會于 2000 年發布了隱球菌病的治療指南[61]，并于 2010 年對該指南進行了更新[62]，規范了隱球菌肺病與中樞神經系統隱球菌病的治療方案，將隱球菌腦膜腦炎患者更詳細地分為非 HIV 感染、非移植患者以及腎移植患者，調整了誘導期和鞏固期用藥時間，并且增加了維持期的用藥方案。我國 2010 年發布隱球菌感染診治專家共識[63]，對隱球菌病的治療與美國感染學會 2010 版相似。2018 年中華醫學會制訂針對隱球菌性腦膜炎的診治專家共識[27]，治療分為一般隱球菌腦膜炎的處理、難治性和復發性隱球菌性腦膜炎的處理，以及隱球菌性腦膜炎顱內高壓的處理；對一般隱球菌性腦膜炎的艾滋病患者和非艾滋病患者誘導期均首選兩性霉素 B［0.5～0.7 mg/（kg·d）］+氟胞嘧啶［100 mg/（kg·d）］治療至少 4 周，鞏固期首選氟康唑（600～800 mg/d）±氟胞嘧啶［100 mg/（kg·d）］或兩性霉素 B［0.5～0.7 mg/（kg·d）］±氟胞嘧啶［100 mg/（kg·d）］治療至少 6 周，非艾滋病患者未給出維持期治療方案，但艾滋病患者首選氟康唑 200 mg/d 維持治療至少 12 個月。
實驗室隱球菌抗原的檢測對 HIV 感染人群是否發生隱球菌感染以及指導隱球菌感染的治療有重要意義。世界衛生組織建議當 CD4 細胞<100 個/μL 時需監測血清 CrAg[6]。我國浙江省艾滋病患者隱球菌感染篩查專家共識建議當 CD4 細胞<200 個/μL 時需監測血清 CrAg[64]，若血清 CrAg 陽性，需對抗原的滴度進行定量檢測并進行腦脊液 CrAg 檢測。血清 CrAg 滴度<1∶160，且患者無癥狀時，可口服氟康唑控制滴度增高；患者有肺部癥狀，或分離到隱球菌，可終身口服氟康唑 200～400 mg/d 或口服伊曲康唑 200～400 mg/d，或服用氟康唑 400 mg/d 加氟胞嘧啶 100～150 mg/（kg·d）時長 10 周[61]。滴度>1∶160 時，需檢測腦脊液 CrAg，警惕腦膜炎發生當滴度>1∶512 時，按隱球菌腦膜炎治療[65]。
研究表明隱球菌病的持續感染和復發與氟康唑治療中耐藥性增高高度相關，誘導期單藥使用低劑量氟康唑是氟康唑耐藥性產生的最主要危險因素[66]，且導致復發率增高[67]。重新治療方案的制定需緊密聯系實驗室抗真菌藥物敏感性測定結果，應測定持續感染和復發菌株的 MIC，如果氟康唑 MIC≥16 mg/L 或氟胞嘧啶 MIC≥32 mg/L，或者治療過程出現 MIC 較前升高至少 3 個稀釋度，需考慮更換其他藥物治療。有推薦新的三唑類藥物與兩性霉素 B 或氟胞嘧啶聯合使用，如伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑[68]。伏立康唑還適應于腎功能不全、腎衰竭、兩性霉素 B 治療失敗的復雜隱球菌病腦膜炎患者的治療[69]。
7 結語
隱球菌病是一種嚴重威脅人類健康的疾病，近年來隱球菌病發病率有增高趨勢，引起了社會廣泛關注，實驗室檢測隱球菌感染的能力在逐步提高，包括近年來多種隱球菌抗原檢測技術、分子檢測技術及質譜技術的應用。分子技術既能檢測、鑒定隱球菌，還能對隱球菌進行基因分型。引起隱球菌病的隱球菌菌種、血清型、分子型別和抗藥譜具有地理特異性。近年來新型/格特隱球菌復合體內新的雜合體菌種被發現，命名隨著更新和進一步規范化。隱球菌感染部位多樣，播散性感染和累及中樞神經系統的感染預后嚴重，臨床不僅需要規范化抗真菌治療方案，還需要緊密結合實驗室藥物敏感性結果調整治療方案，一方面提高治療效果，另一方面減少不規范用藥誘導的抗藥性的增加。