引用本文： 李雪, 張長杰. 自分泌運動因子-溶血磷脂酸途徑對大鼠膝骨關節炎關節軟骨內基質金屬蛋白酶 13 的影響. 華西醫學, 2020, 35(5): 550-554. doi: 10.7507/1002-0179.202003505 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性、退行性關節病變，其病因和發病機制尚不完全明確，但炎癥與細胞外基質的破壞密切相關導致軟骨組織鈣化和降解、軟骨下骨重塑和骨血管化增加，伴隨疾病的臨床癥狀包括疼痛、關節腫脹、晨僵和殘疾[1-2]。自分泌運動因子（autotaxin，ATX）又稱胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶 2，是由大腦、肝臟和脂肪組織[3]等各種組織產生的分泌酶，能夠將溶血磷脂酰膽堿轉變為溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）[4]，進而通過至少 6 種 G 蛋白偶聯受體（LPA1-6）來發揮一系列生理及病理功能，如細胞增殖、分化和遷移[5]，但大多數 ATX 報道的成年功能是通過細胞外產生的 LPA 介導[6-7]。以往國內外研究強調，局部 ATX 和 LPA 的產生在刺激慢性炎癥性疾病中的細胞增殖、遷移和炎性細胞因子的產生方面起著關鍵作用，與類風濕關節炎[8]密切相關。ATX 也已被證明主要通過其酶促產物 LPA 參與 OA，對其中涉及的主要細胞類型有影響，特別是軟骨細胞[9]。然而關于 ATX 和 LPA 對 OA 軟骨作用的研究還很少，因此本實驗研究探討了 OA 關節軟骨中 ATX-LPA 軸對基質金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）的調控作用，來探討 ATX-LPA 軸對軟骨的作用機制，以助于為治療 OA 尋找新的藥物治療靶點。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
8 周齡 Sprague-Dawley（SD）大鼠 6 只，雄性，清潔級，體重（240±10）g，由湖南斯萊克景公司提供，實驗動物處置遵循動物倫理學標準，已通過中南大學湘雅二醫院實驗動物倫理委員會審查，批準編號為 No.2020075。
1.2 主要試劑與儀器
ATX 抑制劑 PF-8380（A3720，美國 APExBIO 公司）；LPA 受體拮抗劑 Ki16425（A1987，美國 APExBIO 公司）；兔抗鼠Ⅱ型膠原蛋白（type Ⅱ collagen，ColⅡ）抗體（15943-1-AP，美國 Proteintech Group 公司）；兔抗鼠 MMP-13 抗體（18165-1-AP，美國 Proteintech Group 公司）；兔抗鼠 ATX 抗體（14243-1-AP，美國 Proteintech Group 公司）；兔抗鼠 LPA 抗體（20442-1-AP，美國 Proteintech Group 公司）；辣根過氧化物酶試劑盒（ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術有限公司）；倒置顯微鏡（DSZ2000X，北京中顯恒業儀器儀表有限公司），電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠），旋渦混合器（GL-88B，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），磁力攪拌器（雷磁，上海儀電科學儀器股份有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 原代軟骨細胞分離及培養
取 8 周齡 SD 大鼠 6 只，脫頸處死后用無菌眼科剪將軟骨取出，剪碎成小塊，轉移到含 0.25% 胰蛋白酶的 15 mL 離心管中，并放置于 37℃ 恒溫箱內消化 20 min，再加入 0.02% ColⅡ酶消化液消化 24 h，每 2 小時震蕩 1 次，24 h 后，將消化后的組織液通過 100 μmol/L 的細胞篩網過濾，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗 2 次細胞懸液，再以轉速 1 000 r/min、半徑 13.5 cm 離心 5 min，收集細胞，用 10% 胎牛血清高糖完全培養基重懸沉淀，將細胞接種于培養皿中，于 37℃、5% 二氧化碳培養箱培養，3 d 后，首次換液，以后每 2 天換液 1 次。
1.3.2 軟骨細胞的鑒定
取 3 代以內的原代軟骨細胞進行爬片，用 PBS 清洗 2～3 次后，用 4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 沖洗后加入 0.3% 曲拉通，37℃ 通透 30 min，PBS 沖洗后加入 3% 過氧化氫，室溫 10 min 以滅活內源性酶，PBS 沖洗后加入一抗（兔抗鼠 ColⅡ抗體），4℃ 孵育過夜，PBS 沖洗后滴加辣根過氧化物酶標記二抗，37℃ 孵育 30 min，PBS 沖洗后滴加顯色劑二氨基聯苯胺，室溫孵育 1～5 min，顯微鏡下觀察染色深淺，染好后立即用蒸餾水洗滌，終止染色反應；將切片放入蘇木素染色液復染 5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS 返藍，分別放置于 70% 乙醇中浸泡 5 min，85% 乙醇中浸泡 5 min，95% 乙醇中浸泡 5 min，無水乙醇中浸泡 5 min，取出切片后置于二甲苯 10 min×2 次，晾干后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。陽性染色為細胞質 ColⅡ染色呈黃色或棕黃色（深的可至褐色），細胞核染色呈藍色，證明成功獲取膝軟骨細胞。
1.3.3 OA 模型建立及實驗分組
取 3 代以內的原代軟骨細胞，予以白細胞介素-1β 10 ng/mL 處理 24 h 建立 OA 模型。造模成功后隨機分成 6 組，即空白對照組、模型組、1 μmol/L PF-8380 組、10 μmol/L PF-8380 組、1 μmol/L Ki16425 組和 10 μmol/L Ki16425 組，每組 3 個樣本。
1.3.4 免疫細胞化學染色觀察 ColⅡ的表達
按照上述軟骨細胞鑒定的方法對空白對照組和模型組中軟骨細胞的 ColⅡ進行免疫細胞化學染色，染色完成后顯微鏡下觀察并拍照。采用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件進行分析，并測定 ColⅡ平均吸光度值（average absorbance，AA）。
1.3.5 蛋白質印跡分析檢測軟骨 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白的表達
將適量軟骨細胞洗滌 1 次，加入細胞裂解液裂解，離心收獲上清液。測定上清液蛋白濃度，并定量。配置分離膠及濃縮膠，上樣，進行凝膠電泳，轉聚偏二氟乙烯膜，4℃ 下 5% 脫脂牛奶封閉過夜，分別加入各蛋白一抗（兔抗鼠 MMP-13、ATX 及 LPA 多克隆抗體）室溫孵育 90 min，二抗室溫孵育 90 min，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌 3 次，10 min/次，加入曝光液后，在凝膠成像系統中報告，并用 Quantity One 專業灰度分析軟件分析電泳條帶灰度值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 26.0 軟件對空白對照組和模型組中 ColⅡ免疫細胞化學染色的 AA 值進行分析，以鑒定 OA 模型。數據用均數±標準差表示，組間方差不齊，采用 t’ 檢驗，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 OA 模型驗證
空白對照組和模型組中 ColⅡ免疫細胞化學染色的 AA 值（n=3，
±s）分別為 0.110 0±0.009 0、0.003 9±0.000 8，與空白對照組相比，模型組軟骨細胞中 ColⅡ的 AA 值明顯降低，組間差異有統計學意義（t’=20.495，P<0.05），說明成功建立 OA 模型。見圖 1。
圖1
OA 模型驗證結果（免疫細胞化學染色 ×400）
a. 空白對照組軟骨細胞；b. 模型組即 OA 軟骨細胞
2.2 各組軟骨細胞中 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白的表達
通過 Quantity One 專業灰度分析軟件可以發現，模型組、1 μmol/L PF-8380 組、10 μmol/L PF-8380 組和 1 μmol/L Ki16425 組軟骨細胞中的 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白表達明顯高于空白對照組，而 10 μmol/L Ki16425 組中的 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白表達與空白組無明顯差異；模型組、10 μmol/L PF-8380 組和 1 μmol/L PF-8380 組中的 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白表達依次降低；模型組、1 μmol/L Ki16425 組和 10 μmol/L Ki16425 組中的 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白表達依次降低，說明抑制 ATX-LPA 途徑可能在不同程度上抑制 OA 關節軟骨內 MMP-13 水平的上調。見圖 2 及表 1、2。
表1
圖 2a 條帶灰度值
圖2
蛋白質印跡法檢測 ATX、LPA、MMP-13 在軟骨細胞表達
a. 空白對照組、模型組、1 μmol/L PF-8380 組、10 μmol/L PF-8380 組的蛋白印跡條帶；b. 空白對照組、模型組、1 μmol/L Ki16425 組、10 μmol/L Ki16425 組的蛋白印跡條帶
表2
圖 2b 條帶灰度值
3 討論
OA 是世界上最常見的關節炎形式，其特征為軟骨破壞、軟骨下骨硬化、滑膜增生、骨贅生成、細胞外基質降解、血管增生、關節間隙變窄。與 OA 相關的風險因素包括性別、年齡、肥胖、營養不良、肌肉無力[10]、先前的關節損傷、遺傳易感性以及機械因素。其發病率和致殘率較高，以中老年人為主，該疾患病程較長且不能徹底根治，最終導致關節疼痛加劇甚至關節功能喪失。目前 OA 的一線藥理學治療方案側重于減輕炎癥和相關疼痛。非甾體類抗炎藥和選擇性環氧化酶-2 抑制劑是治療 OA 疼痛的最常用處方藥物，但不幸的是，這些藥物也經常伴隨著胃腸道、腎臟和心血管副作用，因而限制了它們的使用[11]。因此，未來的研究迫切需要尋找新的藥物治療靶點和更優的治療方案。
ATX-LPA 軸已被證明在許多病理生理過程中發揮重要作用，其與慢性炎癥高度相關[12]，且在各種炎癥條件下是上調的[13]。有報道稱，血漿和滑膜液中的 ATX 水平與膝關節 OA 的嚴重程度有關[14]，從 OA 患者中分離出的滑膜成纖維細胞（synovial fibroblasts，SF）表達出大量的 ATX mRNA，而這種 ATX 表達的增加可能導致 LPA 的產生增加[15]，但不一定轉化為 LPA 受體表達的增加[16]。此外，在人的 OA SF 中已經觀察到 LPA1-3 的表達[17]，表明 ATX 和 LPA 信號在 OA 發病機制中具有潛在的作用。最近的研究表明，在動物關節炎模型中，間充質細胞中 ATX 的條件遺傳消融可減輕關節炎的發展[15]。McDougall 等[18]首次報告，關節內 LPA 的產生與 OA 患者的疾病嚴重程度有關，用 LPA 受體拮抗劑或 ATX 抑制劑治療 OA 關節可能是一種值得選擇的方法。α-溴代膦酸酯對 ATX 和 LPA 受體的藥理學阻斷作用減弱了膠原誘導的關節炎小鼠模型中的疾病癥狀[19]；有證據表明，通過抑制炎癥細胞遷移、輔助性 T 細胞 17 分化和破骨細胞生成，使用 LPA1 受體拮抗劑 LA-01 的治療可能改善了小鼠膠原性關節炎的嚴重程度，而缺乏 LPA1 受體的關節炎小鼠則不容易存在關節疾病[20]，這些數據提示 ATX-LPA 軸可能是關節炎疾病發病機制的主要參與者。然而，它們在 OA 中的作用尚未確定及未完全闡明[18]。關于滑膜和循環中濃度與局部組織中炎性生物標志物的更多研究可以提供 ATX 和 LPA 在 OA 中致病作用的有用信息。體外研究可提供對 ATX 和 LPA 信號及其生物學作用更進一步的洞察[21]。總而言之，阻斷 ATX-LPA 途徑可能產生某些治療益處，例如減少成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖、炎癥因子的產生以及滑膜增生[22]，這可能是逆轉 OA 畸形和殘疾的關鍵因素。
目前研究認為基質金屬蛋白酶是一大類鋅離子和鈣離子依賴性蛋白水解酶，可以降解任何細胞外基質成分，具有廣泛的底物特異性，其主要底物包括蛋白多糖、玻連蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和膠原蛋白。其中，MMP-13 屬于膠原酶的一種，能特異性降解關節軟骨基質中含量最多的 ColⅡ，是參與關節軟骨基質降解的關鍵酶，是參與 OA 發生發展的關鍵酶。本研究結果顯示，ATX、LPA 及 MMP-13 在 OA 軟骨細胞中表達明顯增加，加入 PF-8380 或 Ki16425 干預后均表達減少。對于 ATX 抑制劑 PF-8380，隨著濃度的升高，其對 ATX、LPA 及 MMP-13 產生的抑制作用減弱；對于 LPA 受體拮抗劑 Ki16425，隨著濃度的升高，其對 ATX、LPA 及 MMP-13 產生的抑制作用增強，甚至和正常軟骨細胞中的表達水平無明顯差異，說明抑制 ATX-LPA 途徑在一定程度上能減少 MMP-13 的生成。然而，不同濃度干預的抑制作用尚不完全清楚，這可能和干預時間與干預途徑存在一定關系，有待于進一步深入研究。
綜上所述，隨著 OA 的發生發展，MMP-13 的表達及 ColⅡ破壞增加，不同濃度的 ATX 抑制劑及 LPA 受體拮抗劑通過抑制 ATX-LPA 途徑可不同程度減少 MMP-13 的表達以降低軟骨炎癥反應。因此，抑制 ATX-LPA 途徑可能在不同程度上抑制 OA 關節軟骨內 MMP-13 水平的上調而減輕軟骨損傷。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性、退行性關節病變，其病因和發病機制尚不完全明確，但炎癥與細胞外基質的破壞密切相關導致軟骨組織鈣化和降解、軟骨下骨重塑和骨血管化增加，伴隨疾病的臨床癥狀包括疼痛、關節腫脹、晨僵和殘疾[1-2]。自分泌運動因子（autotaxin，ATX）又稱胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶 2，是由大腦、肝臟和脂肪組織[3]等各種組織產生的分泌酶，能夠將溶血磷脂酰膽堿轉變為溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）[4]，進而通過至少 6 種 G 蛋白偶聯受體（LPA1-6）來發揮一系列生理及病理功能，如細胞增殖、分化和遷移[5]，但大多數 ATX 報道的成年功能是通過細胞外產生的 LPA 介導[6-7]。以往國內外研究強調，局部 ATX 和 LPA 的產生在刺激慢性炎癥性疾病中的細胞增殖、遷移和炎性細胞因子的產生方面起著關鍵作用，與類風濕關節炎[8]密切相關。ATX 也已被證明主要通過其酶促產物 LPA 參與 OA，對其中涉及的主要細胞類型有影響，特別是軟骨細胞[9]。然而關于 ATX 和 LPA 對 OA 軟骨作用的研究還很少，因此本實驗研究探討了 OA 關節軟骨中 ATX-LPA 軸對基質金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）的調控作用，來探討 ATX-LPA 軸對軟骨的作用機制，以助于為治療 OA 尋找新的藥物治療靶點。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
8 周齡 Sprague-Dawley（SD）大鼠 6 只，雄性，清潔級，體重（240±10）g，由湖南斯萊克景公司提供，實驗動物處置遵循動物倫理學標準，已通過中南大學湘雅二醫院實驗動物倫理委員會審查，批準編號為 No.2020075。
1.2 主要試劑與儀器
ATX 抑制劑 PF-8380（A3720，美國 APExBIO 公司）；LPA 受體拮抗劑 Ki16425（A1987，美國 APExBIO 公司）；兔抗鼠Ⅱ型膠原蛋白（type Ⅱ collagen，ColⅡ）抗體（15943-1-AP，美國 Proteintech Group 公司）；兔抗鼠 MMP-13 抗體（18165-1-AP，美國 Proteintech Group 公司）；兔抗鼠 ATX 抗體（14243-1-AP，美國 Proteintech Group 公司）；兔抗鼠 LPA 抗體（20442-1-AP，美國 Proteintech Group 公司）；辣根過氧化物酶試劑盒（ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術有限公司）；倒置顯微鏡（DSZ2000X，北京中顯恒業儀器儀表有限公司），電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠），旋渦混合器（GL-88B，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），磁力攪拌器（雷磁，上海儀電科學儀器股份有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 原代軟骨細胞分離及培養
取 8 周齡 SD 大鼠 6 只，脫頸處死后用無菌眼科剪將軟骨取出，剪碎成小塊，轉移到含 0.25% 胰蛋白酶的 15 mL 離心管中，并放置于 37℃ 恒溫箱內消化 20 min，再加入 0.02% ColⅡ酶消化液消化 24 h，每 2 小時震蕩 1 次，24 h 后，將消化后的組織液通過 100 μmol/L 的細胞篩網過濾，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗 2 次細胞懸液，再以轉速 1 000 r/min、半徑 13.5 cm 離心 5 min，收集細胞，用 10% 胎牛血清高糖完全培養基重懸沉淀，將細胞接種于培養皿中，于 37℃、5% 二氧化碳培養箱培養，3 d 后，首次換液，以后每 2 天換液 1 次。
1.3.2 軟骨細胞的鑒定
取 3 代以內的原代軟骨細胞進行爬片，用 PBS 清洗 2～3 次后，用 4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 沖洗后加入 0.3% 曲拉通，37℃ 通透 30 min，PBS 沖洗后加入 3% 過氧化氫，室溫 10 min 以滅活內源性酶，PBS 沖洗后加入一抗（兔抗鼠 ColⅡ抗體），4℃ 孵育過夜，PBS 沖洗后滴加辣根過氧化物酶標記二抗，37℃ 孵育 30 min，PBS 沖洗后滴加顯色劑二氨基聯苯胺，室溫孵育 1～5 min，顯微鏡下觀察染色深淺，染好后立即用蒸餾水洗滌，終止染色反應；將切片放入蘇木素染色液復染 5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS 返藍，分別放置于 70% 乙醇中浸泡 5 min，85% 乙醇中浸泡 5 min，95% 乙醇中浸泡 5 min，無水乙醇中浸泡 5 min，取出切片后置于二甲苯 10 min×2 次，晾干后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。陽性染色為細胞質 ColⅡ染色呈黃色或棕黃色（深的可至褐色），細胞核染色呈藍色，證明成功獲取膝軟骨細胞。
1.3.3 OA 模型建立及實驗分組
取 3 代以內的原代軟骨細胞，予以白細胞介素-1β 10 ng/mL 處理 24 h 建立 OA 模型。造模成功后隨機分成 6 組，即空白對照組、模型組、1 μmol/L PF-8380 組、10 μmol/L PF-8380 組、1 μmol/L Ki16425 組和 10 μmol/L Ki16425 組，每組 3 個樣本。
1.3.4 免疫細胞化學染色觀察 ColⅡ的表達
按照上述軟骨細胞鑒定的方法對空白對照組和模型組中軟骨細胞的 ColⅡ進行免疫細胞化學染色，染色完成后顯微鏡下觀察并拍照。采用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件進行分析，并測定 ColⅡ平均吸光度值（average absorbance，AA）。
1.3.5 蛋白質印跡分析檢測軟骨 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白的表達
將適量軟骨細胞洗滌 1 次，加入細胞裂解液裂解，離心收獲上清液。測定上清液蛋白濃度，并定量。配置分離膠及濃縮膠，上樣，進行凝膠電泳，轉聚偏二氟乙烯膜，4℃ 下 5% 脫脂牛奶封閉過夜，分別加入各蛋白一抗（兔抗鼠 MMP-13、ATX 及 LPA 多克隆抗體）室溫孵育 90 min，二抗室溫孵育 90 min，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌 3 次，10 min/次，加入曝光液后，在凝膠成像系統中報告，并用 Quantity One 專業灰度分析軟件分析電泳條帶灰度值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 26.0 軟件對空白對照組和模型組中 ColⅡ免疫細胞化學染色的 AA 值進行分析，以鑒定 OA 模型。數據用均數±標準差表示，組間方差不齊，采用 t’ 檢驗，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 OA 模型驗證
空白對照組和模型組中 ColⅡ免疫細胞化學染色的 AA 值（n=3，±s）分別為 0.110 0±0.009 0、0.003 9±0.000 8，與空白對照組相比，模型組軟骨細胞中 ColⅡ的 AA 值明顯降低，組間差異有統計學意義（t’=20.495，P<0.05），說明成功建立 OA 模型。見圖 1。
圖1
OA 模型驗證結果（免疫細胞化學染色 ×400）
a. 空白對照組軟骨細胞；b. 模型組即 OA 軟骨細胞
2.2 各組軟骨細胞中 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白的表達
通過 Quantity One 專業灰度分析軟件可以發現，模型組、1 μmol/L PF-8380 組、10 μmol/L PF-8380 組和 1 μmol/L Ki16425 組軟骨細胞中的 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白表達明顯高于空白對照組，而 10 μmol/L Ki16425 組中的 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白表達與空白組無明顯差異；模型組、10 μmol/L PF-8380 組和 1 μmol/L PF-8380 組中的 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白表達依次降低；模型組、1 μmol/L Ki16425 組和 10 μmol/L Ki16425 組中的 ATX、LPA 及 MMP-13 蛋白表達依次降低，說明抑制 ATX-LPA 途徑可能在不同程度上抑制 OA 關節軟骨內 MMP-13 水平的上調。見圖 2 及表 1、2。
表1
圖 2a 條帶灰度值
圖2
蛋白質印跡法檢測 ATX、LPA、MMP-13 在軟骨細胞表達
a. 空白對照組、模型組、1 μmol/L PF-8380 組、10 μmol/L PF-8380 組的蛋白印跡條帶；b. 空白對照組、模型組、1 μmol/L Ki16425 組、10 μmol/L Ki16425 組的蛋白印跡條帶
表2
圖 2b 條帶灰度值
3 討論
OA 是世界上最常見的關節炎形式，其特征為軟骨破壞、軟骨下骨硬化、滑膜增生、骨贅生成、細胞外基質降解、血管增生、關節間隙變窄。與 OA 相關的風險因素包括性別、年齡、肥胖、營養不良、肌肉無力[10]、先前的關節損傷、遺傳易感性以及機械因素。其發病率和致殘率較高，以中老年人為主，該疾患病程較長且不能徹底根治，最終導致關節疼痛加劇甚至關節功能喪失。目前 OA 的一線藥理學治療方案側重于減輕炎癥和相關疼痛。非甾體類抗炎藥和選擇性環氧化酶-2 抑制劑是治療 OA 疼痛的最常用處方藥物，但不幸的是，這些藥物也經常伴隨著胃腸道、腎臟和心血管副作用，因而限制了它們的使用[11]。因此，未來的研究迫切需要尋找新的藥物治療靶點和更優的治療方案。
ATX-LPA 軸已被證明在許多病理生理過程中發揮重要作用，其與慢性炎癥高度相關[12]，且在各種炎癥條件下是上調的[13]。有報道稱，血漿和滑膜液中的 ATX 水平與膝關節 OA 的嚴重程度有關[14]，從 OA 患者中分離出的滑膜成纖維細胞（synovial fibroblasts，SF）表達出大量的 ATX mRNA，而這種 ATX 表達的增加可能導致 LPA 的產生增加[15]，但不一定轉化為 LPA 受體表達的增加[16]。此外，在人的 OA SF 中已經觀察到 LPA1-3 的表達[17]，表明 ATX 和 LPA 信號在 OA 發病機制中具有潛在的作用。最近的研究表明，在動物關節炎模型中，間充質細胞中 ATX 的條件遺傳消融可減輕關節炎的發展[15]。McDougall 等[18]首次報告，關節內 LPA 的產生與 OA 患者的疾病嚴重程度有關，用 LPA 受體拮抗劑或 ATX 抑制劑治療 OA 關節可能是一種值得選擇的方法。α-溴代膦酸酯對 ATX 和 LPA 受體的藥理學阻斷作用減弱了膠原誘導的關節炎小鼠模型中的疾病癥狀[19]；有證據表明，通過抑制炎癥細胞遷移、輔助性 T 細胞 17 分化和破骨細胞生成，使用 LPA1 受體拮抗劑 LA-01 的治療可能改善了小鼠膠原性關節炎的嚴重程度，而缺乏 LPA1 受體的關節炎小鼠則不容易存在關節疾病[20]，這些數據提示 ATX-LPA 軸可能是關節炎疾病發病機制的主要參與者。然而，它們在 OA 中的作用尚未確定及未完全闡明[18]。關于滑膜和循環中濃度與局部組織中炎性生物標志物的更多研究可以提供 ATX 和 LPA 在 OA 中致病作用的有用信息。體外研究可提供對 ATX 和 LPA 信號及其生物學作用更進一步的洞察[21]。總而言之，阻斷 ATX-LPA 途徑可能產生某些治療益處，例如減少成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖、炎癥因子的產生以及滑膜增生[22]，這可能是逆轉 OA 畸形和殘疾的關鍵因素。
目前研究認為基質金屬蛋白酶是一大類鋅離子和鈣離子依賴性蛋白水解酶，可以降解任何細胞外基質成分，具有廣泛的底物特異性，其主要底物包括蛋白多糖、玻連蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和膠原蛋白。其中，MMP-13 屬于膠原酶的一種，能特異性降解關節軟骨基質中含量最多的 ColⅡ，是參與關節軟骨基質降解的關鍵酶，是參與 OA 發生發展的關鍵酶。本研究結果顯示，ATX、LPA 及 MMP-13 在 OA 軟骨細胞中表達明顯增加，加入 PF-8380 或 Ki16425 干預后均表達減少。對于 ATX 抑制劑 PF-8380，隨著濃度的升高，其對 ATX、LPA 及 MMP-13 產生的抑制作用減弱；對于 LPA 受體拮抗劑 Ki16425，隨著濃度的升高，其對 ATX、LPA 及 MMP-13 產生的抑制作用增強，甚至和正常軟骨細胞中的表達水平無明顯差異，說明抑制 ATX-LPA 途徑在一定程度上能減少 MMP-13 的生成。然而，不同濃度干預的抑制作用尚不完全清楚，這可能和干預時間與干預途徑存在一定關系，有待于進一步深入研究。
綜上所述，隨著 OA 的發生發展，MMP-13 的表達及 ColⅡ破壞增加，不同濃度的 ATX 抑制劑及 LPA 受體拮抗劑通過抑制 ATX-LPA 途徑可不同程度減少 MMP-13 的表達以降低軟骨炎癥反應。因此，抑制 ATX-LPA 途徑可能在不同程度上抑制 OA 關節軟骨內 MMP-13 水平的上調而減輕軟骨損傷。
