新型冠狀病毒肺炎暴發以來，醫院實驗室成為檢測疑似或確診患者各類標本的重要場所。確診患者的臨床標本中可能存在高載量的 2019 新型冠狀病毒，生物安全風險較高，故對醫院實驗室檢測流程提出挑戰。該文比較了臨床微生物傳統檢測流程和全自動微生物流水線的微生物前處理、培養、鑒定及藥敏分析，對病原微生物傳統手工檢測流程在此次疫情下存在的生物安全風險進行闡述，同時探討了全自動微生物流水線在疫情中的生物安全保障作用及困境，旨在為未來全自動微生物流水線的推廣提供一定依據。
引用本文： 黃學東, 肖玉玲, 李冬冬, 謝軼. 新型冠狀病毒肺炎疫情下應用全自動微生物流水線的思考. 華西醫學, 2020, 35(8): 901-904. doi: 10.7507/1002-0179.202006033 復制
此次新型冠狀病毒肺炎疫情暴發后，除病毒檢測工作外，臨床微生物實驗室承擔了很多鑒別診斷檢測。新型冠狀病毒肺炎確診患者的臨床標本中可能存在高載量的 2019 新型冠狀病毒，微生物標本不可滅活且類型多樣，手工操作多，產生氣溶膠的可能性大。盡管檢驗人員按《醫療機構內新型冠狀病毒感染預防與控制技術指南（第一版）》[1]要求進行三級生物安全實驗室的個人防護，但臨床微生物檢驗工作生物安全風險仍然難以避免。因此，臨床微生物實驗室面臨工作量和生物安全風險增加的雙重挑戰。本文介紹了 Kiestra（美國 BD 公司）和 WASPLab（法國生物梅里埃股份有限公司）這 2 種全自動微生物流水線，兩者均具有多個模塊，并由軌道連接，可實現自動接種、培養、開蓋、拍照、判讀，比較了臨床微生物傳統檢測流程和全自動微生物流水線的微生物前處理、培養、鑒定及藥敏分析，對病原微生物傳統手工檢測方法存在的生物安全風險與全自動微生物流水線的生物安全功能進行探討，對全自動微生物流水線在重大公共衛生突發事件中的生物安全保障作用進行闡述，旨在為未來全自動微生物流水線的推廣提供一定依據。
1 標本前處理
1.1 傳統前處理流程
臨床微生物傳統前處理流程復雜，主要表現在標本類型、涂片、培養、藥敏方式多樣。微生物標本類型常包括深部呼吸道標本、血液、尿液、糞便、腦脊液、各類無菌體液、導管標本、病理組織等。標本送至實驗室，技術人員根據標本來源及醫囑目的進行手工涂片染色和選擇培養。病原微生物分離方法多種，如平板劃線、斜面接種、液體接種、穿刺接種、涂布接種等；其中劃線方法又分為分區劃線、連續劃線、棋盤劃線等。標本前處理過程繁雜，容易產生大量的氣溶膠，雖處理過程在Ⅱ級生物安全柜中開蓋操作，但面對 2019 新型冠狀病毒感染的重癥或危重癥患者的微生物培養標本，發生皮膚暴露、手套破損、操作臺面污染等風險暴露時若處置不當，則會間接增加實驗室生物安全風險[2-3]。2019 新型冠狀病毒的主要傳播途徑是呼吸道飛沫及密切接觸，且該病毒對紫外線、熱（56℃ 持續 30 min）敏感，乙醚、75% 乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸、氯仿等脂溶劑均可將其滅活[4]。目前，2019 新型冠狀病毒在呼吸道標本、尿液和糞便標本都可分離到，應注意氣溶膠和接觸傳播[5-6]。在允許的情況下，部分檢驗項目可對標本滅活再進行檢測，如進行 2019 新型冠狀病毒核酸檢測時，常在 56℃ 下對標本滅活 45 min，再進行提取及擴增實驗以降低生物安全風險[7]。然而，臨床微生物檢驗以檢測病原體為目的，標本不能滅活，而需在保證標本中生命活性的前提下進行操作，生物安全風險大大增加。
1.2 全自動微生物流水線的前處理
新型冠狀病毒肺炎疫情下，如何運用全自動微生物流水線有效避免生物安全暴露是值得討論的問題。全自動流水線前處理系統主要有以下幾個特點：① 利用機械臂，自動打開患者標本容器，進行挑取和涂布，避免人工操作導致氣溶膠產生；② 利用磁力驅動磁珠滾動或模擬接種環，在培養基平面劃線，劃線過程為全封閉（磁珠）或全開蓋（接種環）；③ 多種劃線模式，可根據不同標本類型進行選擇，如呼吸道標本選擇分區劃線，尿液選擇連續劃線等；④ 自帶Ⅱ級生物安全柜或高效過濾器，保證生物安全性（表 1）。檢測 2019 新型冠狀病毒感染或疑似感染患者的呼吸道、尿液、糞便標本時，使用自動化前處理系統可以減少人員操作，減少氣溶膠產生，降低生物安全風險，降低操作人員的感染風險，最大限度保護操作人員。
表1
全自動微生物流水線前處理系統的生物安全性
2 微生物培養過程
2.1 傳統培養過程
完成標本接種分離后，需選擇不同營養條件、溫度濕度、氣體環境對病原微生物進行培養。常用培養溫度為 37℃，濕度 95%。培養箱溫濕度適中，利于病原體生長，也利于病毒存活。目前對 2019 新型冠狀病毒理化特性的認識基于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒的研究[1]，嚴重急性呼吸綜合征病毒在 37℃ 下可存活 4 d，在室溫 24℃ 下病毒在尿液中至少存活 10 d，在腹瀉患者的痰液和糞便里可存活 5 d 以上，在血液中可存活約 15 d，在塑料、玻璃、金屬、布料、復印紙等多種物體表面均可存活 2～3 d[8]。新型冠狀病毒肺炎疫情期間，微生物培養過程的生物安全風險性較以往提高，經過 24 h 培養，對病原體進行選擇鑒定時需進行開蓋觀察菌落形態、革蘭染色、分純菌落、細菌生化試驗等操作。培養皿中濕度很高，開蓋時大量氣溶膠溢出，易造成污染。
2.2 全自動微生物流水線的培養過程
流水線前處理系統通過軌道將完成接種的平板傳送到智能培養箱中培養，此過程有效縮短為 6～10 h[9-10]，降低了傳統微生物前處理分離后通過人工傳送至專用培養箱孵育過程中開箱時氣溶膠感染風險。傳送智能培養箱除提供傳統培養箱相同功能外，還具有軌道傳遞、自動拍照和自動卸載等功能（表 2）。智能培養箱的動態數字成像系統可實時監測細菌生長情況，并可根據實驗室需求自定義拍攝時間和間隔。通過專用的培養基數字影像分析工作站即刻觀察菌落情況，避免了人工開蓋觀察的生物安全風險，減少了工作量。微生物自動化流水線的應用促使實驗室生物安全管理及實驗室醫療廢物管理頻率減少 10%～20%[11]。
表2
全自動微生物流水線智能培養箱基本參數
3 微生物鑒定及藥敏分析
3.1 傳統微生物鑒定及藥敏分析
傳統微生物鑒定及藥敏分析過程中手工程序較多，主要包括取純菌落配制菌懸液、菌液轉移、手工藥敏操作及判讀等各環節。其中配置 0.5 麥氏濁度單位菌懸液為開蓋、開管操作，菌液轉移、涂布平板以及藥敏分析往往也為半開放式操作。因病原菌種類不同，0.5 麥氏濁度單位對應細菌數量不同，但通常認為相當于 1.5×108麥氏濁度單位/mL。因此，鑒定及藥敏分析操作中病原體濃度高，產生帶有感染因子氣溶膠的可能性大。鑒定及藥敏分析過程需要規范操作，防止意外事件發生。新型冠狀病毒肺炎疫情暴發后，微生物鑒定及藥敏分析流程的生物安全問題更加值得重視。
3.2 全自動微生物流水線的鑒定及藥敏分析
與全自動微生物流水線相連的自動化鑒定及藥敏分析模塊中的鑒定部分在國外已經上市（圖 1）。該模塊可從智能培養箱調取平板，通過軌道傳送到制備模塊和鑒定及藥敏分析模塊。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜具有快速、靈敏、準確、高通量及易自動化等特點，是微生物快速鑒定技術中里程碑式的變革[12-13]。目前，獨立運行的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜工作站在我國各級醫院已有不少應用。全自動流水線與基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜自動化接口已實現，可進行鑒定及藥敏分析工作，全/半封閉進行病原菌挑取、點靶、菌懸液制備、轉移、條碼識別、鑒定及藥敏結果讀取等，大大降低了操作人員被感染的概率。
圖1
全自動微生物流水線模塊示意圖
本文展示的全自動微生物流水線模塊僅模擬全自動流水線模塊布局，與上市產品略有不同。1：平板自動分選；2：平板條碼標簽；3：接種與劃線模塊；4：高清屏幕工作站；5：智能培養箱；6：平板堆疊模塊；7：質譜靶板制備模塊（未上市）；8：質譜；9：藥敏制備模塊（未上市）；10：自動鑒定藥敏儀（國外上市）；11：軌道系統
4 小結與展望
此次新型冠狀病毒肺炎疫情下，實驗室人員進行臨床標本檢測時應規范防護，防止過度與不足[14]。保障實驗室生物安全是戰勝新型冠狀病毒肺炎疫情的關鍵，需要深入排查風險點，制定針對不同風險級別的安全制度[15]。全自動微生物流水線有效降低了微生物前處理到鑒定及藥敏分析各個環節的生物安全風險，為實驗室生物安全提供了更多保障。需要強調的是，所有感染或疑似感染 2019 新型冠狀病毒的標本在轉運、檢測、處理和銷毀時，均應嚴格按照《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》執行[16]。全自動微生物流水線的應用，帶來了新的生物安全風險管理模式，但流水線并不是完美的方案，在其應用過程中還會出現各種困難和問題，如全自動微生物流水線軌道系統是否可在密閉環境中完成標本傳輸；智能培養箱成像系統在開蓋拍照時局部產生的氣溶膠該如何生物安全保障，可否增加移動式設備（紫外燈、空氣消毒器）進行間斷性消毒；成像系統與培養箱相通，開蓋拍照后產生的氣溶膠是否進入孵箱，是否具備滅活系統進行孵箱環境處理等，都需要不斷思考與總結。臨床微生物實驗室應加強生物安全管理，發揮和完善全自動微生物流水線在面對重大公共衛生突發事件中的生物安全功能。
此次新型冠狀病毒肺炎疫情暴發后，除病毒檢測工作外，臨床微生物實驗室承擔了很多鑒別診斷檢測。新型冠狀病毒肺炎確診患者的臨床標本中可能存在高載量的 2019 新型冠狀病毒，微生物標本不可滅活且類型多樣，手工操作多，產生氣溶膠的可能性大。盡管檢驗人員按《醫療機構內新型冠狀病毒感染預防與控制技術指南（第一版）》[1]要求進行三級生物安全實驗室的個人防護，但臨床微生物檢驗工作生物安全風險仍然難以避免。因此，臨床微生物實驗室面臨工作量和生物安全風險增加的雙重挑戰。本文介紹了 Kiestra（美國 BD 公司）和 WASPLab（法國生物梅里埃股份有限公司）這 2 種全自動微生物流水線，兩者均具有多個模塊，并由軌道連接，可實現自動接種、培養、開蓋、拍照、判讀，比較了臨床微生物傳統檢測流程和全自動微生物流水線的微生物前處理、培養、鑒定及藥敏分析，對病原微生物傳統手工檢測方法存在的生物安全風險與全自動微生物流水線的生物安全功能進行探討，對全自動微生物流水線在重大公共衛生突發事件中的生物安全保障作用進行闡述，旨在為未來全自動微生物流水線的推廣提供一定依據。
1 標本前處理
1.1 傳統前處理流程
臨床微生物傳統前處理流程復雜，主要表現在標本類型、涂片、培養、藥敏方式多樣。微生物標本類型常包括深部呼吸道標本、血液、尿液、糞便、腦脊液、各類無菌體液、導管標本、病理組織等。標本送至實驗室，技術人員根據標本來源及醫囑目的進行手工涂片染色和選擇培養。病原微生物分離方法多種，如平板劃線、斜面接種、液體接種、穿刺接種、涂布接種等；其中劃線方法又分為分區劃線、連續劃線、棋盤劃線等。標本前處理過程繁雜，容易產生大量的氣溶膠，雖處理過程在Ⅱ級生物安全柜中開蓋操作，但面對 2019 新型冠狀病毒感染的重癥或危重癥患者的微生物培養標本，發生皮膚暴露、手套破損、操作臺面污染等風險暴露時若處置不當，則會間接增加實驗室生物安全風險[2-3]。2019 新型冠狀病毒的主要傳播途徑是呼吸道飛沫及密切接觸，且該病毒對紫外線、熱（56℃ 持續 30 min）敏感，乙醚、75% 乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸、氯仿等脂溶劑均可將其滅活[4]。目前，2019 新型冠狀病毒在呼吸道標本、尿液和糞便標本都可分離到，應注意氣溶膠和接觸傳播[5-6]。在允許的情況下，部分檢驗項目可對標本滅活再進行檢測，如進行 2019 新型冠狀病毒核酸檢測時，常在 56℃ 下對標本滅活 45 min，再進行提取及擴增實驗以降低生物安全風險[7]。然而，臨床微生物檢驗以檢測病原體為目的，標本不能滅活，而需在保證標本中生命活性的前提下進行操作，生物安全風險大大增加。
1.2 全自動微生物流水線的前處理
新型冠狀病毒肺炎疫情下，如何運用全自動微生物流水線有效避免生物安全暴露是值得討論的問題。全自動流水線前處理系統主要有以下幾個特點：① 利用機械臂，自動打開患者標本容器，進行挑取和涂布，避免人工操作導致氣溶膠產生；② 利用磁力驅動磁珠滾動或模擬接種環，在培養基平面劃線，劃線過程為全封閉（磁珠）或全開蓋（接種環）；③ 多種劃線模式，可根據不同標本類型進行選擇，如呼吸道標本選擇分區劃線，尿液選擇連續劃線等；④ 自帶Ⅱ級生物安全柜或高效過濾器，保證生物安全性（表 1）。檢測 2019 新型冠狀病毒感染或疑似感染患者的呼吸道、尿液、糞便標本時，使用自動化前處理系統可以減少人員操作，減少氣溶膠產生，降低生物安全風險，降低操作人員的感染風險，最大限度保護操作人員。
表1
全自動微生物流水線前處理系統的生物安全性
2 微生物培養過程
2.1 傳統培養過程
完成標本接種分離后，需選擇不同營養條件、溫度濕度、氣體環境對病原微生物進行培養。常用培養溫度為 37℃，濕度 95%。培養箱溫濕度適中，利于病原體生長，也利于病毒存活。目前對 2019 新型冠狀病毒理化特性的認識基于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒的研究[1]，嚴重急性呼吸綜合征病毒在 37℃ 下可存活 4 d，在室溫 24℃ 下病毒在尿液中至少存活 10 d，在腹瀉患者的痰液和糞便里可存活 5 d 以上，在血液中可存活約 15 d，在塑料、玻璃、金屬、布料、復印紙等多種物體表面均可存活 2～3 d[8]。新型冠狀病毒肺炎疫情期間，微生物培養過程的生物安全風險性較以往提高，經過 24 h 培養，對病原體進行選擇鑒定時需進行開蓋觀察菌落形態、革蘭染色、分純菌落、細菌生化試驗等操作。培養皿中濕度很高，開蓋時大量氣溶膠溢出，易造成污染。
2.2 全自動微生物流水線的培養過程
流水線前處理系統通過軌道將完成接種的平板傳送到智能培養箱中培養，此過程有效縮短為 6～10 h[9-10]，降低了傳統微生物前處理分離后通過人工傳送至專用培養箱孵育過程中開箱時氣溶膠感染風險。傳送智能培養箱除提供傳統培養箱相同功能外，還具有軌道傳遞、自動拍照和自動卸載等功能（表 2）。智能培養箱的動態數字成像系統可實時監測細菌生長情況，并可根據實驗室需求自定義拍攝時間和間隔。通過專用的培養基數字影像分析工作站即刻觀察菌落情況，避免了人工開蓋觀察的生物安全風險，減少了工作量。微生物自動化流水線的應用促使實驗室生物安全管理及實驗室醫療廢物管理頻率減少 10%～20%[11]。
表2
全自動微生物流水線智能培養箱基本參數
3 微生物鑒定及藥敏分析
3.1 傳統微生物鑒定及藥敏分析
傳統微生物鑒定及藥敏分析過程中手工程序較多，主要包括取純菌落配制菌懸液、菌液轉移、手工藥敏操作及判讀等各環節。其中配置 0.5 麥氏濁度單位菌懸液為開蓋、開管操作，菌液轉移、涂布平板以及藥敏分析往往也為半開放式操作。因病原菌種類不同，0.5 麥氏濁度單位對應細菌數量不同，但通常認為相當于 1.5×108麥氏濁度單位/mL。因此，鑒定及藥敏分析操作中病原體濃度高，產生帶有感染因子氣溶膠的可能性大。鑒定及藥敏分析過程需要規范操作，防止意外事件發生。新型冠狀病毒肺炎疫情暴發后，微生物鑒定及藥敏分析流程的生物安全問題更加值得重視。
3.2 全自動微生物流水線的鑒定及藥敏分析
與全自動微生物流水線相連的自動化鑒定及藥敏分析模塊中的鑒定部分在國外已經上市（圖 1）。該模塊可從智能培養箱調取平板，通過軌道傳送到制備模塊和鑒定及藥敏分析模塊。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜具有快速、靈敏、準確、高通量及易自動化等特點，是微生物快速鑒定技術中里程碑式的變革[12-13]。目前，獨立運行的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜工作站在我國各級醫院已有不少應用。全自動流水線與基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜自動化接口已實現，可進行鑒定及藥敏分析工作，全/半封閉進行病原菌挑取、點靶、菌懸液制備、轉移、條碼識別、鑒定及藥敏結果讀取等，大大降低了操作人員被感染的概率。
圖1
全自動微生物流水線模塊示意圖
本文展示的全自動微生物流水線模塊僅模擬全自動流水線模塊布局，與上市產品略有不同。1：平板自動分選；2：平板條碼標簽；3：接種與劃線模塊；4：高清屏幕工作站；5：智能培養箱；6：平板堆疊模塊；7：質譜靶板制備模塊（未上市）；8：質譜；9：藥敏制備模塊（未上市）；10：自動鑒定藥敏儀（國外上市）；11：軌道系統
4 小結與展望
此次新型冠狀病毒肺炎疫情下，實驗室人員進行臨床標本檢測時應規范防護，防止過度與不足[14]。保障實驗室生物安全是戰勝新型冠狀病毒肺炎疫情的關鍵，需要深入排查風險點，制定針對不同風險級別的安全制度[15]。全自動微生物流水線有效降低了微生物前處理到鑒定及藥敏分析各個環節的生物安全風險，為實驗室生物安全提供了更多保障。需要強調的是，所有感染或疑似感染 2019 新型冠狀病毒的標本在轉運、檢測、處理和銷毀時，均應嚴格按照《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》執行[16]。全自動微生物流水線的應用，帶來了新的生物安全風險管理模式，但流水線并不是完美的方案，在其應用過程中還會出現各種困難和問題，如全自動微生物流水線軌道系統是否可在密閉環境中完成標本傳輸；智能培養箱成像系統在開蓋拍照時局部產生的氣溶膠該如何生物安全保障，可否增加移動式設備（紫外燈、空氣消毒器）進行間斷性消毒；成像系統與培養箱相通，開蓋拍照后產生的氣溶膠是否進入孵箱，是否具備滅活系統進行孵箱環境處理等，都需要不斷思考與總結。臨床微生物實驗室應加強生物安全管理，發揮和完善全自動微生物流水線在面對重大公共衛生突發事件中的生物安全功能。
