引用本文： 施紹瑞, 聶濱, 郭渝, 羅立, 張林琳, 李文全, 鮮龔兵, 吳家亮, 林春興, 陳心足. 新型冠狀病毒肺炎病例多種生物樣本的病毒核酸檢測結果. 華西醫學, 2020, 35(2): 132-136. doi: 10.7507/1002-0179.202002063 復制
新型冠狀病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，NCP）最初發生在湖北武漢，初步考慮與野生動物接觸感染相關，目前已明確可以人傳人[1-2]。2019 新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）屬于冠狀病毒科 β 屬，其基因特征與嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）相關的冠狀病毒和中東呼吸綜合征相關冠狀病毒有明顯區別。目前研究顯示 2019-nCoV 與蝙蝠 SARS 樣冠狀病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性為 85% 以上[3-4]。體外分離培養時，2019-nCoV 在 96 h 左右即可在人呼吸道上皮細胞內發現。NCP 臨床表現以干咳、發熱為主，但也可隱匿發病[5]，確診主要依靠實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）和病毒基因測序。RT-PCR 可以檢測各種樣本中的 2019-nCoV RNA，其應用簡便，在 NCP 的診斷和治愈評估中具有重要意義。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》將 2019-nCoV 核酸 RT-PCR 確診檢測的生物樣本界定為呼吸道標本或血液標本[6]，但目前對其他類型的生物樣本的 2019-nCoV 核酸檢測結果缺少報道。本研究擬利用實時熒光定量 RT-PCR 方法檢測 NCP 患者不同類型生物樣本的帶毒情況，初步闡述 2019-nCoV 在患者體內不同系統的分布特點及其臨床意義，為 2019-nCoV 的早期診斷和傳播途徑分析提供實驗室依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究設計為小樣本橫斷面觀察性研究。本醫院（宜賓市第二人民醫院·四川大學華西醫院宜賓醫院）為 NCP 定點收治醫院，于 2020 年 1 月 24 日接診首例 NCP[7]。本研究納入接診首例以來至 2020 年 2 月 2 日本醫院收治的所有 NCP 確診病例。NCP 診斷標準：依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第三版）》和《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》，符合相關流行病學、臨床表現，以及咽拭子/痰液/纖維支氣管鏡灌洗液檢測 2019-nCoV 核酸陽性[4-5]。本研究經宜賓市第二人民醫院·四川大學華西醫院宜賓醫院生物醫學倫理委員會審核，經應急流程獲得批準立項（批件號：2020-027-01）。所有納入病例的個人信息均作匿名化處理。所有納入本研究的病例均被告知所采集的生物樣本僅用于科學研究和疫情防控，個人生物遺傳學信息不會泄露。所有觀察對象本人均簽署了研究知情同意書。所有研究知情同意書紙質文本均密封暫存于隔離病房內。
1.2 生物樣本采集
本研究中確診時呼吸道標本 2019-nCoV 核酸檢測結果為回顧性收集的基線。2020 年 2 月 2 日主管醫生在三級防護條件下，在隔離病房采集 NCP 患者的咽拭子、血液、糞便、尿液樣本作為復查。所有生物樣本均嚴格按標準流程密封轉運至本院檢驗科。
1.3 試劑和儀器
病毒 RNA 提取試劑盒、熒光定量 RT-PCR 試劑均為湖南圣湘生物科技股份有限公司提供。采用美國安捷倫科技公司 Mxp3000 PCR 儀進行實時熒光定量 PCR 擴增。
1.4 引物與熒光探針
引物與熒光探針均由湖南圣湘生物科技股份有限公司提供，有 2 個靶序列。FAM（ORF-1ab）區域靶標（ORF1ab）：正向引物為 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物為 ACGATTGTGCATCAGCTGA；熒光探針為 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。ROX（N 基因）區域：正向引物為 GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物為 CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；熒光探針為 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。
1.5 樣本預處理與檢測
1.5.1 樣本預處理
所有樣本先經過 56℃ 30 min 滅活。
血清樣本（Tris-EDTA 緩沖液/生理鹽水基質）：取出樣本后混勻，加入 10 μL 待測樣品和 10 μL 樣本核酸釋放劑到 PCR 擴增管中，槍頭吹打 3～5 次，作為待測樣本備用。
咽拭子/痰液/纖維支氣管鏡灌洗液樣本（病毒保存液等其他基質）：取出樣本后混勻，取 100～200 μL 待測樣本于 1.5 mL 離心管中，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min 離心 10 min，棄上清液后往沉淀中加入 50 μL 樣本核酸釋放劑震蕩混勻，靜置 10 min，作為待測樣本備用。
尿液標本：混勻樣本，取 500 μL 樣本置 1.5 mL 離心管中，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min 離心 5 min 后棄上清液，沉淀加入 1 mL 生理鹽水混勻重懸，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min 離心 5 min 棄上清液，沉淀加入 50 μL 核酸釋放劑裂解 10 min。
糞便標本：取黃豆般大小的大便置于 1.5 mL 離心管中，加入 1 mL 生理鹽水振蕩混勻 10 s，以離心半徑 8 cm、轉速 3 000 r/min 離心 30 s，取 200 μL 上清液置于新的離心管中，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min，離心 5 min，棄上清液，加入 1 mL 生理鹽水混勻重懸，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min 離心 10 min，沉淀加入 50 μL 核酸釋放劑，靜置 10 min。
1.5.2 樣本檢測
依次加入 30 μL 配制好的 PCR 混合液和 20 μL 上述處理后樣本至 PCR 反應管，在實時熒光 PCR 儀上機進行熒光定量 PCR 擴增檢測。所有檢查均重復 2 次，若至少其中 1 次為陽性即判定為 2019-nCoV 核酸檢測陽性。
1.6 結果評價
先分析內標在 HEX 通道是否有擴增曲線，且擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時所對應的擴增循環數（cycle threshold，Ct）≤40。① 若有，則表示本次檢測有效，可繼續進行后續分析：A. 若 FAM 或 ROX 通道檢測到典型的 S 型擴增曲線，且 Ct≤40，則判定該結果為 2019-nCoV 核酸檢測為陽性；B. 若 FAM 及 ROX 通道均未檢測到典型的 S 型擴增曲線（未檢測到 Ct），或 Ct>40，則表示 2019-nCoV 核酸檢測為陰性。② 若內標在 HEX 通道沒有檢測到 Ct 或 Ct>40，則表示本次檢測樣本濃度太低或者有干擾物質抑制反應，需重新實驗。
1.7 統計學方法
本研究為小樣本觀察性研究，描述性報道事件計數，無假設檢驗。
2 結果
2.1 病例信息
本研究共納入觀察了 7 例確診 NCP 病例，均為輸入型病例，其中男 5 例，女 2 例；平均年齡（31.9±9.1）歲；所有病例均以發熱為首發癥狀，伴或不伴呼吸道癥狀。依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》，7 例均經院內救治專家組會診評估分型為普通型。經積極治療無向重型/危重型轉化的病例。見表 1。
表1
7 例患者的基本情況
2.2 檢測結果
本研究檢測不同生物樣本類型的 2019-nCoV 核酸共 41 份（表 2），2 套引物均能較好地擴增出部分標本 2019-nCoV 基因的特異性片段。
表2
不同類型生物樣本的 2019-nCoV 核酸檢測結果
2.2.1 確診時檢測情況
7 例患者在發熱后第 3～7 天經咽拭子/痰液/纖維支氣管鏡灌洗液標本 2019-nCoV 核酸檢測陽性確診，其中 2 例在發熱后第 3 天確診（圖 1）；確診時，咽拭子單陽 2 例，痰液單陽 2 例，咽拭子和痰液陽性 2 例，咽拭子和纖維支氣管鏡灌洗液標本陽性 1 例。
圖1
咽拭子 2019-nCoV 核酸檢測結果的時間分布圖
2.2.2 復查時檢測情況
2020 年 2 月 2 日對在院的 7 例患者統一進行復查，時間分別處于各患者發熱后的第 7～15 天。經治復查 2019-nCoV 核酸結果顯示，5 例患者咽拭子 2019-nCoV 核酸檢測陰性，其中 1 例處于發熱后第 7 天（圖 1）；7 例患者血液、糞便、尿液中均未檢測出 2019-nCoV 核酸（表 2）。
3 討論
本項小樣本橫斷面觀察性研究共納入 7 例輸入型普通型 NCP 患者，其確診時間在發熱后第 3～7 天。本研究中經治復查時間分別處于各患者發熱后的第 7～15 天，2019-nCoV 核酸結果顯示，5 例患者咽拭子檢測陰性，其中 1 例在發熱后第 7 天檢測 2019-nCoV 核酸即轉陰；7 例患者血液、糞便、尿液中均未檢測出 2019-nCoV 核酸。
目前，檢測 2019-nCoV 有多種方法。病原學檢測方法（即通過體外培養分離病毒）費時較長，分離陽性率不高。血清學方法需等待患者出現特異性抗體，難以對病毒感染進行早期診斷。實時熒光 RT-PCR 技術可明顯提高 2019-nCoV 檢測的特異性和敏感性。該法可用于檢測各類型生物樣本（血液、痰液、呼吸道分泌物、糞便和尿液等）中 2019-nCoV 的 RNA。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》提出呼吸道標本或血液標本通過實時熒光 RT-PCR 檢測 2019-nCoV 核酸陽性是確診的方法之一，解除隔離出院的實驗室標準為間隔至少 1 d 的連續 2 次呼吸道標本 2019-nCoV 核酸檢測陰性[6]。因此，采用實時熒光 RT-PCR 檢測技術在 2019-nCoV 的早期診斷和救治效果評價中具有重要臨床意義。
2020 年 1 月 24 日，根據疫情防控需要，四川省依法依規及時啟動重大突發公共衛生事件一級響應，全省網格化排查入川人員，以及早期全面部署預檢分診、發熱門診和定點收治醫院。因此，這一系列強有力的防控措施實現了輸入型 NCP 病例“早發現、早報告、早隔離、早治療”的落實。本研究提示實時熒光 RT-PCR 檢測在技術上可實現輸入型普通型 NCP 病例的早期檢出。有未發表數據提示有在發病后第 1 天即檢出 2019-nCoV 核酸的病例。輸入型 NCP 病例的重型/危重型的比例在國內普遍較低，與在嚴防嚴控的情況下實現了早診斷和早治療有一定關系。也因為實現了早診斷和早治療，本研究觀察病例均無向重型/危重型轉化的傾向，而且 1 例早在發熱后第 7 天即 2019-nCoV 核酸檢測轉陰，轉歸良好。
本研究對同一患者同一時間不同種類生物樣本的 2019-nCoV 核酸進行了檢測，以觀察 2019-nCoV 在呼吸道、循環系統、消化道、泌尿道的分布情況。普通型 NCP 患者隨著機體免疫系統的較快激活和增強，體內病毒被清除或抑制在低水平，因此有的病例也呈現 2019-nCoV 核酸檢測早期轉為陰性。除呼吸道標本外，NCP 病例的其他生物樣本行 2019-nCoV 核酸檢測少有報告。本研究在普通型 NCP 病例血液標本中未檢出 2019-nCoV 核酸，逆向推測若血液中檢出 2019-nCoV 核酸是否為重型/危重型的預測指標需要進一步的研究探索。此外，本研究在普通型 NCP 病例糞便和尿液標本中未檢出 2019-nCoV 核酸，2019-nCoV 是否侵入普通型 NCP 病例的消化道和泌尿道需要更進一步的研究，普通型 NCP 病例是否成為糞口傳播的傳染源亦需要進一步的研究。但有新聞媒體報道 NCP 病例糞便中可檢出 2019-nCoV 核酸，因此為探究 2019-nCoV 的傳播途徑，四川省衛生健康委員會于 2020 年 2 月 6 日啟動了全省定點收治醫院開展 NCP 病例的糞便 2019-nCoV 核酸檢測項目。此項政府主導的多中心研究有助于闡明 2019-nCoV 是否經糞口途徑傳播。
本研究僅為初步探索性分析，因此存在一些不足之處：① 納入病例數很少，因此若分別開展湖北內和湖北外的多中心研究，則能得到更為確定性的研究結果；② 缺少重型/危重型病例，因此同樣建議在湖北內和湖北外納入重型/危重型進行此類多類型生物樣本的檢測分析；③ 觀察時間點不統一，本研究為單日的橫斷面研究設計，因此病例分別處于病程中不同時間點，異質性較大；④ 缺少連續觀察，病例追蹤時間短，若采用前瞻性隊列研究設計動態觀察早期、中期、遠期同一時間點 2019-nCoV 核酸檢測結果則更具有分析價值，尤其是病程初期和后期的血液、糞便、尿液標本檢測目前缺少相關探索性研究；⑤ 本研究復查咽拭子 2019-nCoV 核酸陰性者達 5 例，因而其同一時點血液、糞便、尿液檢測陰性的可分析價值相對較為有限，建議納入更多咽拭子 2019-nCoV 核酸陽性的病例同期檢測其多種生物樣本的 2019-nCoV 核酸；⑥ 最后，目前檢測手段尚需繼續完善，以減少假陰性結果導致的分析和判斷受影響。
綜上所述，本項納入普通型 NCP 病例的小樣本橫斷面觀察性研究發現，對于普通型 NCP 病例，實時熒光 RT-PCR 檢測在技術上可在發病后第 3～7 天檢出 2019-nCoV 核酸，同時 2019-nCoV 核酸可在病程第 7 天開始轉陰。普通型 NCP 病例在病程第 7～15 天期間的單日血液、糞便、尿液中未檢出 2019-nCoV 核酸。本研究僅為初步的探索性研究，尚需要更高質量的研究來獲得更為確定性的結論。
志謝：衷心感謝國內外的社會各界對新型冠狀病毒肺炎疫情阻擊戰作出的巨大努力和支持。向奮戰在疫情前線守衛人民生命安全和身體健康的所有醫務工作者致敬。
利益沖突：所有作者無申報事項。
新型冠狀病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，NCP）最初發生在湖北武漢，初步考慮與野生動物接觸感染相關，目前已明確可以人傳人[1-2]。2019 新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）屬于冠狀病毒科 β 屬，其基因特征與嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）相關的冠狀病毒和中東呼吸綜合征相關冠狀病毒有明顯區別。目前研究顯示 2019-nCoV 與蝙蝠 SARS 樣冠狀病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性為 85% 以上[3-4]。體外分離培養時，2019-nCoV 在 96 h 左右即可在人呼吸道上皮細胞內發現。NCP 臨床表現以干咳、發熱為主，但也可隱匿發病[5]，確診主要依靠實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）和病毒基因測序。RT-PCR 可以檢測各種樣本中的 2019-nCoV RNA，其應用簡便，在 NCP 的診斷和治愈評估中具有重要意義。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》將 2019-nCoV 核酸 RT-PCR 確診檢測的生物樣本界定為呼吸道標本或血液標本[6]，但目前對其他類型的生物樣本的 2019-nCoV 核酸檢測結果缺少報道。本研究擬利用實時熒光定量 RT-PCR 方法檢測 NCP 患者不同類型生物樣本的帶毒情況，初步闡述 2019-nCoV 在患者體內不同系統的分布特點及其臨床意義，為 2019-nCoV 的早期診斷和傳播途徑分析提供實驗室依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究設計為小樣本橫斷面觀察性研究。本醫院（宜賓市第二人民醫院·四川大學華西醫院宜賓醫院）為 NCP 定點收治醫院，于 2020 年 1 月 24 日接診首例 NCP[7]。本研究納入接診首例以來至 2020 年 2 月 2 日本醫院收治的所有 NCP 確診病例。NCP 診斷標準：依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第三版）》和《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》，符合相關流行病學、臨床表現，以及咽拭子/痰液/纖維支氣管鏡灌洗液檢測 2019-nCoV 核酸陽性[4-5]。本研究經宜賓市第二人民醫院·四川大學華西醫院宜賓醫院生物醫學倫理委員會審核，經應急流程獲得批準立項（批件號：2020-027-01）。所有納入病例的個人信息均作匿名化處理。所有納入本研究的病例均被告知所采集的生物樣本僅用于科學研究和疫情防控，個人生物遺傳學信息不會泄露。所有觀察對象本人均簽署了研究知情同意書。所有研究知情同意書紙質文本均密封暫存于隔離病房內。
1.2 生物樣本采集
本研究中確診時呼吸道標本 2019-nCoV 核酸檢測結果為回顧性收集的基線。2020 年 2 月 2 日主管醫生在三級防護條件下，在隔離病房采集 NCP 患者的咽拭子、血液、糞便、尿液樣本作為復查。所有生物樣本均嚴格按標準流程密封轉運至本院檢驗科。
1.3 試劑和儀器
病毒 RNA 提取試劑盒、熒光定量 RT-PCR 試劑均為湖南圣湘生物科技股份有限公司提供。采用美國安捷倫科技公司 Mxp3000 PCR 儀進行實時熒光定量 PCR 擴增。
1.4 引物與熒光探針
引物與熒光探針均由湖南圣湘生物科技股份有限公司提供，有 2 個靶序列。FAM（ORF-1ab）區域靶標（ORF1ab）：正向引物為 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物為 ACGATTGTGCATCAGCTGA；熒光探針為 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。ROX（N 基因）區域：正向引物為 GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物為 CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；熒光探針為 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。
1.5 樣本預處理與檢測
1.5.1 樣本預處理
所有樣本先經過 56℃ 30 min 滅活。
血清樣本（Tris-EDTA 緩沖液/生理鹽水基質）：取出樣本后混勻，加入 10 μL 待測樣品和 10 μL 樣本核酸釋放劑到 PCR 擴增管中，槍頭吹打 3～5 次，作為待測樣本備用。
咽拭子/痰液/纖維支氣管鏡灌洗液樣本（病毒保存液等其他基質）：取出樣本后混勻，取 100～200 μL 待測樣本于 1.5 mL 離心管中，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min 離心 10 min，棄上清液后往沉淀中加入 50 μL 樣本核酸釋放劑震蕩混勻，靜置 10 min，作為待測樣本備用。
尿液標本：混勻樣本，取 500 μL 樣本置 1.5 mL 離心管中，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min 離心 5 min 后棄上清液，沉淀加入 1 mL 生理鹽水混勻重懸，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min 離心 5 min 棄上清液，沉淀加入 50 μL 核酸釋放劑裂解 10 min。
糞便標本：取黃豆般大小的大便置于 1.5 mL 離心管中，加入 1 mL 生理鹽水振蕩混勻 10 s，以離心半徑 8 cm、轉速 3 000 r/min 離心 30 s，取 200 μL 上清液置于新的離心管中，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min，離心 5 min，棄上清液，加入 1 mL 生理鹽水混勻重懸，以離心半徑 8 cm、轉速 12 000 r/min 離心 10 min，沉淀加入 50 μL 核酸釋放劑，靜置 10 min。
1.5.2 樣本檢測
依次加入 30 μL 配制好的 PCR 混合液和 20 μL 上述處理后樣本至 PCR 反應管，在實時熒光 PCR 儀上機進行熒光定量 PCR 擴增檢測。所有檢查均重復 2 次，若至少其中 1 次為陽性即判定為 2019-nCoV 核酸檢測陽性。
1.6 結果評價
先分析內標在 HEX 通道是否有擴增曲線，且擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時所對應的擴增循環數（cycle threshold，Ct）≤40。① 若有，則表示本次檢測有效，可繼續進行后續分析：A. 若 FAM 或 ROX 通道檢測到典型的 S 型擴增曲線，且 Ct≤40，則判定該結果為 2019-nCoV 核酸檢測為陽性；B. 若 FAM 及 ROX 通道均未檢測到典型的 S 型擴增曲線（未檢測到 Ct），或 Ct>40，則表示 2019-nCoV 核酸檢測為陰性。② 若內標在 HEX 通道沒有檢測到 Ct 或 Ct>40，則表示本次檢測樣本濃度太低或者有干擾物質抑制反應，需重新實驗。
1.7 統計學方法
本研究為小樣本觀察性研究，描述性報道事件計數，無假設檢驗。
2 結果
2.1 病例信息
本研究共納入觀察了 7 例確診 NCP 病例，均為輸入型病例，其中男 5 例，女 2 例；平均年齡（31.9±9.1）歲；所有病例均以發熱為首發癥狀，伴或不伴呼吸道癥狀。依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》，7 例均經院內救治專家組會診評估分型為普通型。經積極治療無向重型/危重型轉化的病例。見表 1。
表1
7 例患者的基本情況
2.2 檢測結果
本研究檢測不同生物樣本類型的 2019-nCoV 核酸共 41 份（表 2），2 套引物均能較好地擴增出部分標本 2019-nCoV 基因的特異性片段。
表2
不同類型生物樣本的 2019-nCoV 核酸檢測結果
2.2.1 確診時檢測情況
7 例患者在發熱后第 3～7 天經咽拭子/痰液/纖維支氣管鏡灌洗液標本 2019-nCoV 核酸檢測陽性確診，其中 2 例在發熱后第 3 天確診（圖 1）；確診時，咽拭子單陽 2 例，痰液單陽 2 例，咽拭子和痰液陽性 2 例，咽拭子和纖維支氣管鏡灌洗液標本陽性 1 例。
圖1
咽拭子 2019-nCoV 核酸檢測結果的時間分布圖
2.2.2 復查時檢測情況
2020 年 2 月 2 日對在院的 7 例患者統一進行復查，時間分別處于各患者發熱后的第 7～15 天。經治復查 2019-nCoV 核酸結果顯示，5 例患者咽拭子 2019-nCoV 核酸檢測陰性，其中 1 例處于發熱后第 7 天（圖 1）；7 例患者血液、糞便、尿液中均未檢測出 2019-nCoV 核酸（表 2）。
3 討論
本項小樣本橫斷面觀察性研究共納入 7 例輸入型普通型 NCP 患者，其確診時間在發熱后第 3～7 天。本研究中經治復查時間分別處于各患者發熱后的第 7～15 天，2019-nCoV 核酸結果顯示，5 例患者咽拭子檢測陰性，其中 1 例在發熱后第 7 天檢測 2019-nCoV 核酸即轉陰；7 例患者血液、糞便、尿液中均未檢測出 2019-nCoV 核酸。
目前，檢測 2019-nCoV 有多種方法。病原學檢測方法（即通過體外培養分離病毒）費時較長，分離陽性率不高。血清學方法需等待患者出現特異性抗體，難以對病毒感染進行早期診斷。實時熒光 RT-PCR 技術可明顯提高 2019-nCoV 檢測的特異性和敏感性。該法可用于檢測各類型生物樣本（血液、痰液、呼吸道分泌物、糞便和尿液等）中 2019-nCoV 的 RNA。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》提出呼吸道標本或血液標本通過實時熒光 RT-PCR 檢測 2019-nCoV 核酸陽性是確診的方法之一，解除隔離出院的實驗室標準為間隔至少 1 d 的連續 2 次呼吸道標本 2019-nCoV 核酸檢測陰性[6]。因此，采用實時熒光 RT-PCR 檢測技術在 2019-nCoV 的早期診斷和救治效果評價中具有重要臨床意義。
2020 年 1 月 24 日，根據疫情防控需要，四川省依法依規及時啟動重大突發公共衛生事件一級響應，全省網格化排查入川人員，以及早期全面部署預檢分診、發熱門診和定點收治醫院。因此，這一系列強有力的防控措施實現了輸入型 NCP 病例“早發現、早報告、早隔離、早治療”的落實。本研究提示實時熒光 RT-PCR 檢測在技術上可實現輸入型普通型 NCP 病例的早期檢出。有未發表數據提示有在發病后第 1 天即檢出 2019-nCoV 核酸的病例。輸入型 NCP 病例的重型/危重型的比例在國內普遍較低，與在嚴防嚴控的情況下實現了早診斷和早治療有一定關系。也因為實現了早診斷和早治療，本研究觀察病例均無向重型/危重型轉化的傾向，而且 1 例早在發熱后第 7 天即 2019-nCoV 核酸檢測轉陰，轉歸良好。
本研究對同一患者同一時間不同種類生物樣本的 2019-nCoV 核酸進行了檢測，以觀察 2019-nCoV 在呼吸道、循環系統、消化道、泌尿道的分布情況。普通型 NCP 患者隨著機體免疫系統的較快激活和增強，體內病毒被清除或抑制在低水平，因此有的病例也呈現 2019-nCoV 核酸檢測早期轉為陰性。除呼吸道標本外，NCP 病例的其他生物樣本行 2019-nCoV 核酸檢測少有報告。本研究在普通型 NCP 病例血液標本中未檢出 2019-nCoV 核酸，逆向推測若血液中檢出 2019-nCoV 核酸是否為重型/危重型的預測指標需要進一步的研究探索。此外，本研究在普通型 NCP 病例糞便和尿液標本中未檢出 2019-nCoV 核酸，2019-nCoV 是否侵入普通型 NCP 病例的消化道和泌尿道需要更進一步的研究，普通型 NCP 病例是否成為糞口傳播的傳染源亦需要進一步的研究。但有新聞媒體報道 NCP 病例糞便中可檢出 2019-nCoV 核酸，因此為探究 2019-nCoV 的傳播途徑，四川省衛生健康委員會于 2020 年 2 月 6 日啟動了全省定點收治醫院開展 NCP 病例的糞便 2019-nCoV 核酸檢測項目。此項政府主導的多中心研究有助于闡明 2019-nCoV 是否經糞口途徑傳播。
本研究僅為初步探索性分析，因此存在一些不足之處：① 納入病例數很少，因此若分別開展湖北內和湖北外的多中心研究，則能得到更為確定性的研究結果；② 缺少重型/危重型病例，因此同樣建議在湖北內和湖北外納入重型/危重型進行此類多類型生物樣本的檢測分析；③ 觀察時間點不統一，本研究為單日的橫斷面研究設計，因此病例分別處于病程中不同時間點，異質性較大；④ 缺少連續觀察，病例追蹤時間短，若采用前瞻性隊列研究設計動態觀察早期、中期、遠期同一時間點 2019-nCoV 核酸檢測結果則更具有分析價值，尤其是病程初期和后期的血液、糞便、尿液標本檢測目前缺少相關探索性研究；⑤ 本研究復查咽拭子 2019-nCoV 核酸陰性者達 5 例，因而其同一時點血液、糞便、尿液檢測陰性的可分析價值相對較為有限，建議納入更多咽拭子 2019-nCoV 核酸陽性的病例同期檢測其多種生物樣本的 2019-nCoV 核酸；⑥ 最后，目前檢測手段尚需繼續完善，以減少假陰性結果導致的分析和判斷受影響。
綜上所述，本項納入普通型 NCP 病例的小樣本橫斷面觀察性研究發現，對于普通型 NCP 病例，實時熒光 RT-PCR 檢測在技術上可在發病后第 3～7 天檢出 2019-nCoV 核酸，同時 2019-nCoV 核酸可在病程第 7 天開始轉陰。普通型 NCP 病例在病程第 7～15 天期間的單日血液、糞便、尿液中未檢出 2019-nCoV 核酸。本研究僅為初步的探索性研究，尚需要更高質量的研究來獲得更為確定性的結論。
志謝：衷心感謝國內外的社會各界對新型冠狀病毒肺炎疫情阻擊戰作出的巨大努力和支持。向奮戰在疫情前線守衛人民生命安全和身體健康的所有醫務工作者致敬。
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