引用本文： 李蘭, 程冬旗, 袁玉佳, 鐘凌, 趙焜, 安星星, 劉敬平, 陳又南, 陸燕蓉. 不同劑量氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤誘導大鼠高尿酸腎損傷模型的建立與評價. 華西醫學, 2021, 36(5): 643-650. doi: 10.7507/1002-0179.202001197 復制
尿酸是嘌呤代謝的終產物，高尿酸血癥是由于嘌呤代謝障礙使得尿酸生成增加和/或尿酸排泄減少所導致的一種代謝性疾病[1]。隨著生活水平的提高，人們攝入的食物結構發生了重大變化，蛋白質及脂肪的攝入顯著提高，高脂血癥和高尿酸血癥的發病率也明顯提高[2-4]。大量研究結果表明，血尿酸水平升高與腎臟相關疾病、動脈粥樣硬化及冠心病、原發性高血壓、腦卒中等疾病的發生率、死亡率等呈獨立正相關[5-6]。嚙齒類動物是高尿酸血癥研究中最常用的動物模型，但因嚙齒類動物具有尿酸酶、可將尿酸分解并排出體外，所以很難發生高尿酸血癥。嚙齒類動物高尿酸血癥模型建立主要從促進尿酸合成和抑制其排泄這兩方面考慮，方法眾多，但其誘導周期、腎損傷程度以及觀察指標差異較大。有數據顯示大鼠采用腺嘌呤聯合氧嗪酸鉀灌胃 21 d 可建立大鼠的高尿酸腎損傷模型，病理觀察可見炎性細胞浸潤、腎小管局灶性萎縮、高劑量下腎小管擴張、細胞間質纖維化嚴重[7]；酵母膏、氧嗪酸鉀、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、乙胺丁醇等造模劑單劑或組合制劑通過灌胃及腹腔注射等方式給藥，可誘導嚙齒類動物高尿酸腎損傷模型[8-11]。而給藥方式、使用的藥物及其劑量各異，不同種屬的嚙齒類動物對藥物的敏感性各不相同，導致造模周期不一致、動物腎臟損傷程度差異較大。本研究利用氧嗪酸鉀作為尿酸酶抑制劑，阻斷尿酸分解代謝，并同時補充尿酸前體物質腺嘌呤，以達到升高尿酸水平的目的；通過不同劑量氧嗪酸鉀和腺嘌呤的聯合誘導，探索和優化大鼠高尿酸血癥的造模劑量和造模時間，嘗試建立一種腎臟病理損傷接近人類發病特點的、較為穩定的高尿酸腎損傷動物模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
56 只成年雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重 220～240 g，購自四川大學實驗動物中心［實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2018-026］，在實驗開始以前，至少給予動物 1 周時間適應環境，實驗 SD 大鼠于室溫 20～25℃、70% 濕度條件下分籠飼養，12 h 明暗交替，自由采食和飲水［實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2018-119，動物實驗倫理備案號：2015070A］。
1.2 實驗試劑
氧嗪酸鉀（山東中科泰斗化學有限公司），純度≥97%；腺嘌呤（美國 Amerco 公司）；羧甲基纖維素鈉（成都科龍化工試劑廠）；兔抗鼠微管蛋白（Tubulin）抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；兔抗鼠 BAX 抗體（美國 CST 公司）；山羊抗鼠 E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）抗體（美國 BD 公司）；兔抗人 α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（美國 Abcam 公司）；山羊抗小鼠纖維連接蛋白（fibronectin，FN）抗體（美國 Proteintech 公司）；山羊抗鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（美國 CST 公司）；兔抗人血管細胞黏附分子 1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）抗體（美國 CST 公司）；辣根過氧化物（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔二抗（美國 life technology-Thermo Fisher Scientific 公司）；HRP 標記兔抗小鼠二抗（美國 life technology-Thermo Fisher Scientific 公司）。
1.3 儀器
生化自動分析儀（美國 Roche 公司，COBAS 400 Plus）；倒置相差顯微鏡（日本 Olympus 公司，IX50）；分光光度計（美國 Thermo Scientific 公司，NanoDrop 2000）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（美國 Bio-Rad 公司，CFX 96）；電泳儀（美國 Bio-Rad 公司，WideMini-subcell GTSystem）；成像儀（法國 FUSION 公司，FX7）。
1.4 實驗方法
1.4.1 SD 大鼠空腹血生化水平檢測
實驗開始前對所有大鼠進行空腹血清尿酸值測定，選取空腹血清尿酸值在 60～80 μmol/L 的大鼠作為實驗對象。此后每周用靜脈留置針穿刺尾靜脈取大鼠血樣 0.5 mL 于 EP 管中，常溫靜置 0.5 h 后，1 000×g離心 10 min，取上清液，用羅氏生化自動分析儀檢測血尿酸、血肌酐、血尿素氮。
1.4.2 誘導 SD 大鼠高尿酸血癥模型
用 0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液懸浮不同濃度的氧嗪酸鉀與腺嘌呤聯合造模分為 7 組，其中正常對照組標記為 NC，不同的模型組分別標記為 UA1~UA6（表 1），每組 8 只大鼠；灌胃 1 次/d，連續 5 周，5 周后停止造模，正常飼養 1 周。對大鼠每日稱重，并按照 1 mL/100 g 體重的劑量進行灌胃。
表1
氧嗪酸鉀與腺嘌呤聯合造模劑量及分組情況
1.4.3 SD 大鼠組織樣本的收集與檢測
第 6 周各組大鼠用 7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g 體重）腹腔注射麻醉，保定后備皮消毒，打開腹腔及胸腔，暴露心臟，穿刺右心室采血 1 mL 用于血生化檢測，快速剪取雙腎至手術盤，去除腎被膜、稱重，計算腎臟指數（腎重/體重），觀察腎臟的病理改變。取一個腎的 1/4 放入組織包埋盒用 10% 中性甲醛浸泡 48 h 后，用于腎組織病理蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）及 Masson 染色。按照 2010 年國際腎臟病理學會提出的慢性腎病分型國際標準[12]，綜合 HE 及 Masson 染色結果進行評分。另取腎組織的各 1/4 凍存于液氮中，且本研究根據各組動物的腎臟組織學病變程度，選擇動物存活率較高、腎組織相對病變較輕（慢性進行性腎病一級）的 UA2 與 UA5 組動物的腎臟組織分別用于腎組織炎癥、纖維化相關因子的基因表達差異分析及其蛋白表達水平分析，以確定后續研究動物造模采用的方案。
1.4.4 組織炎癥、纖維化相關基因表達：逆轉錄PCR
Trizol 法提取總 RNA 后，用核酸蛋白定量儀檢測濃度及純度，取 1 μg RNA 溶液按照 Vazyme HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 試劑盒說明書逆轉錄成互補 DNA 溶液。以 GAPDH 為內參，通過上海生工設計并合成相應上下游引物（表 2），按照 Vazyme AceQTM qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒說明書，用 20 μL 體系在實時熒光定量 PCR 擴增儀上進行反應，反應條件為 95℃ 3 min，40 個循環（95℃ 10 s，60℃ 30 s），溶解曲線 95℃ 15 s，65～95℃ 每上升 0.5℃ 為一個梯度使用 Bio-Rad CFX96 熒光定量 PCR 儀進行熒光檢測，通過 2?ΔΔCT法計算各組腎組織炎癥、纖維化相關因子的基因表達差異。
表2
PCR 引物序列
1.4.5 組織炎癥和纖維化相關蛋白表達檢測：蛋白免疫印跡
用放射免疫沉淀法裂解液（中國北京康為世紀生物科技有限公司）裂解 SD 大鼠腎組織得到總蛋白后，蛋白質定量聚氰基丙烯酸正丁酯法檢測蛋白含量并煮沸變性，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，封閉后 4℃ 一抗 Tubulin、BAX、E-cad、α-SMA、FN、TNF-α、VCAM-1 孵育過夜，清洗后 37℃ 孵育二抗 2 h，通過增強化學發光法用成像儀采集圖像，并使用 Image J 軟件進行灰度分析。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，分析前采用Z值轉換剔除極端異常值。分類變量以例數表示。連續變量采用 Kolmogorov-Smirnov 和 Shapiro-Wilk 檢驗其正態性，正態分布資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用 Tukey 法進行兩兩比較，方差不齊時采用 Tamhane’s T2 檢驗進行分析。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠生存狀況及血尿酸水平檢測
在飼養過程中發現，模型組大鼠相比 NC 組狀態較差，表現為體型消瘦，毛色無光澤。高劑量腺嘌呤組大鼠在造模 2 周后開始出現少量死亡。各組大鼠的生存狀況見圖 1a。造模 2 周時各組 8 只大鼠均存活，到造模第 5 周時，NC 組、UA1 組、UA4 組無大鼠死亡，其生存率為 1.0。UA2 組在第 23 天死亡 1 只，UA5 組在第 25 天死亡1 只，故其生存率為 0.875。UA3 組在第 14、17 天分別死亡 1 只，其生存率為 0.75。UA6 組，在第 23、25、28 天分別死亡 1 只，其生存率為 0.625。
圖1
造模大鼠生存曲線及血尿酸水平的變化
a. 生存曲線；b. 造模后 NC、UA1、UA2、UA3 組血尿酸水平變化；c. 造模后 NC、UA4、UA5、UA6 組血尿酸水平變化
1 000 mg/kg 氧嗪酸鉀與不同劑量腺嘌呤聯合誘導的大鼠血尿酸水平變化及 1 500 mg/kg 氧嗪酸鉀與不同劑量腺嘌呤聯合誘導的大鼠血尿酸水平變化見圖 1b、1c。通過統計分析發現，造模 1 周后，大鼠血尿酸水平升高，1 ~ 5 周內造模各組尿酸水平隨時間增加而升高，且不同劑量組的尿酸水平隨時間變化各有不同，具有統計學意義（P<0.05）。在停止造模后，第 6 周尿酸基本恢復到造模前水平。
2.2 大鼠腎功能變化
造模第 5 周，模型組大鼠的血肌酐、血尿素氮水平均較正常組有所升高，其中聯合腺嘌呤 100 mg/kg 組（UA3、UA6）升高較為明顯；同劑量氧嗪酸鉀與腺嘌呤聯合造模后，隨腺嘌呤劑量增加，大鼠腎臟指數升高。與 NC 組相比，UA3、UA5 和 UA6 組腎臟指數升高，且差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
造模第 5 周各組大鼠腎功能及腎臟指數的變化（
）
表4
造模第 6 周大鼠腎病病理評分
2.3 造模大鼠腎臟解剖和組織學檢測
第 6 周解剖觀察發現，與正常對照組相比，1 000 mg/kg 氧嗪酸鉀組腎臟外觀和剖面無明顯異常；聯合 50 mg/kg 腺嘌呤處理之后，腎臟髓質變白；聯合 100 mg/kg 腺嘌呤處理之后，腎臟外觀可見白色顆粒，髓質與皮質間有明顯的白色沉積物；1 500 mg/kg 氧嗪酸鉀和聯合腺嘌呤誘導的各組腎臟外觀和剖面的改變更加明顯（圖 2）。
圖2
造模第 6 周各組大鼠腎臟外觀及剖面的改變
大鼠腎 HE 染色觀察發現：UA1 組處理之后，腎小管出現管型；UA2 組腎小球萎縮，腎小管內刷狀緣減少，管腔擴大；UA3 組腎小管間質中炎性細胞大量聚集并且小管間質纖維化；UA5 組處理大鼠之后，腎小管細胞增生、纖維細胞增多、炎性細胞大量聚集，部分腎小管上皮細胞壞死（圖 3）。
圖3
造模第 6 周各組大鼠腎組織 HE 染色（HE ×400）
Masson 染色觀察發現：添加腺嘌呤的 4 個組（UA2、UA3、UA5、UA6）較 NC 組腎臟膠原纖維的表達明顯升高，且 UA3 及 UA6 的細胞間質纖維化程度最高，UA2、UA5 次之（圖 4）。根據慢性腎病分型國際標準評分，從各組小管間質及血管病理評分中（表 4）可以看出，氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤處理后相比于正常組有顯著的病理改變（P<0.05），其中評分 UA2（4.00±1.60）、UA5（5.00±1.85）為慢性進行性腎病 1 級，大鼠存活率較高、腎組織相對病變較輕。
圖4
造模第 6 周大鼠腎組織 Masson 染色（Masson ×400）
2.4 大鼠腎組織炎癥因子表達的檢測
1 000 mg/kg 氧嗪酸鉀添加不同劑量腺嘌呤造模，隨腺嘌呤劑量，增加大鼠腎組織炎癥和纖維化相關基因的 mRNA 水平升高（表 5）。選定 50 mg/kg 腺嘌呤添加不同劑量氧嗪酸鉀造模，隨氧嗪酸鉀劑量的增加大鼠腎組織纖維化相關基因 FN、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的 mRNA 水平升高，FN、TGF-β 基因表達水平 UA5 組均顯著高于 NC 組（P<0.05），UA2、UA5 組炎癥相關基因 IL-1β 相比于 NC 組無統計學意義（P>0.05），而兩組的 TNF-α 表達均顯著高于 NC 組（P<0.05）。見表 5。
表5
造模第 6 周大鼠腎組織炎癥及纖維化相關基因的 mRNA 表達水平檢測結果（
）
表6
蛋白質印跡法檢測造模第 6 周大鼠腎組織蛋白表達半定量分析（
）
50 mg/kg 腺嘌呤添加不同劑量氧嗪酸鉀（1 000、1 500 mg/kg）造模大鼠腎組織蛋白質印跡法檢測結果顯示，氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤組相比于 NC 組，VCAM-1、TNF-α、FN、α-SMA、BAX 的表達水平差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、表 6。
圖5
造模第 6 周大鼠腎組織炎癥及纖維化相關蛋白表達的變化
3 討論
高尿酸血癥對腎臟的損傷機制主要是由尿酸結晶引起的梗阻及局部炎癥反應，目前臨床治療方案是采用化學合成降尿酸藥物來降低尿酸水平，但患者易發生不良反應[13-15]。諸多研究者為尋求新的治療藥物以減少不良反應的發生，便希望首先在動物模型上觀察其藥物療效及作用，而嚙齒類動物是藥物研究中最常用的動物模型[16]。因此，建立一種類似人類高尿酸所致腎損傷的發病特點、且較為穩定的高尿酸腎損傷動物模型至關重要。
然而，由于嚙齒類動物體內具有尿酸酶，能將尿酸氧化成尿囊素排出體外，導致其血尿酸水平非常低，這一直是誘導嚙齒類動物建立高尿酸血癥模型的難點所在。目前常用的手段是從促進尿酸合成及抑制尿酸排泄這兩方面來建立高尿酸嚙齒類動物模型：① 促進尿酸的合成：尿酸前體物質增多可刺激黃嘌呤氧化酶活性增強，如黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤等[9-11, 17]；② 尿酸酶抑制劑抑制尿酸酶活性，如氧嗪酸鉀等[18-19]；③ 減少尿酸排泄保持尿酸濃度在較高水平，如煙酸、乙胺丁醇等[20]；④ 基因篩選，構建同源重組胚胎干細胞，基因選擇性敲除尿酸酶基因建立動物模型[21]。
大鼠高尿酸血癥模型按照是否有合并癥及繼發性損傷，分為單純性和半繼發性損傷或合并癥的高尿酸血癥模型，其中單純性高尿酸血癥多以腺嘌呤、黃嘌呤等促進尿酸合成的方式進行造模，而半繼發性損傷或合并癥的高尿酸血癥模型多為以氧嗪酸鉀、氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤的方法造模，且采用聯合造模的方法使大鼠尿酸能夠穩定升高，這種方法更接近于人類尿酸性腎臟病變[22-23]。因此，本研究采用了尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀為基礎聯合尿酸前體物質腺嘌呤，以灌胃的方式來誘導大鼠高尿酸血癥動物模型，探索了氧嗪酸鉀的給藥劑量（1 000、1 500 mg/kg）和腺嘌呤的給藥劑量（0、50、100 mg/kg）。維持長期穩定的高尿酸水平及較高的存活率是高尿酸血癥模型的關鍵要素。本實驗的血清學指標結果顯示，造模 1 周后與正常組相比模型組動物的血尿酸水平均有顯著升高（P<0.05），并在持續灌胃的 5 周內血尿酸水平一直維持較高且較穩定的水平；除腺嘌呤高劑量組（氧嗪酸鉀1 500 mg/kg + 腺嘌呤 100 mg/kg 及氧嗪酸鉀1 000 mg/kg + 腺嘌呤 100 mg/kg）外，各組大鼠的存活率較高，均能達到 0.875 以上。
大鼠腎功能檢測、組織病理及炎癥、纖維化相關基因表達的結果顯示，在氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤誘導大鼠高尿酸血癥的模型中，各項指標與腺嘌呤的劑量及氧嗪酸鉀的劑量呈正相關。在氧嗪酸鉀劑量不變的情況下，隨著腺嘌呤的劑量增加，大鼠血肌酐、血尿素氮水平升高（P<0.05），腎組織病理顯示病變程度加重，炎癥、纖維化相關基因表達升高（P<0.05）。而在腺嘌呤劑量相同（50 mg/kg）的情況下，高劑量氧嗪酸鉀（1 500 mg/kg）與低劑量氧嗪酸鉀（1 000 mg/kg）誘導的腎功能指標、病理結果及炎癥、纖維化基因表達相比病變程度雖有加重，但相比于同一氧嗪酸鉀劑量下，不同劑量嘌呤組差異無統計學意義，且在造模后第 6 周，氧嗪酸鉀單獨誘導的 UA1、UA4 組病理組織學改變無顯著性變化，這一現象我們推測可能是由于第 5 周停止氧嗪酸鉀灌胃后小鼠自身尿酸分解代謝的能力有所恢復，而聯合了腺嘌呤的造模組在阻斷尿酸分解代謝的同時補充尿酸前體導致小鼠腎組織受損相比于氧嗪酸鉀組更為嚴重，這使得 UA2、UA3、UA5、UA6 組在第 6 周沒有聯合給藥的情況下，大鼠的尿酸代謝恢復能力受限。以上結果均提示在該模型中腺嘌呤對大鼠腎臟的損傷程度可能大于氧嗪酸鉀，但存在此差異的具體原因尚不清楚，有待進一步研究。基于腺嘌呤的損傷程度較大，并綜合大鼠生存率、尿酸水平、腎功能檢測、組織病理結果，在對于后面更深一步的大鼠腎組織炎癥因子表達的檢測中我們集中比較了 UA2 和 UA5 兩組間的差異，從而選出更為合適的造模劑量。
本研究結果顯示，氧嗪酸鉀（1 500 mg/kg）聯合腺嘌呤（50 mg/kg）連續灌胃大鼠 5 周能夠誘導穩定的高尿酸血癥，造模 6 周后病理結果顯示腎臟有炎性細胞的浸潤和膠原纖維的增加，腎組織 mRNA 水平和蛋白水平均證明了促炎因子和纖維化相關蛋白的存在，病理改變接近臨床高尿酸患者的特點。在這個造模劑量下，不僅可以較充分地抑制尿酸酶活性，而且可以同時促進尿酸的合成，保證尿酸水平的升高。由于氧嗪酸鉀和腺嘌呤都不易溶于水，我們選擇羧甲基纖維素鈉做懸浮劑，將充分研磨的氧嗪酸鉀和腺嘌呤混懸于 0.5% 的羧甲基纖維素鈉溶液中，以確保給藥劑量的準確。
使用該方法建立嚙齒類動物模型的操作較簡單，可在短期內升高尿酸水平，但由于動物體內尿酸酶存在活性的差異，在一定程度上造成了模型尿酸水平的差異，模型的腎損傷程度可能有差異。另外腺嘌呤對腎臟有一定損傷，利用本方法建立的高尿酸腎損傷模型除高尿酸的影響外也無法排除造模試劑對腎臟的影響。
尿酸是嘌呤代謝的終產物，高尿酸血癥是由于嘌呤代謝障礙使得尿酸生成增加和/或尿酸排泄減少所導致的一種代謝性疾病[1]。隨著生活水平的提高，人們攝入的食物結構發生了重大變化，蛋白質及脂肪的攝入顯著提高，高脂血癥和高尿酸血癥的發病率也明顯提高[2-4]。大量研究結果表明，血尿酸水平升高與腎臟相關疾病、動脈粥樣硬化及冠心病、原發性高血壓、腦卒中等疾病的發生率、死亡率等呈獨立正相關[5-6]。嚙齒類動物是高尿酸血癥研究中最常用的動物模型，但因嚙齒類動物具有尿酸酶、可將尿酸分解并排出體外，所以很難發生高尿酸血癥。嚙齒類動物高尿酸血癥模型建立主要從促進尿酸合成和抑制其排泄這兩方面考慮，方法眾多，但其誘導周期、腎損傷程度以及觀察指標差異較大。有數據顯示大鼠采用腺嘌呤聯合氧嗪酸鉀灌胃 21 d 可建立大鼠的高尿酸腎損傷模型，病理觀察可見炎性細胞浸潤、腎小管局灶性萎縮、高劑量下腎小管擴張、細胞間質纖維化嚴重[7]；酵母膏、氧嗪酸鉀、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、乙胺丁醇等造模劑單劑或組合制劑通過灌胃及腹腔注射等方式給藥，可誘導嚙齒類動物高尿酸腎損傷模型[8-11]。而給藥方式、使用的藥物及其劑量各異，不同種屬的嚙齒類動物對藥物的敏感性各不相同，導致造模周期不一致、動物腎臟損傷程度差異較大。本研究利用氧嗪酸鉀作為尿酸酶抑制劑，阻斷尿酸分解代謝，并同時補充尿酸前體物質腺嘌呤，以達到升高尿酸水平的目的；通過不同劑量氧嗪酸鉀和腺嘌呤的聯合誘導，探索和優化大鼠高尿酸血癥的造模劑量和造模時間，嘗試建立一種腎臟病理損傷接近人類發病特點的、較為穩定的高尿酸腎損傷動物模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
56 只成年雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重 220～240 g，購自四川大學實驗動物中心［實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2018-026］，在實驗開始以前，至少給予動物 1 周時間適應環境，實驗 SD 大鼠于室溫 20～25℃、70% 濕度條件下分籠飼養，12 h 明暗交替，自由采食和飲水［實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2018-119，動物實驗倫理備案號：2015070A］。
1.2 實驗試劑
氧嗪酸鉀（山東中科泰斗化學有限公司），純度≥97%；腺嘌呤（美國 Amerco 公司）；羧甲基纖維素鈉（成都科龍化工試劑廠）；兔抗鼠微管蛋白（Tubulin）抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；兔抗鼠 BAX 抗體（美國 CST 公司）；山羊抗鼠 E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）抗體（美國 BD 公司）；兔抗人 α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（美國 Abcam 公司）；山羊抗小鼠纖維連接蛋白（fibronectin，FN）抗體（美國 Proteintech 公司）；山羊抗鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（美國 CST 公司）；兔抗人血管細胞黏附分子 1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）抗體（美國 CST 公司）；辣根過氧化物（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔二抗（美國 life technology-Thermo Fisher Scientific 公司）；HRP 標記兔抗小鼠二抗（美國 life technology-Thermo Fisher Scientific 公司）。
1.3 儀器
生化自動分析儀（美國 Roche 公司，COBAS 400 Plus）；倒置相差顯微鏡（日本 Olympus 公司，IX50）；分光光度計（美國 Thermo Scientific 公司，NanoDrop 2000）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（美國 Bio-Rad 公司，CFX 96）；電泳儀（美國 Bio-Rad 公司，WideMini-subcell GTSystem）；成像儀（法國 FUSION 公司，FX7）。
1.4 實驗方法
1.4.1 SD 大鼠空腹血生化水平檢測
實驗開始前對所有大鼠進行空腹血清尿酸值測定，選取空腹血清尿酸值在 60～80 μmol/L 的大鼠作為實驗對象。此后每周用靜脈留置針穿刺尾靜脈取大鼠血樣 0.5 mL 于 EP 管中，常溫靜置 0.5 h 后，1 000×g離心 10 min，取上清液，用羅氏生化自動分析儀檢測血尿酸、血肌酐、血尿素氮。
1.4.2 誘導 SD 大鼠高尿酸血癥模型
用 0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液懸浮不同濃度的氧嗪酸鉀與腺嘌呤聯合造模分為 7 組，其中正常對照組標記為 NC，不同的模型組分別標記為 UA1~UA6（表 1），每組 8 只大鼠；灌胃 1 次/d，連續 5 周，5 周后停止造模，正常飼養 1 周。對大鼠每日稱重，并按照 1 mL/100 g 體重的劑量進行灌胃。
表1
氧嗪酸鉀與腺嘌呤聯合造模劑量及分組情況
1.4.3 SD 大鼠組織樣本的收集與檢測
第 6 周各組大鼠用 7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g 體重）腹腔注射麻醉，保定后備皮消毒，打開腹腔及胸腔，暴露心臟，穿刺右心室采血 1 mL 用于血生化檢測，快速剪取雙腎至手術盤，去除腎被膜、稱重，計算腎臟指數（腎重/體重），觀察腎臟的病理改變。取一個腎的 1/4 放入組織包埋盒用 10% 中性甲醛浸泡 48 h 后，用于腎組織病理蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）及 Masson 染色。按照 2010 年國際腎臟病理學會提出的慢性腎病分型國際標準[12]，綜合 HE 及 Masson 染色結果進行評分。另取腎組織的各 1/4 凍存于液氮中，且本研究根據各組動物的腎臟組織學病變程度，選擇動物存活率較高、腎組織相對病變較輕（慢性進行性腎病一級）的 UA2 與 UA5 組動物的腎臟組織分別用于腎組織炎癥、纖維化相關因子的基因表達差異分析及其蛋白表達水平分析，以確定后續研究動物造模采用的方案。
1.4.4 組織炎癥、纖維化相關基因表達：逆轉錄PCR
Trizol 法提取總 RNA 后，用核酸蛋白定量儀檢測濃度及純度，取 1 μg RNA 溶液按照 Vazyme HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 試劑盒說明書逆轉錄成互補 DNA 溶液。以 GAPDH 為內參，通過上海生工設計并合成相應上下游引物（表 2），按照 Vazyme AceQTM qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒說明書，用 20 μL 體系在實時熒光定量 PCR 擴增儀上進行反應，反應條件為 95℃ 3 min，40 個循環（95℃ 10 s，60℃ 30 s），溶解曲線 95℃ 15 s，65～95℃ 每上升 0.5℃ 為一個梯度使用 Bio-Rad CFX96 熒光定量 PCR 儀進行熒光檢測，通過 2?ΔΔCT法計算各組腎組織炎癥、纖維化相關因子的基因表達差異。
表2
PCR 引物序列
1.4.5 組織炎癥和纖維化相關蛋白表達檢測：蛋白免疫印跡
用放射免疫沉淀法裂解液（中國北京康為世紀生物科技有限公司）裂解 SD 大鼠腎組織得到總蛋白后，蛋白質定量聚氰基丙烯酸正丁酯法檢測蛋白含量并煮沸變性，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，封閉后 4℃ 一抗 Tubulin、BAX、E-cad、α-SMA、FN、TNF-α、VCAM-1 孵育過夜，清洗后 37℃ 孵育二抗 2 h，通過增強化學發光法用成像儀采集圖像，并使用 Image J 軟件進行灰度分析。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，分析前采用Z值轉換剔除極端異常值。分類變量以例數表示。連續變量采用 Kolmogorov-Smirnov 和 Shapiro-Wilk 檢驗其正態性，正態分布資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用 Tukey 法進行兩兩比較，方差不齊時采用 Tamhane’s T2 檢驗進行分析。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠生存狀況及血尿酸水平檢測
在飼養過程中發現，模型組大鼠相比 NC 組狀態較差，表現為體型消瘦，毛色無光澤。高劑量腺嘌呤組大鼠在造模 2 周后開始出現少量死亡。各組大鼠的生存狀況見圖 1a。造模 2 周時各組 8 只大鼠均存活，到造模第 5 周時，NC 組、UA1 組、UA4 組無大鼠死亡，其生存率為 1.0。UA2 組在第 23 天死亡 1 只，UA5 組在第 25 天死亡1 只，故其生存率為 0.875。UA3 組在第 14、17 天分別死亡 1 只，其生存率為 0.75。UA6 組，在第 23、25、28 天分別死亡 1 只，其生存率為 0.625。
圖1
造模大鼠生存曲線及血尿酸水平的變化
a. 生存曲線；b. 造模后 NC、UA1、UA2、UA3 組血尿酸水平變化；c. 造模后 NC、UA4、UA5、UA6 組血尿酸水平變化
1 000 mg/kg 氧嗪酸鉀與不同劑量腺嘌呤聯合誘導的大鼠血尿酸水平變化及 1 500 mg/kg 氧嗪酸鉀與不同劑量腺嘌呤聯合誘導的大鼠血尿酸水平變化見圖 1b、1c。通過統計分析發現，造模 1 周后，大鼠血尿酸水平升高，1 ~ 5 周內造模各組尿酸水平隨時間增加而升高，且不同劑量組的尿酸水平隨時間變化各有不同，具有統計學意義（P<0.05）。在停止造模后，第 6 周尿酸基本恢復到造模前水平。
2.2 大鼠腎功能變化
造模第 5 周，模型組大鼠的血肌酐、血尿素氮水平均較正常組有所升高，其中聯合腺嘌呤 100 mg/kg 組（UA3、UA6）升高較為明顯；同劑量氧嗪酸鉀與腺嘌呤聯合造模后，隨腺嘌呤劑量增加，大鼠腎臟指數升高。與 NC 組相比，UA3、UA5 和 UA6 組腎臟指數升高，且差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
造模第 5 周各組大鼠腎功能及腎臟指數的變化（）
表4
造模第 6 周大鼠腎病病理評分
2.3 造模大鼠腎臟解剖和組織學檢測
第 6 周解剖觀察發現，與正常對照組相比，1 000 mg/kg 氧嗪酸鉀組腎臟外觀和剖面無明顯異常；聯合 50 mg/kg 腺嘌呤處理之后，腎臟髓質變白；聯合 100 mg/kg 腺嘌呤處理之后，腎臟外觀可見白色顆粒，髓質與皮質間有明顯的白色沉積物；1 500 mg/kg 氧嗪酸鉀和聯合腺嘌呤誘導的各組腎臟外觀和剖面的改變更加明顯（圖 2）。
圖2
造模第 6 周各組大鼠腎臟外觀及剖面的改變
大鼠腎 HE 染色觀察發現：UA1 組處理之后，腎小管出現管型；UA2 組腎小球萎縮，腎小管內刷狀緣減少，管腔擴大；UA3 組腎小管間質中炎性細胞大量聚集并且小管間質纖維化；UA5 組處理大鼠之后，腎小管細胞增生、纖維細胞增多、炎性細胞大量聚集，部分腎小管上皮細胞壞死（圖 3）。
圖3
造模第 6 周各組大鼠腎組織 HE 染色（HE ×400）
Masson 染色觀察發現：添加腺嘌呤的 4 個組（UA2、UA3、UA5、UA6）較 NC 組腎臟膠原纖維的表達明顯升高，且 UA3 及 UA6 的細胞間質纖維化程度最高，UA2、UA5 次之（圖 4）。根據慢性腎病分型國際標準評分，從各組小管間質及血管病理評分中（表 4）可以看出，氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤處理后相比于正常組有顯著的病理改變（P<0.05），其中評分 UA2（4.00±1.60）、UA5（5.00±1.85）為慢性進行性腎病 1 級，大鼠存活率較高、腎組織相對病變較輕。
圖4
造模第 6 周大鼠腎組織 Masson 染色（Masson ×400）
2.4 大鼠腎組織炎癥因子表達的檢測
1 000 mg/kg 氧嗪酸鉀添加不同劑量腺嘌呤造模，隨腺嘌呤劑量，增加大鼠腎組織炎癥和纖維化相關基因的 mRNA 水平升高（表 5）。選定 50 mg/kg 腺嘌呤添加不同劑量氧嗪酸鉀造模，隨氧嗪酸鉀劑量的增加大鼠腎組織纖維化相關基因 FN、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的 mRNA 水平升高，FN、TGF-β 基因表達水平 UA5 組均顯著高于 NC 組（P<0.05），UA2、UA5 組炎癥相關基因 IL-1β 相比于 NC 組無統計學意義（P>0.05），而兩組的 TNF-α 表達均顯著高于 NC 組（P<0.05）。見表 5。
表5
造模第 6 周大鼠腎組織炎癥及纖維化相關基因的 mRNA 表達水平檢測結果（）
表6
蛋白質印跡法檢測造模第 6 周大鼠腎組織蛋白表達半定量分析（）
50 mg/kg 腺嘌呤添加不同劑量氧嗪酸鉀（1 000、1 500 mg/kg）造模大鼠腎組織蛋白質印跡法檢測結果顯示，氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤組相比于 NC 組，VCAM-1、TNF-α、FN、α-SMA、BAX 的表達水平差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、表 6。
圖5
造模第 6 周大鼠腎組織炎癥及纖維化相關蛋白表達的變化
3 討論
高尿酸血癥對腎臟的損傷機制主要是由尿酸結晶引起的梗阻及局部炎癥反應，目前臨床治療方案是采用化學合成降尿酸藥物來降低尿酸水平，但患者易發生不良反應[13-15]。諸多研究者為尋求新的治療藥物以減少不良反應的發生，便希望首先在動物模型上觀察其藥物療效及作用，而嚙齒類動物是藥物研究中最常用的動物模型[16]。因此，建立一種類似人類高尿酸所致腎損傷的發病特點、且較為穩定的高尿酸腎損傷動物模型至關重要。
然而，由于嚙齒類動物體內具有尿酸酶，能將尿酸氧化成尿囊素排出體外，導致其血尿酸水平非常低，這一直是誘導嚙齒類動物建立高尿酸血癥模型的難點所在。目前常用的手段是從促進尿酸合成及抑制尿酸排泄這兩方面來建立高尿酸嚙齒類動物模型：① 促進尿酸的合成：尿酸前體物質增多可刺激黃嘌呤氧化酶活性增強，如黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤等[9-11, 17]；② 尿酸酶抑制劑抑制尿酸酶活性，如氧嗪酸鉀等[18-19]；③ 減少尿酸排泄保持尿酸濃度在較高水平，如煙酸、乙胺丁醇等[20]；④ 基因篩選，構建同源重組胚胎干細胞，基因選擇性敲除尿酸酶基因建立動物模型[21]。
大鼠高尿酸血癥模型按照是否有合并癥及繼發性損傷，分為單純性和半繼發性損傷或合并癥的高尿酸血癥模型，其中單純性高尿酸血癥多以腺嘌呤、黃嘌呤等促進尿酸合成的方式進行造模，而半繼發性損傷或合并癥的高尿酸血癥模型多為以氧嗪酸鉀、氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤的方法造模，且采用聯合造模的方法使大鼠尿酸能夠穩定升高，這種方法更接近于人類尿酸性腎臟病變[22-23]。因此，本研究采用了尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀為基礎聯合尿酸前體物質腺嘌呤，以灌胃的方式來誘導大鼠高尿酸血癥動物模型，探索了氧嗪酸鉀的給藥劑量（1 000、1 500 mg/kg）和腺嘌呤的給藥劑量（0、50、100 mg/kg）。維持長期穩定的高尿酸水平及較高的存活率是高尿酸血癥模型的關鍵要素。本實驗的血清學指標結果顯示，造模 1 周后與正常組相比模型組動物的血尿酸水平均有顯著升高（P<0.05），并在持續灌胃的 5 周內血尿酸水平一直維持較高且較穩定的水平；除腺嘌呤高劑量組（氧嗪酸鉀1 500 mg/kg + 腺嘌呤 100 mg/kg 及氧嗪酸鉀1 000 mg/kg + 腺嘌呤 100 mg/kg）外，各組大鼠的存活率較高，均能達到 0.875 以上。
大鼠腎功能檢測、組織病理及炎癥、纖維化相關基因表達的結果顯示，在氧嗪酸鉀聯合腺嘌呤誘導大鼠高尿酸血癥的模型中，各項指標與腺嘌呤的劑量及氧嗪酸鉀的劑量呈正相關。在氧嗪酸鉀劑量不變的情況下，隨著腺嘌呤的劑量增加，大鼠血肌酐、血尿素氮水平升高（P<0.05），腎組織病理顯示病變程度加重，炎癥、纖維化相關基因表達升高（P<0.05）。而在腺嘌呤劑量相同（50 mg/kg）的情況下，高劑量氧嗪酸鉀（1 500 mg/kg）與低劑量氧嗪酸鉀（1 000 mg/kg）誘導的腎功能指標、病理結果及炎癥、纖維化基因表達相比病變程度雖有加重，但相比于同一氧嗪酸鉀劑量下，不同劑量嘌呤組差異無統計學意義，且在造模后第 6 周，氧嗪酸鉀單獨誘導的 UA1、UA4 組病理組織學改變無顯著性變化，這一現象我們推測可能是由于第 5 周停止氧嗪酸鉀灌胃后小鼠自身尿酸分解代謝的能力有所恢復，而聯合了腺嘌呤的造模組在阻斷尿酸分解代謝的同時補充尿酸前體導致小鼠腎組織受損相比于氧嗪酸鉀組更為嚴重，這使得 UA2、UA3、UA5、UA6 組在第 6 周沒有聯合給藥的情況下，大鼠的尿酸代謝恢復能力受限。以上結果均提示在該模型中腺嘌呤對大鼠腎臟的損傷程度可能大于氧嗪酸鉀，但存在此差異的具體原因尚不清楚，有待進一步研究。基于腺嘌呤的損傷程度較大，并綜合大鼠生存率、尿酸水平、腎功能檢測、組織病理結果，在對于后面更深一步的大鼠腎組織炎癥因子表達的檢測中我們集中比較了 UA2 和 UA5 兩組間的差異，從而選出更為合適的造模劑量。
本研究結果顯示，氧嗪酸鉀（1 500 mg/kg）聯合腺嘌呤（50 mg/kg）連續灌胃大鼠 5 周能夠誘導穩定的高尿酸血癥，造模 6 周后病理結果顯示腎臟有炎性細胞的浸潤和膠原纖維的增加，腎組織 mRNA 水平和蛋白水平均證明了促炎因子和纖維化相關蛋白的存在，病理改變接近臨床高尿酸患者的特點。在這個造模劑量下，不僅可以較充分地抑制尿酸酶活性，而且可以同時促進尿酸的合成，保證尿酸水平的升高。由于氧嗪酸鉀和腺嘌呤都不易溶于水，我們選擇羧甲基纖維素鈉做懸浮劑，將充分研磨的氧嗪酸鉀和腺嘌呤混懸于 0.5% 的羧甲基纖維素鈉溶液中，以確保給藥劑量的準確。
使用該方法建立嚙齒類動物模型的操作較簡單，可在短期內升高尿酸水平，但由于動物體內尿酸酶存在活性的差異，在一定程度上造成了模型尿酸水平的差異，模型的腎損傷程度可能有差異。另外腺嘌呤對腎臟有一定損傷，利用本方法建立的高尿酸腎損傷模型除高尿酸的影響外也無法排除造模試劑對腎臟的影響。
