杜興型肌營養不良癥是一種由抗肌萎縮蛋白基因突變引起的 X 連鎖遺傳的進行性變性肌肉疾病，是最常見的進行性肌營養不良癥之一。該文就杜興型肌營養不良癥基因診斷的方法選擇、實驗動物模型的選擇、針對原發病因的治療（包括基因替代療法、外顯子跳躍療法、基因組編輯、終止密碼子通讀治療、干細胞療法）、針對繼發病理反應的治療以及評估疾病進展的方法等進行綜述，旨在豐富臨床醫師對該疾病的認知，為杜興型肌營養不良癥相關臨床診療工作提供參考和幫助。
引用本文： 劉兆飛, 肖興軍. 杜興型肌營養不良癥的研究進展. 華西醫學, 2020, 35(7): 873-877. doi: 10.7507/1002-0179.202002427 復制
杜興型肌營養不良癥（Duchenne muscular dystrophy， DMD）是 X 染色體隱性遺傳的致死性神經肌肉疾病。該病是由抗肌萎縮蛋白基因突變導致抗肌萎縮蛋白的缺乏或功能不足，后者是一種細胞骨架蛋白，起到將肌動蛋白固定到肌膜內表面的機械連接作用，從而保證細胞收縮時的整體性[1]。DMD 患者表現為進行性的肌肉損傷和功能退化，從而導致肌肉無力、運動遲緩、步態不穩、呼吸困難和心肌病，最終由于心臟和呼吸功能受損去世。DMD 是最常見的進行性肌營養不良，作為一種遺傳性疾病，科研人員一直在尋找更為可靠的診斷方法和更為有效的治療手段。抗肌萎縮蛋白基因的發現，為該疾病的基因診斷和治療提供了方向。盡管現在對于 DMD 患者來說沒有完全治愈的手段，但包括基因療法在內的新興療法在治療 DMD 方面存在前景，這些治療方法包括基因替代療法、外顯子跳躍、基因組編輯、終止密碼子通讀、干細胞療法等。本文擬通過對 DMD 的基因診斷方法、治療進展以及評估預后的方法等進行綜述，旨在豐富臨床醫師對該疾病的認知，為 DMD 相關臨床診療工作提供參考和幫助。
1 基因診斷
由于大約 70% 的 DMD 患者的抗肌萎縮蛋白基因具有單外顯子或者多外顯子的缺失或者重復[2]，因此關于抗肌萎縮蛋白基因有無缺失或重復的檢測通常是第一個驗證性檢測。檢測最好通過多重連接探針擴增技術進行，因為多重聚合酶鏈反應只能識別缺失突變[3]。通過以上測試可以識別缺失突變或者重復突變的邊界，從而判別閱讀框是否被破壞。如果檢測結果呈陰性，則應該進行基因測序以篩查有無其他可能導致 DMD 的基因突變類型，如點突變（無義或者錯義）、小缺失突變以及小量重復或者插入突變[4]。最后，如果基因測定仍然不能驗證 DMD 的臨床診斷，則應該進行組織冰凍切片的免疫組織化學檢測或者肌肉蛋白提取物的蛋白質印記分析來檢測肌肉活檢樣品中有無抗肌萎縮蛋白。
2 動物模型
迄今為止，在眾多的 DMD 動物模型中，研究者更傾向于小鼠和犬的模型來闡明 DMD 的致病機制和研發新的治療方法。DMD 小鼠的壽命比野生型小鼠縮短了 25%，而 DMD 患者的壽命比正常人縮短了 75%，并且 DMD 小鼠的疾病進展也相對溫和，無法模擬人類的疾病進程[5]。與 DMD 小鼠不同，DMD 犬在臨床表現上與 DMD 患者相似，表現出肢體肌肉萎縮、纖維化、關節攣縮和唾液分泌過多。DMD 犬肢體無力和心臟功能受損的發病年齡以及預期壽命都與人類 DMD 患者相當[6]。這些臨床相似特點使得 DMD 犬模型可以作為臨床前基因療法研究的理想模型。
3 原發病因治療
由于 DMD 是由缺乏功能性抗肌萎縮蛋白引起的，恢復抗肌萎縮蛋白的功能或表達是一種治療方法，也是從根本上解決了 DMD 的病因。抗肌萎縮蛋白靶向的基因療法可以設計為作用于 DNA、mRNA 水平。針對 DMD 基因突變，治療方法有基因替代療法、外顯子跳躍、基因組編輯、終止密碼子通讀等，恢復抗肌萎縮蛋白正常水平和功能的方法有干細胞療法。
3.1 基因替代療法
基因替代療法選擇的病毒載體是腺相關病毒，因為其大多數血清型具有肌細胞嗜性，可以高效地感染骨骼肌[7]。盡管腺相關病毒非常小，轉載容量（大約 4.5 kb）相對于 DMD 基因（2.2 Mb）以及全長的抗肌萎縮蛋白 mRNA（14 kb）相對有限，但是有趣的是，由于抗肌萎縮蛋白蛋白域的模塊結構，抗肌萎縮蛋白的內部截短形式可以保留部分功能[7]。在輕度和無癥狀的貝克肌營養不良患者的肌肉組織中已經發現了剪接的抗肌萎縮蛋白產物[7]。微小抗肌萎縮蛋白是抗肌萎縮蛋白的截短形式，包含有 1 001 個氨基酸，缺乏桿狀結構域的冗雜區域，并且包含蛋白質的最小功能區域。因此可以通過腺相關病毒載體運送微小抗肌萎縮蛋白的方式來進行治療。
但是該方法仍然面臨諸多挑戰：① 對于人體內這些微小抗肌萎縮蛋白會起到多大的作用仍不完全清楚，因為所用的微小抗肌萎縮蛋白比貝克肌營養不良患者中最小的自然微小抗肌萎縮蛋白還要小 40%；② 轉基因表達的存在時間是有限的；③ 先前已經存在腺相關病毒抗體的 DMD 患者目前被嚴禁接受腺相關病毒基因療法，這部分患者約占所有 DMD 患者總數的 50%[8]；④ 用于治療 DMD 所需的病毒載體的規模生產非常昂貴且費時。
3.2 外顯子跳躍
外顯子跳躍使用的是修飾后的小 DNA 或者 RNA 片段，該片段稱為反義寡核苷酸序列，它們與 mRNA 抗肌萎縮蛋白轉錄前過程中的目標外顯子的特定序列進行結合，這種結合可以導致目標外顯子的跳躍，從而恢復閱讀框并且產生部分功能性抗肌萎縮蛋白[9]。該方法是基于以下事實：如果可以通過細胞的 RNA 剪接機制隱藏外顯子，就可以糾正閱讀框，大多數 DMD 患者理論上可以產生類似貝克肌營養不良樣的抗肌萎縮蛋白。大多數 DMD 患者有一個或者多個外顯子缺失，這些缺失通常集中在外顯子 45～55[10]。外顯子 51 跳躍適用于 13%～14% 的 DMD 患者[11]。目前已經開發了 2 種導致外顯子 51 跳躍的不同反義寡核苷酸藥物：eteplirsen 和 drisapersen[12]。Charleston 等[13]的研究表明，相較于未接受藥物治療的對照組患者，使用 eteplirsen 治療的患者抗肌萎縮蛋白含量增加（P=0.007），抗肌萎縮蛋白陽性纖維百分比也增加（P<0.001），抗肌萎縮蛋白的免疫熒光強度是前者的 2.4 倍，且多種檢測手段證明了 eteplirsen 可以促進外顯子跳躍和誘導新的抗肌萎縮蛋白表達。一項隨機安慰劑對照Ⅲ期臨床試驗結果表明，在評價藥物效果的主要指標 6 分鐘步行試驗上，drisapersen 藥物治療組與對照組無明顯差別（P=0.415）[14]。但外顯子跳躍療法的缺點是：由于反義寡核苷酸、DNA 轉錄本和抗肌萎縮蛋白的更新，必須重復進行反義寡核苷酸處理。
3.3 基因組編輯
規律成簇的間隔短回文重復-規律成簇的間隔短回文重復相關蛋白 9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，CRISPR-Cas9）編輯技術可用于在基因組中的特定位置誘導雙鏈 DNA 斷裂從而使同源重組或非同源末端連接[15]。同源修復只能在分裂細胞中發生，不適用于有絲分裂后的骨骼肌細胞和心肌細胞，但非同源末端連接修復可以通過刪除其他外顯子的方式來修復 DMD 的閱讀框。基因組編輯已成功用于恢復 DMD 患者來源的成肌細胞、人類誘導性多能干細胞來源的肌肉細胞和 DMD 小鼠模型中的類似貝克肌營養不良樣抗肌萎縮蛋白的表達[16-20]。在 DMD 小鼠模型中，基因組編輯可以改善骨骼肌和心肌的功能[16, 21]。基因組編輯需要構建 2 個腺病毒相關載體，一個用于傳遞 Cas9，另一個用于向體內骨骼肌和心肌傳遞引導 CRISPR RNA。基因組編輯僅發生在同時吸收了這 2 種成分的細胞中。為了盡量減少通過使用 2 個腺病毒相關載體來進行基因組編輯的副作用，已研究出通過單個較大腺病毒載體同時遞送指導 RNA 和 Cas9 來進行基因組編輯[22]。
基因組編輯的優點包括：① 因為基因組編輯發生在 DNA 水平，隨后從編輯后的基因組產生的轉錄 RNA 都將符合閱讀框，因此無需進行重復的基因組編輯，通過消除造成該疾病的基因突變，理論上具有一次治療后可以永久阻止疾病進一步進展的潛力；② 可以產生正常或者接近正常形式的抗肌萎縮蛋白，具體取決于要糾正的突變類型；③ 由于基因編輯后抗肌萎縮蛋白的表達來自于內源性抗肌萎縮蛋白基因，后者在天然的基因組位置包含正常的順式調控元件，時間空間表達和表達的水平都是正常的，而通過微小抗肌萎縮蛋白基因替代療法，基因的表達取決于腺相關病毒載體的順式調控序列。然而，與基因替代療法一樣，基因組編輯仍不能完全防止與 DMD 相關的肌肉損傷，腺相關病毒無法感染衛星細胞（即肌肉干細胞）[23]，因此修復后的肌肉仍然攜帶原始的 DMD 突變，隨著時間的推移，仍有可能出現部分功能性抗肌萎縮蛋白水平降低[21]。此外，脫靶效應的存在也為基因組編療法提出了挑戰，尚需要進一步了解基因組編輯的脫靶效應的機制和頻率來闡明相關的安全性問題。
3.4 終止密碼子通讀
在約 13% 的 DMD 患者中，DMD 是由于點突變（編碼氨基酸的密碼子突變后變為終止密碼子）造成的[24]，在這種情況下，閱讀框不會被無意義的突變破壞，但是，過早停止翻譯仍然會產生非功能性抗肌萎縮蛋白。終止密碼子通讀可以避免截短的非功能性抗肌萎縮蛋白的產生。研究發現，在由無義突變引起的各種疾病的細胞和動物模型中，ataluren 可以通過終止密碼子通讀來恢復受影響蛋白質的產生[25]。在 DMD 小鼠模型中，ataluren 治療可改善功能[26]。但是一項多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的Ⅲ期臨床試驗結果表明，無論受試者基線時 6 分鐘步行試驗結果為多少，ataluren 組和安慰劑組的 6 分鐘步行試驗結果變化差異均無統計學意義[27]。Ataluren 的主要缺點是僅適用于無義突變的個體（約 13% 的 DMD 患者[24]），且價格昂貴。
3.5 干細胞療法
該方法的基本原理是從未受影響的供體中分離出來的肌肉干細胞可以在體外擴增，然后移植到 DMD 患者中，移植的細胞可以遞送一個完整的 DMD 基因副本，但因為肌肉干細胞在高度豐富的肌肉組織的培養條件下增殖能力有限，該方法的有效性受到限制，并且移植的干細胞通過靜脈方式傳遞不會被骨骼肌吸收[28]。人類誘導性多能干細胞的可用性和基因組編輯使研究人員能夠糾正患者來源的誘導性多能干細胞中的 DMD 突變[29]，其未來目標是將誘導性多能干細胞分化為可以移植到患者體內的肌肉前體細胞。然而，由于干細胞向骨骼肌的遞送效率低下，這種方法還面臨著 Cas9 脫靶作用以及在治療患者中形成腫瘤或畸胎瘤的潛在風險的額外挑戰[30]。干細胞療法的另一個挑戰是與 DMD 相關的肌肉病理。由于慢性炎癥和纖維化，營養不良性肌肉的再生受到損害。理論上分析，確實到達肌肉組織的移植干細胞最可能的結局是分化為纖維組織或脂肪細胞，但尚不知道需要多少移植的干細胞來克服來自局部免疫細胞和纖維化組織的負分化信號，并使它們促進肌肉再生，而不是形成纖維化和脂肪組織。有趣的是，抗肌萎縮蛋白的部分功能可以由另一種細胞蛋白抗肌萎縮蛋白相關蛋白實現。Kennedy 等[31]的研究表明微小抗肌萎縮蛋白相關蛋白可以改善 DMD 小鼠模型嚴重減退的心臟和骨骼肌功能。由于抗肌萎縮蛋白相關蛋白對于 DMD 患者來說不是外來蛋白（因此可以降低免疫應答的風險），并且可以在功能上替代抗肌萎縮蛋白，從而為治療 DMD 提供了新的思路。此外，人類誘導性多能干細胞具有卓越的肌肉再生能力，若結合基因編輯技術，其衍生的肌源性祖細胞具有治療 DMD 的潛力。
4 針對繼發病理反應的治療
抗肌萎縮蛋白的喪失會誘發多種病理反應，包括炎癥反應、鈣穩態失調、功能性局部缺血以及肌肉再生受損[32]。針對繼發病理反應的相關治療通常只涉及其中一種或者少數幾種途徑，雖然單獨應用不可能停止或者逆轉病理過程，但是可以緩解病情進展。皮質類固醇抗炎是 DMD 的標準治療，雖然可以延緩 DMD 的進展，但長期使用會引起體重增加、胰島素抵抗、骨質疏松等不良反應[33]。推測這些不良反應是由反式激活引起的[34]。生長激素可以降低皮質醇激素治療的 DMD 小鼠模型中的炎癥反應、增強骨韌性[35]。此外，有研究發現在 DMD 小鼠中 vamorolone 保留了糖皮質激素受體結合的作用但沒有反式激活作用[36]。且納入 90 名健康志愿者的Ⅰ期試驗已經證實了 vamorolone 的安全性[37]。還有臨床試驗證明 vamorolone 以 2.0 或 6.0 mg/（kg·d）的劑量可以改善 DMD 患者的肌肉功能[38]。
5 治療效果評價
目前 DMD 的治療評價多是基于功能評估，如 6 分鐘步行試驗等。由于個體間的差異性和相對復雜的結局指標，臨床試驗的結果評定也因此受到影響。研究發現蘋果酸脫氫酶 2 的血清水平可以作為 DMD 的預后生物標志物，因為其與疾病分期和對皮質類固醇激素的治療反應以及輪椅依賴和肺功能變化有關[39]。此外，非侵入性技術，例如針對肌肉的定量測量，包括 MRI、光譜學檢查、電阻抗肌電圖檢查和超聲檢查等，可以敏感地識別患病的肌肉、疾病的進展以及對治療的反應，具有在臨床癥狀發作之前識別疾病病理的潛力[40-43]。
6 總結
關于 DMD 的研究和治療正在如火如荼地進行。恢復抗肌萎縮蛋白已經成為治療 DMD 的重要療法。反義寡核苷酸介導的外顯子跳躍仍然是一個重要的治療方法，基于此療法的新的藥物正在研發中。最近進入臨床試驗的治療方法是基因替代療法。盡管新興療法在動物實驗或人體內試驗中取得了一定成果，但需要更多的人體試驗數據來評估各種療法的利弊。目前對于 DMD 仍沒有完全有效的療法，類固醇激素是 DMD 治療中唯一被批準能夠緩解疾病進展的藥物。希望對動物實驗模型的介紹以及相關評價方法的介紹和出現，能更好地對疾病進程和臨床試驗效果進行評價，為最終疾病的治療成功作出貢獻。
杜興型肌營養不良癥（Duchenne muscular dystrophy， DMD）是 X 染色體隱性遺傳的致死性神經肌肉疾病。該病是由抗肌萎縮蛋白基因突變導致抗肌萎縮蛋白的缺乏或功能不足，后者是一種細胞骨架蛋白，起到將肌動蛋白固定到肌膜內表面的機械連接作用，從而保證細胞收縮時的整體性[1]。DMD 患者表現為進行性的肌肉損傷和功能退化，從而導致肌肉無力、運動遲緩、步態不穩、呼吸困難和心肌病，最終由于心臟和呼吸功能受損去世。DMD 是最常見的進行性肌營養不良，作為一種遺傳性疾病，科研人員一直在尋找更為可靠的診斷方法和更為有效的治療手段。抗肌萎縮蛋白基因的發現，為該疾病的基因診斷和治療提供了方向。盡管現在對于 DMD 患者來說沒有完全治愈的手段，但包括基因療法在內的新興療法在治療 DMD 方面存在前景，這些治療方法包括基因替代療法、外顯子跳躍、基因組編輯、終止密碼子通讀、干細胞療法等。本文擬通過對 DMD 的基因診斷方法、治療進展以及評估預后的方法等進行綜述，旨在豐富臨床醫師對該疾病的認知，為 DMD 相關臨床診療工作提供參考和幫助。
1 基因診斷
由于大約 70% 的 DMD 患者的抗肌萎縮蛋白基因具有單外顯子或者多外顯子的缺失或者重復[2]，因此關于抗肌萎縮蛋白基因有無缺失或重復的檢測通常是第一個驗證性檢測。檢測最好通過多重連接探針擴增技術進行，因為多重聚合酶鏈反應只能識別缺失突變[3]。通過以上測試可以識別缺失突變或者重復突變的邊界，從而判別閱讀框是否被破壞。如果檢測結果呈陰性，則應該進行基因測序以篩查有無其他可能導致 DMD 的基因突變類型，如點突變（無義或者錯義）、小缺失突變以及小量重復或者插入突變[4]。最后，如果基因測定仍然不能驗證 DMD 的臨床診斷，則應該進行組織冰凍切片的免疫組織化學檢測或者肌肉蛋白提取物的蛋白質印記分析來檢測肌肉活檢樣品中有無抗肌萎縮蛋白。
2 動物模型
迄今為止，在眾多的 DMD 動物模型中，研究者更傾向于小鼠和犬的模型來闡明 DMD 的致病機制和研發新的治療方法。DMD 小鼠的壽命比野生型小鼠縮短了 25%，而 DMD 患者的壽命比正常人縮短了 75%，并且 DMD 小鼠的疾病進展也相對溫和，無法模擬人類的疾病進程[5]。與 DMD 小鼠不同，DMD 犬在臨床表現上與 DMD 患者相似，表現出肢體肌肉萎縮、纖維化、關節攣縮和唾液分泌過多。DMD 犬肢體無力和心臟功能受損的發病年齡以及預期壽命都與人類 DMD 患者相當[6]。這些臨床相似特點使得 DMD 犬模型可以作為臨床前基因療法研究的理想模型。
3 原發病因治療
由于 DMD 是由缺乏功能性抗肌萎縮蛋白引起的，恢復抗肌萎縮蛋白的功能或表達是一種治療方法，也是從根本上解決了 DMD 的病因。抗肌萎縮蛋白靶向的基因療法可以設計為作用于 DNA、mRNA 水平。針對 DMD 基因突變，治療方法有基因替代療法、外顯子跳躍、基因組編輯、終止密碼子通讀等，恢復抗肌萎縮蛋白正常水平和功能的方法有干細胞療法。
3.1 基因替代療法
基因替代療法選擇的病毒載體是腺相關病毒，因為其大多數血清型具有肌細胞嗜性，可以高效地感染骨骼肌[7]。盡管腺相關病毒非常小，轉載容量（大約 4.5 kb）相對于 DMD 基因（2.2 Mb）以及全長的抗肌萎縮蛋白 mRNA（14 kb）相對有限，但是有趣的是，由于抗肌萎縮蛋白蛋白域的模塊結構，抗肌萎縮蛋白的內部截短形式可以保留部分功能[7]。在輕度和無癥狀的貝克肌營養不良患者的肌肉組織中已經發現了剪接的抗肌萎縮蛋白產物[7]。微小抗肌萎縮蛋白是抗肌萎縮蛋白的截短形式，包含有 1 001 個氨基酸，缺乏桿狀結構域的冗雜區域，并且包含蛋白質的最小功能區域。因此可以通過腺相關病毒載體運送微小抗肌萎縮蛋白的方式來進行治療。
但是該方法仍然面臨諸多挑戰：① 對于人體內這些微小抗肌萎縮蛋白會起到多大的作用仍不完全清楚，因為所用的微小抗肌萎縮蛋白比貝克肌營養不良患者中最小的自然微小抗肌萎縮蛋白還要小 40%；② 轉基因表達的存在時間是有限的；③ 先前已經存在腺相關病毒抗體的 DMD 患者目前被嚴禁接受腺相關病毒基因療法，這部分患者約占所有 DMD 患者總數的 50%[8]；④ 用于治療 DMD 所需的病毒載體的規模生產非常昂貴且費時。
3.2 外顯子跳躍
外顯子跳躍使用的是修飾后的小 DNA 或者 RNA 片段，該片段稱為反義寡核苷酸序列，它們與 mRNA 抗肌萎縮蛋白轉錄前過程中的目標外顯子的特定序列進行結合，這種結合可以導致目標外顯子的跳躍，從而恢復閱讀框并且產生部分功能性抗肌萎縮蛋白[9]。該方法是基于以下事實：如果可以通過細胞的 RNA 剪接機制隱藏外顯子，就可以糾正閱讀框，大多數 DMD 患者理論上可以產生類似貝克肌營養不良樣的抗肌萎縮蛋白。大多數 DMD 患者有一個或者多個外顯子缺失，這些缺失通常集中在外顯子 45～55[10]。外顯子 51 跳躍適用于 13%～14% 的 DMD 患者[11]。目前已經開發了 2 種導致外顯子 51 跳躍的不同反義寡核苷酸藥物：eteplirsen 和 drisapersen[12]。Charleston 等[13]的研究表明，相較于未接受藥物治療的對照組患者，使用 eteplirsen 治療的患者抗肌萎縮蛋白含量增加（P=0.007），抗肌萎縮蛋白陽性纖維百分比也增加（P<0.001），抗肌萎縮蛋白的免疫熒光強度是前者的 2.4 倍，且多種檢測手段證明了 eteplirsen 可以促進外顯子跳躍和誘導新的抗肌萎縮蛋白表達。一項隨機安慰劑對照Ⅲ期臨床試驗結果表明，在評價藥物效果的主要指標 6 分鐘步行試驗上，drisapersen 藥物治療組與對照組無明顯差別（P=0.415）[14]。但外顯子跳躍療法的缺點是：由于反義寡核苷酸、DNA 轉錄本和抗肌萎縮蛋白的更新，必須重復進行反義寡核苷酸處理。
3.3 基因組編輯
規律成簇的間隔短回文重復-規律成簇的間隔短回文重復相關蛋白 9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，CRISPR-Cas9）編輯技術可用于在基因組中的特定位置誘導雙鏈 DNA 斷裂從而使同源重組或非同源末端連接[15]。同源修復只能在分裂細胞中發生，不適用于有絲分裂后的骨骼肌細胞和心肌細胞，但非同源末端連接修復可以通過刪除其他外顯子的方式來修復 DMD 的閱讀框。基因組編輯已成功用于恢復 DMD 患者來源的成肌細胞、人類誘導性多能干細胞來源的肌肉細胞和 DMD 小鼠模型中的類似貝克肌營養不良樣抗肌萎縮蛋白的表達[16-20]。在 DMD 小鼠模型中，基因組編輯可以改善骨骼肌和心肌的功能[16, 21]。基因組編輯需要構建 2 個腺病毒相關載體，一個用于傳遞 Cas9，另一個用于向體內骨骼肌和心肌傳遞引導 CRISPR RNA。基因組編輯僅發生在同時吸收了這 2 種成分的細胞中。為了盡量減少通過使用 2 個腺病毒相關載體來進行基因組編輯的副作用，已研究出通過單個較大腺病毒載體同時遞送指導 RNA 和 Cas9 來進行基因組編輯[22]。
基因組編輯的優點包括：① 因為基因組編輯發生在 DNA 水平，隨后從編輯后的基因組產生的轉錄 RNA 都將符合閱讀框，因此無需進行重復的基因組編輯，通過消除造成該疾病的基因突變，理論上具有一次治療后可以永久阻止疾病進一步進展的潛力；② 可以產生正常或者接近正常形式的抗肌萎縮蛋白，具體取決于要糾正的突變類型；③ 由于基因編輯后抗肌萎縮蛋白的表達來自于內源性抗肌萎縮蛋白基因，后者在天然的基因組位置包含正常的順式調控元件，時間空間表達和表達的水平都是正常的，而通過微小抗肌萎縮蛋白基因替代療法，基因的表達取決于腺相關病毒載體的順式調控序列。然而，與基因替代療法一樣，基因組編輯仍不能完全防止與 DMD 相關的肌肉損傷，腺相關病毒無法感染衛星細胞（即肌肉干細胞）[23]，因此修復后的肌肉仍然攜帶原始的 DMD 突變，隨著時間的推移，仍有可能出現部分功能性抗肌萎縮蛋白水平降低[21]。此外，脫靶效應的存在也為基因組編療法提出了挑戰，尚需要進一步了解基因組編輯的脫靶效應的機制和頻率來闡明相關的安全性問題。
3.4 終止密碼子通讀
在約 13% 的 DMD 患者中，DMD 是由于點突變（編碼氨基酸的密碼子突變后變為終止密碼子）造成的[24]，在這種情況下，閱讀框不會被無意義的突變破壞，但是，過早停止翻譯仍然會產生非功能性抗肌萎縮蛋白。終止密碼子通讀可以避免截短的非功能性抗肌萎縮蛋白的產生。研究發現，在由無義突變引起的各種疾病的細胞和動物模型中，ataluren 可以通過終止密碼子通讀來恢復受影響蛋白質的產生[25]。在 DMD 小鼠模型中，ataluren 治療可改善功能[26]。但是一項多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的Ⅲ期臨床試驗結果表明，無論受試者基線時 6 分鐘步行試驗結果為多少，ataluren 組和安慰劑組的 6 分鐘步行試驗結果變化差異均無統計學意義[27]。Ataluren 的主要缺點是僅適用于無義突變的個體（約 13% 的 DMD 患者[24]），且價格昂貴。
3.5 干細胞療法
該方法的基本原理是從未受影響的供體中分離出來的肌肉干細胞可以在體外擴增，然后移植到 DMD 患者中，移植的細胞可以遞送一個完整的 DMD 基因副本，但因為肌肉干細胞在高度豐富的肌肉組織的培養條件下增殖能力有限，該方法的有效性受到限制，并且移植的干細胞通過靜脈方式傳遞不會被骨骼肌吸收[28]。人類誘導性多能干細胞的可用性和基因組編輯使研究人員能夠糾正患者來源的誘導性多能干細胞中的 DMD 突變[29]，其未來目標是將誘導性多能干細胞分化為可以移植到患者體內的肌肉前體細胞。然而，由于干細胞向骨骼肌的遞送效率低下，這種方法還面臨著 Cas9 脫靶作用以及在治療患者中形成腫瘤或畸胎瘤的潛在風險的額外挑戰[30]。干細胞療法的另一個挑戰是與 DMD 相關的肌肉病理。由于慢性炎癥和纖維化，營養不良性肌肉的再生受到損害。理論上分析，確實到達肌肉組織的移植干細胞最可能的結局是分化為纖維組織或脂肪細胞，但尚不知道需要多少移植的干細胞來克服來自局部免疫細胞和纖維化組織的負分化信號，并使它們促進肌肉再生，而不是形成纖維化和脂肪組織。有趣的是，抗肌萎縮蛋白的部分功能可以由另一種細胞蛋白抗肌萎縮蛋白相關蛋白實現。Kennedy 等[31]的研究表明微小抗肌萎縮蛋白相關蛋白可以改善 DMD 小鼠模型嚴重減退的心臟和骨骼肌功能。由于抗肌萎縮蛋白相關蛋白對于 DMD 患者來說不是外來蛋白（因此可以降低免疫應答的風險），并且可以在功能上替代抗肌萎縮蛋白，從而為治療 DMD 提供了新的思路。此外，人類誘導性多能干細胞具有卓越的肌肉再生能力，若結合基因編輯技術，其衍生的肌源性祖細胞具有治療 DMD 的潛力。
4 針對繼發病理反應的治療
抗肌萎縮蛋白的喪失會誘發多種病理反應，包括炎癥反應、鈣穩態失調、功能性局部缺血以及肌肉再生受損[32]。針對繼發病理反應的相關治療通常只涉及其中一種或者少數幾種途徑，雖然單獨應用不可能停止或者逆轉病理過程，但是可以緩解病情進展。皮質類固醇抗炎是 DMD 的標準治療，雖然可以延緩 DMD 的進展，但長期使用會引起體重增加、胰島素抵抗、骨質疏松等不良反應[33]。推測這些不良反應是由反式激活引起的[34]。生長激素可以降低皮質醇激素治療的 DMD 小鼠模型中的炎癥反應、增強骨韌性[35]。此外，有研究發現在 DMD 小鼠中 vamorolone 保留了糖皮質激素受體結合的作用但沒有反式激活作用[36]。且納入 90 名健康志愿者的Ⅰ期試驗已經證實了 vamorolone 的安全性[37]。還有臨床試驗證明 vamorolone 以 2.0 或 6.0 mg/（kg·d）的劑量可以改善 DMD 患者的肌肉功能[38]。
5 治療效果評價
目前 DMD 的治療評價多是基于功能評估，如 6 分鐘步行試驗等。由于個體間的差異性和相對復雜的結局指標，臨床試驗的結果評定也因此受到影響。研究發現蘋果酸脫氫酶 2 的血清水平可以作為 DMD 的預后生物標志物，因為其與疾病分期和對皮質類固醇激素的治療反應以及輪椅依賴和肺功能變化有關[39]。此外，非侵入性技術，例如針對肌肉的定量測量，包括 MRI、光譜學檢查、電阻抗肌電圖檢查和超聲檢查等，可以敏感地識別患病的肌肉、疾病的進展以及對治療的反應，具有在臨床癥狀發作之前識別疾病病理的潛力[40-43]。
6 總結
關于 DMD 的研究和治療正在如火如荼地進行。恢復抗肌萎縮蛋白已經成為治療 DMD 的重要療法。反義寡核苷酸介導的外顯子跳躍仍然是一個重要的治療方法，基于此療法的新的藥物正在研發中。最近進入臨床試驗的治療方法是基因替代療法。盡管新興療法在動物實驗或人體內試驗中取得了一定成果，但需要更多的人體試驗數據來評估各種療法的利弊。目前對于 DMD 仍沒有完全有效的療法，類固醇激素是 DMD 治療中唯一被批準能夠緩解疾病進展的藥物。希望對動物實驗模型的介紹以及相關評價方法的介紹和出現，能更好地對疾病進程和臨床試驗效果進行評價，為最終疾病的治療成功作出貢獻。