引用本文： 龔盈盈, 謝玲, 朱圣明, 吳峰, 段奇文, 鄧鑫州, 柯青, 駱志國. 丁香提取物對放射抗拒食管癌細胞的體外抗腫瘤作用及機制研究. 華西醫學, 2021, 36(1): 66-75. doi: 10.7507/1002-0179.202001193 復制
盡管傳統的手術、放射治療（放療）、化學治療手段不斷改進，新興治療方法也異軍突起，但總體上講，包括食管癌在內的多數惡性腫瘤的治療療效仍難以令人滿意[1]。世界上植物資源非常豐富，研究表明，一些植物香料的提取成分具有低毒高效的抗腫瘤作用，其與現代腫瘤治療手段的聯合也極具研究價值[2]。丁香為桃金娘科浦桃屬植物，產于坦桑尼亞、印度尼西亞等熱帶地區，其花蕾、根、葉作為香料成為很多亞洲國家廚房常用的香料。大量研究顯示，丁香具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、鎮痛等多種功能[3]。有文獻報道，丁香的活性成分對肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌和宮頸癌等腫瘤細胞具有抑制作用[4-5]。我們前期的研究結果也表明，丁香油及丁香乙醇粗提物均對直腸癌細胞 HCT116 具有明顯的殺傷作用，且與熱療聯合，抗腫瘤療效明顯增加[6]。然而，放射生物學研究顯示，放射抗拒細胞具有更惡的細胞生物學行為，如具有更強的抗凋亡能力和遷徙轉移能力[7]。放射抗拒細胞是臨床放療后復發及遠處轉移的主要原因和根源，是臨床研究者亟待克服的難題。丁香提取物（clove extract，CE）能否針對放射抗拒細胞發揮抗腫瘤作用，目前國內外尚無相關研究報道。本研究將課題組前期構建成功的食管癌放射抗拒細胞系 KYSER 作為研究模型，制備 CE 并分析其抗腫瘤的活性成分，探討不同濃度 CE 對放射抗拒食管癌細胞能量代謝、增殖、凋亡、遷徙轉移、克隆形成能力和細胞周期的影響，以期為臨床克服腫瘤放療抗拒提供低毒高效、易得的新手段。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗細胞
人食管鱗狀細胞癌放射抗拒細胞系 KYSER 由湖北醫藥學院沈力教授通過親代細胞 KYSE 間歇輻射誘導、壓力培養構建成功，贈予本研究室保存，其放射抗拒性特性已通過 2 Gy 光子線照射后的生成分數予以鑒定和證實。
1.1.2 主要試劑
Dulbecco 改良 Eagle 培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）細胞基礎培養基、胎牛血清及胰蛋白酶購于美國 Gibco 公司。噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購于美國 Sigma 公司。丁香酚標準品購于天根生化科技（北京）有限公司。丁香干燥花蕾和丁香油由美國明尼蘇達大學荷美爾研究所 Joshua Liao 教授贈送。Transwell-24 遷徙檢測試劑盒購于中國 Corning 公司。流式細胞術細胞凋亡檢測試劑盒購買于愛必信（上海）生物科技有限公司。細胞周期分析試劑盒購買于中國南京凱基生物科技發展有限公司。
1.1.3 主要儀器
超凈工作臺購于美國 Thermo 公司。倒置相差顯微鏡購于日本 Nikon 公司。流式細胞儀購于美國 BD 公司。Agilent7890B-5977A 氣相色譜-質譜儀購于佛山市捷特精密儀器有限公司。恒溫培養箱購于日本三洋公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
KYSER 采用含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基培養，并置于 37℃、5% 二氧化碳的恒溫培養箱中。
1.2.2 CE 的制備
按 1 g 干燥丁香花蕾∶5 mL 95% 乙醇的比例，將 10 g 丁香花蕾加入 50 mL 95% 乙醇中，室溫放置 2 周，0.22 μm 微孔濾膜過濾器過濾除去雜質，作為工作液保存于 –20℃ 低溫冰箱。采用 DMEM 培養基或生理鹽水將 CE 稀釋成不同濃度，用于以下實驗研究。
1.2.3 CE 的成分鑒定
以丁香酚標準品為標準對照，丁香油為平行對照，采用氣相色譜法鑒定 CE 的主要成分，主要步驟如下：① 10% 甲醇-乙酸乙酯溶液分別將丁香酚標準品稀釋 1×106倍，丁香油及 CE 稀釋 1×102倍，稀釋液用于上機檢測。② Agilent7890B-5977A 氣相色譜-質譜儀分別檢測丁香酚標準品、CE 及丁香油的主要成分，檢測時長 30 min。③ 檢測參數：分流進樣口；色譜柱類型：HP-5 MS；色譜柱尺寸（長×內徑×膜厚）：30 m×0.25 mm×0.25 μm；柱溫：100℃，10℃/min 到 260℃，保持 5 min；離子源溫度： 280℃；傳輸線（Transfer line）溫度：280℃；掃描方式：SCAN；載氣類型及流速：氦氣，恒流模式，流速 1.0 mL/min；進樣模式：splitless；進樣口溫度：250℃；進樣體積：1 μL。
1.2.4 不同濃度 CE 對細胞的生長影響
配制含有 0.2%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8% CE 和 0.5% 乙醇的 DMEM 培養基。取等量對數生長期 KYSER 細胞接種至 6 孔培養板，過夜貼壁培養后，分別用上述濃度培養基處理細胞 24 h，顯微鏡下觀察細胞生長密度、生長狀態。
1.2.5 MTT 法檢測 CE 對細胞存活的影響及影響方式
配制含有 0.4%、0.5%、0.6% CE 和 0.5% 乙醇的 DMEM 培養基。取對數生長期 KYSER 細胞，按 1×104/孔接種細胞于 96 孔培養板，過夜培養后，棄盡原培養基，分別加入等量上述濃度培養基，每個濃度設 10 個復孔。繼續培養細胞至 24、48、72、96 h，每孔加入 20 μL MTT 溶液，37℃ 孵育 4 h，棄盡孔內液體，每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，37℃ 避光孵育 20 min，酶標儀檢測 490 nm 處各孔的吸光度值（A值），檢測重復 3 次，計算細胞存活率。細胞存活率=A實驗/A對照×100%。
1.2.6 CE 對腫瘤細胞微觀結構的影響
取對數生長期 KYSER 細胞，接種于 10 cm 培養皿過夜，分別更換為含 0.5% CE 和 0.5% 乙醇的培養基，處理細胞 24 h，胰蛋白酶消化細胞，帶培養液一起低速離心細胞，使細胞沉淀成團，棄培養液，緩慢加入電子顯微鏡（電鏡）固定液（1.5%～2.5% 中性戊二醛），4℃ 下固定 30 min。樣本送上海育儀分析測試中心分析細胞器微觀結構變化，每組細胞送 3 個復檢樣本。
1.2.7 CE 對腫瘤細胞遷徙能力的影響
取常規培養的對數生長期 KYSER 細胞，設置 3 個處理組：對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組。細胞置于培養箱中經藥物作用 24 h 后，用于 Transwell 遷徙實驗。主要步驟：① 在上層小室中加入 300 μL 無血清的培養基，于培養箱中孵育 2 h，加細胞前將培養基吸出；② 制備單細胞懸液，計數活細胞，取 2×104個細胞加入 300 μL 含有 1% 胎牛血清的培養基中，再加入遷徙小室的上層小室；③ 取 500 μL 含 10% 胎牛血清的培養基加入遷徙小室的下層小室；④ 將遷徙小室置于 37℃ 5% 二氧化碳培養箱中培養過夜；⑤ 取出小室，室溫下，用 4% 多聚甲醛固定小室底部聚碳酸酯微孔膜上的細胞 30 min；⑥ 棉簽輕輕擦去上層小室未跨膜的細胞，將膜上細胞浸入 0.5% 的結晶紫染色 10 min；⑦ 用水輕柔清洗小室，在 200 倍顯微鏡下計數每個小室上、下、左、右、中 5 個視野中遷徙至聚碳酸酯微孔膜下表面的細胞數，計算每個視野下的平均細胞數，實驗重復 3 次，進行組間比較。
1.2.8 流式細胞術定量檢測 CE 誘導的細胞凋亡率
配制含有 0.4%、0.5%、0.6% CE 和 0.5% 乙醇的 DMEM 培養基。在培養箱中處理 6 孔板中對數生長期 KYSER 細胞 24 h，用冷磷酸鹽緩沖液輕柔清洗細胞 2 次，消化并離心收集細胞，每支細胞中加入 300 μL 1×結合緩沖液（Binding Buffer）和 5 μL 膜聯蛋白-Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），室溫下避光孵育 15 min。上機檢測前 5 min，每支細胞中再加入 5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液并補充 200 μL 1×Binding Buffer。流式細胞儀檢測細胞早期、晚期凋亡的比例，實驗重復 3 次，計算平均凋亡率。
1.2.9 流式細胞術測定 CE 對細胞周期分布的影響
取培養皿中對數生長期 KYSER 細胞，磷酸緩沖液清洗 2 次，徹底去除培養基中的血清，換成無血清培養基饑餓細胞 24 h，再全部更換成 10% 血清的培養基，按對照組（含 0.5% 乙醇）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組處理細胞 24 h，消化并收集細胞，70% 冷乙醇過夜固定細胞。冷磷酸緩沖液清洗、吹打細胞，制備成單細胞懸液。離心、收集細胞沉淀。向細胞中加入 500 μL PI/RNA 酶染色工作液（RNA 酶∶PI=1∶9），室溫避光孵育 1 h。流式細胞儀于激發波長 488 nm 處記錄細胞周期分布，實驗重復 3 次，求取平均細胞周期分布比例。
1.2.10 CE 對腫瘤細胞克隆形成能力的影響
取對數生長期 KYSER 細胞，按 2 000 個細胞/孔，接種至 6 孔板，分別按對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組 3 種方式處理細胞 24 h 后，終止 CE 處理，更換無藥物的新鮮培養基，繼續培養細胞 7 d，直至肉眼可見克隆形成。甲醇乙酸細胞固定液室溫下固定克隆 30 min，結晶紫染色液染色克隆，磷酸鹽緩沖液清洗克隆。計數克隆數目，設定大于 50 個細胞為 1 個克隆，每孔重復計數 3 遍，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 13.0 軟件對數據進行統計學分析。定量數據均采用均數±標準差表示。多組間采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05（雙側）。組間兩兩比較采用t檢驗，并校正檢驗水準，其中 3 組間兩兩比較檢驗水準α'=0.017，4 組間兩兩比較檢驗水準α''=0.008。
2 結果
2.1 CE 的成分鑒定
氣相色譜法分析結果顯示（圖 1）：丁香酚標準品、CE 和丁香油中的主要成分峰濃度出現時間分別為（7.852±0.045）、（7.867±0.028）、（7.949±0.037）min，3 組間對比，差異無統計學意義（P>0.05）。經數據庫（MassHunter\Library\NIST14.L）分析比對顯示：CE 中主要成分是丁香酚，次要成分是丁香油烴和乙酸丁香酚脂；丁香油中主要成分是丁香酚，次要成分是乙酸丁香酚脂、丁香油烴和氧化丁香油烴。根據峰面積比值，丁香酚在丁香油和 CE 中的相對含量分別為 31.3% 和 2.3%。
圖1
氣相質譜法分析丁香乙醇提取物和丁香油中成分
a. 空對照；b. 丁香乙醇提取物；c. 丁香酚標準品；d. 丁香油。A、C：雜峰；B、E、H：丁香酚；D、G：丁香油烴；F、J：乙酸丁香酚脂；I：氧化丁香油烴
2.2 不同濃度 CE 對細胞的生長影響
不同濃度 CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后，光學顯微鏡（光鏡）下觀察到：≥0.4% 濃度的 CE 即可對腫瘤細胞的增殖和生長狀態產生影響，當 CE 濃度達到 0.8% 時，KYSER 細胞幾乎不能存活（圖 2）。
圖2
不同濃度 CE 及 0.5% 乙醇處理 KYSER 細胞 24 h 后光鏡所見（×40）
a. 對照組（0.5% 乙醇處理）；b. 0.2% CE 處理組；c. 0.4% CE 處理組；d. 0.5% CE 處理組；e. 0.6% CE 處理組；f. 0.8% CE 處理組
2.3 MTT 法檢測不同濃度 CE 對細胞存活的影響及方式
不同濃度 CE 處理 KYSER 細胞 24、48、72、96 h，MTT 細胞存活曲線顯示：KYSER 的存活率均隨著藥物濃度的增大而明顯降低，組間對比，差異有統計學意義（P<0.05），顯示出明顯的濃度依賴性；細胞的存活率隨著處理時間的延長而表現為輕度降低，僅顯示出藥物作用的輕度時間依賴趨勢，組間對比，差異無統計學意義（P>0.05），見圖 3。
圖3
CE 對 KYSER 細胞存活抑制的劑量依賴方式
對照組為 0.5% 乙醇處理組
2.4 CE 處理后 KYSER 細胞器微觀結構的變化
與對照組（0.5% 乙醇處理）相比，0.5% CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后，KYSER 細胞的微絨毛變短、變少，細胞質內核糖體顯著減少，線粒體明顯溶解、減少，失去正常結構，細胞質內可見大量典型的自噬小體（圖 4）。
圖4
電鏡下 KYSER 細胞微觀結構變化
a、b. 對照組（0.5% 乙醇處理）；c、d. 0.5% CE 處理組。黃矩形：微絨毛；藍矩形：核糖體；綠箭：線粒體；紅箭：自噬小體
2.5 CE 處理后細胞遷徙能力的變化
Transwell 跨膜遷徙實驗顯示：0.5% CE 和 0.6% CE 處理 KYSER 24 h 后，與對照組（遷徙率設為 100%）相比，細胞的相對遷徙率分別只有對照組的（65±4）% 和（41±3）%，分別與對照組比較，差異有統計學意義（P均<0.001），見圖 5。
圖5
CE 對 KYSER 細胞遷徙能力的影響（結晶紫染色 ×40）
a. 對照組（0.5% 乙醇處理）；b. 0.5% CE 處理組；c. 0.6% CE 處理組
2.6 流式細胞術定量檢測 CE 誘導的細胞凋亡率
CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后，流式細胞術顯示：對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組 KYSER 細胞的平均總凋亡率分別為（5.63±0.50）%、（11.77±0.42）% 和（19.44±0.19）%，處理組分別與對照組比，差異有統計學意義（P均<0.001），見圖 6。
圖6
流式細胞術分析 CE 處理后 KYSER 24 h 后細胞凋亡率
a. 對照組（0.5% 乙醇處理）流式散點圖；b. 0.5% CE 處理組流式散點圖；c. 0.6% CE 處理組流式散點圖；d. 各組細胞凋亡率直條圖，* 與對照組比較，
2.7 流式細胞術測定 CE 對細胞周期分布的影響
CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后，流式細胞術檢測顯示：血清饑餓組、對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組 KYSER 細胞的 G1 期比例分別為（82.39±1.50）%、（61.99±1.20）%、（75.38±1.50）% 和（78.81±1.10）%，0.5% CE 組和 0.6%CE 組分別與對照組比，差異均有統計學意義（P均<0.001）。見圖 7。
圖7
流式細胞術檢測 CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后細胞周期分布
a. 血清饑餓組流式直方圖；b. 對照組（0.5% 乙醇處理）流式直方圖；c. 0.5% CE 處理組流式直方圖；d. 0.6% CE 處理組流式直方圖；e. 各組細胞周期分布直條圖
2.8 CE 對腫瘤細胞克隆形成能力的影響
克隆形成實驗結果顯示：對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組細胞克隆形成率分別為（80.5±1.0）%、（18.1±0.8）% 和（5.0±0.5）%，0.5% CE 組和 0.6% CE 組分別與對照組相比，差異均有統計學意義（P均<0.001）。200 倍鏡下觀察，與對照組比，CE 處理組克隆大小明顯減小，克隆也失去了正常的三維立體生長特性（圖 8）。
圖8
CE 處理 KYSER 細胞 24 h 克隆形成實驗
a～c. 分別為對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組肉眼觀察克隆數目；d～f. 分別為對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組光鏡下觀察克隆大小（結晶紫染色 ×200）
3 討論
實體瘤中存在的放射抗拒細胞是放療后腫瘤復發的種子和根源[8]。一直以來，腫瘤放療領域的基礎和臨床研究者不斷尋求著能夠根除放射抗拒性細胞的有效方法，但大多收效不佳。近年來，植物提取物因其高效低毒的抗腫瘤作用，日益受到重視。文獻報道，香料丁香無論在腫瘤的預防方面，還是在腫瘤的治療方面都具有很好的潛力[9]。本課題組在前期研究中證實了丁香油對大腸癌細胞的良好殺傷作用[6]。然而，對于臨床治療較為棘手的放射抗拒細胞，CE 能否同樣發揮抗腫瘤作用，目前尚無相關研究來回答。
本實驗將前期構建成功的放射抗拒性食管癌細胞系 KYSER 作為研究模型。藥物體外作用研究結果顯示：0.4% CE 作用細胞 24 h 即可對腫瘤細胞的存活和生長狀態產生影響，當 CE 濃度達到 0.8% 時，KYSER 細胞基本不能存活，這提示 CE 活性成分可能具有高效殺傷 KYSER 細胞的作用。MTT 增殖實驗也顯示：CE 對 KYSER 存活的抑制作用呈現明顯的濃度依賴性。在類似的研究中，Arunava 等[10]利用蒸餾和萃取法從丁香粉末中提取丁香酚，體外增殖實驗顯示，丁香酚對宮頸癌細胞的增殖抑制具有明顯濃度和時間依賴性。此外，抗腫瘤藥物開發的前提是高效，更需低毒，即不能對人體正常器官產生嚴重毒性。Vijayasteltar 等[11]系統研究了丁香的毒理學特性和安全性，結果并未發現對小鼠有明顯的毒性和致畸性，這從科學層面很好地解釋了丁香成為亞洲人廚房常用香料的原因，這也為開發 CE 抗腫瘤奠定了基礎和前提。
目前已有的文獻表明，CE 抗腫瘤的活性與其提取方式有明顯的關系。Dwivedi 等[12]研究發現丁香的水、乙醇、油提取物抗腫瘤活性差異明顯，油提取物最佳，水提取物最差。Elsyana 等[13]發現丁香的 N-己烷萃取物抗腫瘤活性強于乙醇提取物。我們前期的研究中，一定濃度的丁香油能在 2 h 內殺傷直腸癌細胞 HCT116，而等量等濃度的丁香乙醇提取物不能。本研究通過氣相色譜法檢測到丁香油和丁香乙醇提取物中主要組分均為丁香酚，但前者丁香酚含量達后者 15 倍，這說明不同提取方式，其成分含量差異巨大。Ryu 等[14]分析了丁香乙酸乙酯提取物中有 19 種成分，均不同程度地具有殺傷卵巢癌細胞的作用。因此，正如大多數中草藥研究所面臨的問題一樣，丁香作為一種具有復合成分的植物香料，其最強的抗腫瘤活性成分及最佳的提取方式，都需進一步明確和研究，這對利用現代工藝開發抗腫瘤藥物具有重要意義。
誘導凋亡和細胞周期阻滯是多數藥物或化合物抗腫瘤的常見機制。在本研究中，0.5% 和 0.6% 的 CE 處理 KYSER 后，凋亡率分別為 11.77% 和 19.44%，均高于對照組的 5.63%。研究顯示，很多藥物通過干擾或者破壞腫瘤細胞的能量合成代謝途徑，促使腫瘤細胞走向凋亡。誘導自噬是很多藥物抗腫瘤的主要機制之一。本研究中透射電鏡觀察到，腫瘤細胞經 CE 處理后，細胞質內可見大量典型的自噬小體，Li 等[15]也觀察到類似現象，并進一步發現 AMP 活化蛋白激酶/Unc-51 樣激酶通路在其中發揮重要作用。Liu 等[16]報道了磷脂酰肌醇 3 激酶/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路介導細胞自噬，并最終誘導腫瘤細胞凋亡。本研究還發現，CE 處理細胞后，腫瘤細胞細胞質的核糖小體明顯減少。核糖體是細胞蛋白和 RNA 的復合體，核糖小體的減少提示腫瘤細胞的蛋白合成明顯受抑。另外，線粒體是真核細胞能量代謝的主要場所，本研究觀察到，腫瘤細胞經過 CE 作用，細胞質內線粒體明顯溶解、減少、失去正常結構。Liang 等[17]發現，丁香酚誘導膠質母細胞瘤細胞的凋亡，是通過增加細胞能氧自由基片段，誘導線粒體膜電位的變化，進而激活線粒體凋亡通路。Júnior 等[18]報道了丁香酚誘導黑色素瘤細胞線粒體斷裂和畸變，這與本研究中觀察到的線粒體溶解現象是一致的。此外，誘導細胞周期阻滯也是諸多抗腫瘤藥物的重要機制。Ma 等[19]報道，丁香酚誘導人表皮生長因子受體-2 陽性乳腺癌癌前病變 MCF-7AT 細胞 S 期阻滯，而對于人表皮生長因子受體-2 陰性癌前病變細胞無此類效應。Kubatka 等[20]在乳腺癌細胞中也檢測到 S 期阻滯。而本研究中，我們檢測到 CE 處理食管癌細胞 KYSER 后，細胞周期被阻滯在 G1 期且具有濃度依賴性，與 Liu 等[21] 的研究結果一致。這可能與不同的細胞系對藥物的反應不同有關。
失控性增殖和遷徙轉移能力是腫瘤細胞的特性。本研究中，CE 處理 24 h 后，細胞的克隆能力明顯下降，表現為克隆形成率和克隆大小明顯低于對照組，且 CE 處理過的腫瘤細胞失去了原有的三維立體生長的特性，與 Pal 等[22]的研究結果基本一致。這說明 CE 不僅能在短期內直接殺傷腫瘤細胞，而且對于“幸存”的腫瘤細胞具有持續的抑制能力，其抗腫瘤作用具有良好的后續拖尾效應。另外，本研究中 Transwell 遷徙實驗發現，CE 處理后，KYSER 細胞遷徙能力明顯下降。與此同時，在光鏡下我們觀察到，CE 處理后的細胞體積變小、形態變圓、折光性變差；在透射電鏡下我們觀察到，腫瘤細胞遷移所需的偽足變寬、變短、變少，這提示腫瘤細胞的運動能力下降。Nam 等[23]認為，丁香酚可通過抑制基質金屬蛋白酶 9 從而抑制人纖維母細胞瘤的轉移。
綜上，在本研究中，對于放射抗拒食管鱗狀細胞癌細胞 KYSER，丁香乙醇提取物能通過誘導細胞自噬和促進凋亡、細胞周期阻滯、抑制細胞能量代謝、抑制遷徙等機制發揮直接和間接的抗腫瘤作用，這為臨床解決腫瘤放射抗拒提供了新途徑。然而，丁香作為一種新發現的抗腫瘤香料植物，尚有諸多方面需要進一步探索和研究，比如其活性最高的抗腫瘤單體成分、分子水平的抗腫瘤機制、藥物代謝動力學參數、毒理學參數以及與其他抗腫瘤手段的最佳聯合方式等。
盡管傳統的手術、放射治療（放療）、化學治療手段不斷改進，新興治療方法也異軍突起，但總體上講，包括食管癌在內的多數惡性腫瘤的治療療效仍難以令人滿意[1]。世界上植物資源非常豐富，研究表明，一些植物香料的提取成分具有低毒高效的抗腫瘤作用，其與現代腫瘤治療手段的聯合也極具研究價值[2]。丁香為桃金娘科浦桃屬植物，產于坦桑尼亞、印度尼西亞等熱帶地區，其花蕾、根、葉作為香料成為很多亞洲國家廚房常用的香料。大量研究顯示，丁香具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、鎮痛等多種功能[3]。有文獻報道，丁香的活性成分對肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌和宮頸癌等腫瘤細胞具有抑制作用[4-5]。我們前期的研究結果也表明，丁香油及丁香乙醇粗提物均對直腸癌細胞 HCT116 具有明顯的殺傷作用，且與熱療聯合，抗腫瘤療效明顯增加[6]。然而，放射生物學研究顯示，放射抗拒細胞具有更惡的細胞生物學行為，如具有更強的抗凋亡能力和遷徙轉移能力[7]。放射抗拒細胞是臨床放療后復發及遠處轉移的主要原因和根源，是臨床研究者亟待克服的難題。丁香提取物（clove extract，CE）能否針對放射抗拒細胞發揮抗腫瘤作用，目前國內外尚無相關研究報道。本研究將課題組前期構建成功的食管癌放射抗拒細胞系 KYSER 作為研究模型，制備 CE 并分析其抗腫瘤的活性成分，探討不同濃度 CE 對放射抗拒食管癌細胞能量代謝、增殖、凋亡、遷徙轉移、克隆形成能力和細胞周期的影響，以期為臨床克服腫瘤放療抗拒提供低毒高效、易得的新手段。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗細胞
人食管鱗狀細胞癌放射抗拒細胞系 KYSER 由湖北醫藥學院沈力教授通過親代細胞 KYSE 間歇輻射誘導、壓力培養構建成功，贈予本研究室保存，其放射抗拒性特性已通過 2 Gy 光子線照射后的生成分數予以鑒定和證實。
1.1.2 主要試劑
Dulbecco 改良 Eagle 培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）細胞基礎培養基、胎牛血清及胰蛋白酶購于美國 Gibco 公司。噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購于美國 Sigma 公司。丁香酚標準品購于天根生化科技（北京）有限公司。丁香干燥花蕾和丁香油由美國明尼蘇達大學荷美爾研究所 Joshua Liao 教授贈送。Transwell-24 遷徙檢測試劑盒購于中國 Corning 公司。流式細胞術細胞凋亡檢測試劑盒購買于愛必信（上海）生物科技有限公司。細胞周期分析試劑盒購買于中國南京凱基生物科技發展有限公司。
1.1.3 主要儀器
超凈工作臺購于美國 Thermo 公司。倒置相差顯微鏡購于日本 Nikon 公司。流式細胞儀購于美國 BD 公司。Agilent7890B-5977A 氣相色譜-質譜儀購于佛山市捷特精密儀器有限公司。恒溫培養箱購于日本三洋公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
KYSER 采用含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基培養，并置于 37℃、5% 二氧化碳的恒溫培養箱中。
1.2.2 CE 的制備
按 1 g 干燥丁香花蕾∶5 mL 95% 乙醇的比例，將 10 g 丁香花蕾加入 50 mL 95% 乙醇中，室溫放置 2 周，0.22 μm 微孔濾膜過濾器過濾除去雜質，作為工作液保存于 –20℃ 低溫冰箱。采用 DMEM 培養基或生理鹽水將 CE 稀釋成不同濃度，用于以下實驗研究。
1.2.3 CE 的成分鑒定
以丁香酚標準品為標準對照，丁香油為平行對照，采用氣相色譜法鑒定 CE 的主要成分，主要步驟如下：① 10% 甲醇-乙酸乙酯溶液分別將丁香酚標準品稀釋 1×106倍，丁香油及 CE 稀釋 1×102倍，稀釋液用于上機檢測。② Agilent7890B-5977A 氣相色譜-質譜儀分別檢測丁香酚標準品、CE 及丁香油的主要成分，檢測時長 30 min。③ 檢測參數：分流進樣口；色譜柱類型：HP-5 MS；色譜柱尺寸（長×內徑×膜厚）：30 m×0.25 mm×0.25 μm；柱溫：100℃，10℃/min 到 260℃，保持 5 min；離子源溫度： 280℃；傳輸線（Transfer line）溫度：280℃；掃描方式：SCAN；載氣類型及流速：氦氣，恒流模式，流速 1.0 mL/min；進樣模式：splitless；進樣口溫度：250℃；進樣體積：1 μL。
1.2.4 不同濃度 CE 對細胞的生長影響
配制含有 0.2%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8% CE 和 0.5% 乙醇的 DMEM 培養基。取等量對數生長期 KYSER 細胞接種至 6 孔培養板，過夜貼壁培養后，分別用上述濃度培養基處理細胞 24 h，顯微鏡下觀察細胞生長密度、生長狀態。
1.2.5 MTT 法檢測 CE 對細胞存活的影響及影響方式
配制含有 0.4%、0.5%、0.6% CE 和 0.5% 乙醇的 DMEM 培養基。取對數生長期 KYSER 細胞，按 1×104/孔接種細胞于 96 孔培養板，過夜培養后，棄盡原培養基，分別加入等量上述濃度培養基，每個濃度設 10 個復孔。繼續培養細胞至 24、48、72、96 h，每孔加入 20 μL MTT 溶液，37℃ 孵育 4 h，棄盡孔內液體，每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，37℃ 避光孵育 20 min，酶標儀檢測 490 nm 處各孔的吸光度值（A值），檢測重復 3 次，計算細胞存活率。細胞存活率=A實驗/A對照×100%。
1.2.6 CE 對腫瘤細胞微觀結構的影響
取對數生長期 KYSER 細胞，接種于 10 cm 培養皿過夜，分別更換為含 0.5% CE 和 0.5% 乙醇的培養基，處理細胞 24 h，胰蛋白酶消化細胞，帶培養液一起低速離心細胞，使細胞沉淀成團，棄培養液，緩慢加入電子顯微鏡（電鏡）固定液（1.5%～2.5% 中性戊二醛），4℃ 下固定 30 min。樣本送上海育儀分析測試中心分析細胞器微觀結構變化，每組細胞送 3 個復檢樣本。
1.2.7 CE 對腫瘤細胞遷徙能力的影響
取常規培養的對數生長期 KYSER 細胞，設置 3 個處理組：對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組。細胞置于培養箱中經藥物作用 24 h 后，用于 Transwell 遷徙實驗。主要步驟：① 在上層小室中加入 300 μL 無血清的培養基，于培養箱中孵育 2 h，加細胞前將培養基吸出；② 制備單細胞懸液，計數活細胞，取 2×104個細胞加入 300 μL 含有 1% 胎牛血清的培養基中，再加入遷徙小室的上層小室；③ 取 500 μL 含 10% 胎牛血清的培養基加入遷徙小室的下層小室；④ 將遷徙小室置于 37℃ 5% 二氧化碳培養箱中培養過夜；⑤ 取出小室，室溫下，用 4% 多聚甲醛固定小室底部聚碳酸酯微孔膜上的細胞 30 min；⑥ 棉簽輕輕擦去上層小室未跨膜的細胞，將膜上細胞浸入 0.5% 的結晶紫染色 10 min；⑦ 用水輕柔清洗小室，在 200 倍顯微鏡下計數每個小室上、下、左、右、中 5 個視野中遷徙至聚碳酸酯微孔膜下表面的細胞數，計算每個視野下的平均細胞數，實驗重復 3 次，進行組間比較。
1.2.8 流式細胞術定量檢測 CE 誘導的細胞凋亡率
配制含有 0.4%、0.5%、0.6% CE 和 0.5% 乙醇的 DMEM 培養基。在培養箱中處理 6 孔板中對數生長期 KYSER 細胞 24 h，用冷磷酸鹽緩沖液輕柔清洗細胞 2 次，消化并離心收集細胞，每支細胞中加入 300 μL 1×結合緩沖液（Binding Buffer）和 5 μL 膜聯蛋白-Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），室溫下避光孵育 15 min。上機檢測前 5 min，每支細胞中再加入 5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液并補充 200 μL 1×Binding Buffer。流式細胞儀檢測細胞早期、晚期凋亡的比例，實驗重復 3 次，計算平均凋亡率。
1.2.9 流式細胞術測定 CE 對細胞周期分布的影響
取培養皿中對數生長期 KYSER 細胞，磷酸緩沖液清洗 2 次，徹底去除培養基中的血清，換成無血清培養基饑餓細胞 24 h，再全部更換成 10% 血清的培養基，按對照組（含 0.5% 乙醇）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組處理細胞 24 h，消化并收集細胞，70% 冷乙醇過夜固定細胞。冷磷酸緩沖液清洗、吹打細胞，制備成單細胞懸液。離心、收集細胞沉淀。向細胞中加入 500 μL PI/RNA 酶染色工作液（RNA 酶∶PI=1∶9），室溫避光孵育 1 h。流式細胞儀于激發波長 488 nm 處記錄細胞周期分布，實驗重復 3 次，求取平均細胞周期分布比例。
1.2.10 CE 對腫瘤細胞克隆形成能力的影響
取對數生長期 KYSER 細胞，按 2 000 個細胞/孔，接種至 6 孔板，分別按對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組 3 種方式處理細胞 24 h 后，終止 CE 處理，更換無藥物的新鮮培養基，繼續培養細胞 7 d，直至肉眼可見克隆形成。甲醇乙酸細胞固定液室溫下固定克隆 30 min，結晶紫染色液染色克隆，磷酸鹽緩沖液清洗克隆。計數克隆數目，設定大于 50 個細胞為 1 個克隆，每孔重復計數 3 遍，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 13.0 軟件對數據進行統計學分析。定量數據均采用均數±標準差表示。多組間采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05（雙側）。組間兩兩比較采用t檢驗，并校正檢驗水準，其中 3 組間兩兩比較檢驗水準α'=0.017，4 組間兩兩比較檢驗水準α''=0.008。
2 結果
2.1 CE 的成分鑒定
氣相色譜法分析結果顯示（圖 1）：丁香酚標準品、CE 和丁香油中的主要成分峰濃度出現時間分別為（7.852±0.045）、（7.867±0.028）、（7.949±0.037）min，3 組間對比，差異無統計學意義（P>0.05）。經數據庫（MassHunter\Library\NIST14.L）分析比對顯示：CE 中主要成分是丁香酚，次要成分是丁香油烴和乙酸丁香酚脂；丁香油中主要成分是丁香酚，次要成分是乙酸丁香酚脂、丁香油烴和氧化丁香油烴。根據峰面積比值，丁香酚在丁香油和 CE 中的相對含量分別為 31.3% 和 2.3%。
圖1
氣相質譜法分析丁香乙醇提取物和丁香油中成分
a. 空對照；b. 丁香乙醇提取物；c. 丁香酚標準品；d. 丁香油。A、C：雜峰；B、E、H：丁香酚；D、G：丁香油烴；F、J：乙酸丁香酚脂；I：氧化丁香油烴
2.2 不同濃度 CE 對細胞的生長影響
不同濃度 CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后，光學顯微鏡（光鏡）下觀察到：≥0.4% 濃度的 CE 即可對腫瘤細胞的增殖和生長狀態產生影響，當 CE 濃度達到 0.8% 時，KYSER 細胞幾乎不能存活（圖 2）。
圖2
不同濃度 CE 及 0.5% 乙醇處理 KYSER 細胞 24 h 后光鏡所見（×40）
a. 對照組（0.5% 乙醇處理）；b. 0.2% CE 處理組；c. 0.4% CE 處理組；d. 0.5% CE 處理組；e. 0.6% CE 處理組；f. 0.8% CE 處理組
2.3 MTT 法檢測不同濃度 CE 對細胞存活的影響及方式
不同濃度 CE 處理 KYSER 細胞 24、48、72、96 h，MTT 細胞存活曲線顯示：KYSER 的存活率均隨著藥物濃度的增大而明顯降低，組間對比，差異有統計學意義（P<0.05），顯示出明顯的濃度依賴性；細胞的存活率隨著處理時間的延長而表現為輕度降低，僅顯示出藥物作用的輕度時間依賴趨勢，組間對比，差異無統計學意義（P>0.05），見圖 3。
圖3
CE 對 KYSER 細胞存活抑制的劑量依賴方式
對照組為 0.5% 乙醇處理組
2.4 CE 處理后 KYSER 細胞器微觀結構的變化
與對照組（0.5% 乙醇處理）相比，0.5% CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后，KYSER 細胞的微絨毛變短、變少，細胞質內核糖體顯著減少，線粒體明顯溶解、減少，失去正常結構，細胞質內可見大量典型的自噬小體（圖 4）。
圖4
電鏡下 KYSER 細胞微觀結構變化
a、b. 對照組（0.5% 乙醇處理）；c、d. 0.5% CE 處理組。黃矩形：微絨毛；藍矩形：核糖體；綠箭：線粒體；紅箭：自噬小體
2.5 CE 處理后細胞遷徙能力的變化
Transwell 跨膜遷徙實驗顯示：0.5% CE 和 0.6% CE 處理 KYSER 24 h 后，與對照組（遷徙率設為 100%）相比，細胞的相對遷徙率分別只有對照組的（65±4）% 和（41±3）%，分別與對照組比較，差異有統計學意義（P均<0.001），見圖 5。
圖5
CE 對 KYSER 細胞遷徙能力的影響（結晶紫染色 ×40）
a. 對照組（0.5% 乙醇處理）；b. 0.5% CE 處理組；c. 0.6% CE 處理組
2.6 流式細胞術定量檢測 CE 誘導的細胞凋亡率
CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后，流式細胞術顯示：對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組 KYSER 細胞的平均總凋亡率分別為（5.63±0.50）%、（11.77±0.42）% 和（19.44±0.19）%，處理組分別與對照組比，差異有統計學意義（P均<0.001），見圖 6。
圖6
流式細胞術分析 CE 處理后 KYSER 24 h 后細胞凋亡率
a. 對照組（0.5% 乙醇處理）流式散點圖；b. 0.5% CE 處理組流式散點圖；c. 0.6% CE 處理組流式散點圖；d. 各組細胞凋亡率直條圖，* 與對照組比較，
2.7 流式細胞術測定 CE 對細胞周期分布的影響
CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后，流式細胞術檢測顯示：血清饑餓組、對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組 KYSER 細胞的 G1 期比例分別為（82.39±1.50）%、（61.99±1.20）%、（75.38±1.50）% 和（78.81±1.10）%，0.5% CE 組和 0.6%CE 組分別與對照組比，差異均有統計學意義（P均<0.001）。見圖 7。
圖7
流式細胞術檢測 CE 處理 KYSER 細胞 24 h 后細胞周期分布
a. 血清饑餓組流式直方圖；b. 對照組（0.5% 乙醇處理）流式直方圖；c. 0.5% CE 處理組流式直方圖；d. 0.6% CE 處理組流式直方圖；e. 各組細胞周期分布直條圖
2.8 CE 對腫瘤細胞克隆形成能力的影響
克隆形成實驗結果顯示：對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組細胞克隆形成率分別為（80.5±1.0）%、（18.1±0.8）% 和（5.0±0.5）%，0.5% CE 組和 0.6% CE 組分別與對照組相比，差異均有統計學意義（P均<0.001）。200 倍鏡下觀察，與對照組比，CE 處理組克隆大小明顯減小，克隆也失去了正常的三維立體生長特性（圖 8）。
圖8
CE 處理 KYSER 細胞 24 h 克隆形成實驗
a～c. 分別為對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組肉眼觀察克隆數目；d～f. 分別為對照組（0.5% 乙醇處理）、0.5% CE 處理組和 0.6% CE 處理組光鏡下觀察克隆大小（結晶紫染色 ×200）
3 討論
實體瘤中存在的放射抗拒細胞是放療后腫瘤復發的種子和根源[8]。一直以來，腫瘤放療領域的基礎和臨床研究者不斷尋求著能夠根除放射抗拒性細胞的有效方法，但大多收效不佳。近年來，植物提取物因其高效低毒的抗腫瘤作用，日益受到重視。文獻報道，香料丁香無論在腫瘤的預防方面，還是在腫瘤的治療方面都具有很好的潛力[9]。本課題組在前期研究中證實了丁香油對大腸癌細胞的良好殺傷作用[6]。然而，對于臨床治療較為棘手的放射抗拒細胞，CE 能否同樣發揮抗腫瘤作用，目前尚無相關研究來回答。
本實驗將前期構建成功的放射抗拒性食管癌細胞系 KYSER 作為研究模型。藥物體外作用研究結果顯示：0.4% CE 作用細胞 24 h 即可對腫瘤細胞的存活和生長狀態產生影響，當 CE 濃度達到 0.8% 時，KYSER 細胞基本不能存活，這提示 CE 活性成分可能具有高效殺傷 KYSER 細胞的作用。MTT 增殖實驗也顯示：CE 對 KYSER 存活的抑制作用呈現明顯的濃度依賴性。在類似的研究中，Arunava 等[10]利用蒸餾和萃取法從丁香粉末中提取丁香酚，體外增殖實驗顯示，丁香酚對宮頸癌細胞的增殖抑制具有明顯濃度和時間依賴性。此外，抗腫瘤藥物開發的前提是高效，更需低毒，即不能對人體正常器官產生嚴重毒性。Vijayasteltar 等[11]系統研究了丁香的毒理學特性和安全性，結果并未發現對小鼠有明顯的毒性和致畸性，這從科學層面很好地解釋了丁香成為亞洲人廚房常用香料的原因，這也為開發 CE 抗腫瘤奠定了基礎和前提。
目前已有的文獻表明，CE 抗腫瘤的活性與其提取方式有明顯的關系。Dwivedi 等[12]研究發現丁香的水、乙醇、油提取物抗腫瘤活性差異明顯，油提取物最佳，水提取物最差。Elsyana 等[13]發現丁香的 N-己烷萃取物抗腫瘤活性強于乙醇提取物。我們前期的研究中，一定濃度的丁香油能在 2 h 內殺傷直腸癌細胞 HCT116，而等量等濃度的丁香乙醇提取物不能。本研究通過氣相色譜法檢測到丁香油和丁香乙醇提取物中主要組分均為丁香酚，但前者丁香酚含量達后者 15 倍，這說明不同提取方式，其成分含量差異巨大。Ryu 等[14]分析了丁香乙酸乙酯提取物中有 19 種成分，均不同程度地具有殺傷卵巢癌細胞的作用。因此，正如大多數中草藥研究所面臨的問題一樣，丁香作為一種具有復合成分的植物香料，其最強的抗腫瘤活性成分及最佳的提取方式，都需進一步明確和研究，這對利用現代工藝開發抗腫瘤藥物具有重要意義。
誘導凋亡和細胞周期阻滯是多數藥物或化合物抗腫瘤的常見機制。在本研究中，0.5% 和 0.6% 的 CE 處理 KYSER 后，凋亡率分別為 11.77% 和 19.44%，均高于對照組的 5.63%。研究顯示，很多藥物通過干擾或者破壞腫瘤細胞的能量合成代謝途徑，促使腫瘤細胞走向凋亡。誘導自噬是很多藥物抗腫瘤的主要機制之一。本研究中透射電鏡觀察到，腫瘤細胞經 CE 處理后，細胞質內可見大量典型的自噬小體，Li 等[15]也觀察到類似現象，并進一步發現 AMP 活化蛋白激酶/Unc-51 樣激酶通路在其中發揮重要作用。Liu 等[16]報道了磷脂酰肌醇 3 激酶/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路介導細胞自噬，并最終誘導腫瘤細胞凋亡。本研究還發現，CE 處理細胞后，腫瘤細胞細胞質的核糖小體明顯減少。核糖體是細胞蛋白和 RNA 的復合體，核糖小體的減少提示腫瘤細胞的蛋白合成明顯受抑。另外，線粒體是真核細胞能量代謝的主要場所，本研究觀察到，腫瘤細胞經過 CE 作用，細胞質內線粒體明顯溶解、減少、失去正常結構。Liang 等[17]發現，丁香酚誘導膠質母細胞瘤細胞的凋亡，是通過增加細胞能氧自由基片段，誘導線粒體膜電位的變化，進而激活線粒體凋亡通路。Júnior 等[18]報道了丁香酚誘導黑色素瘤細胞線粒體斷裂和畸變，這與本研究中觀察到的線粒體溶解現象是一致的。此外，誘導細胞周期阻滯也是諸多抗腫瘤藥物的重要機制。Ma 等[19]報道，丁香酚誘導人表皮生長因子受體-2 陽性乳腺癌癌前病變 MCF-7AT 細胞 S 期阻滯，而對于人表皮生長因子受體-2 陰性癌前病變細胞無此類效應。Kubatka 等[20]在乳腺癌細胞中也檢測到 S 期阻滯。而本研究中，我們檢測到 CE 處理食管癌細胞 KYSER 后，細胞周期被阻滯在 G1 期且具有濃度依賴性，與 Liu 等[21] 的研究結果一致。這可能與不同的細胞系對藥物的反應不同有關。
失控性增殖和遷徙轉移能力是腫瘤細胞的特性。本研究中，CE 處理 24 h 后，細胞的克隆能力明顯下降，表現為克隆形成率和克隆大小明顯低于對照組，且 CE 處理過的腫瘤細胞失去了原有的三維立體生長的特性，與 Pal 等[22]的研究結果基本一致。這說明 CE 不僅能在短期內直接殺傷腫瘤細胞，而且對于“幸存”的腫瘤細胞具有持續的抑制能力，其抗腫瘤作用具有良好的后續拖尾效應。另外，本研究中 Transwell 遷徙實驗發現，CE 處理后，KYSER 細胞遷徙能力明顯下降。與此同時，在光鏡下我們觀察到，CE 處理后的細胞體積變小、形態變圓、折光性變差；在透射電鏡下我們觀察到，腫瘤細胞遷移所需的偽足變寬、變短、變少，這提示腫瘤細胞的運動能力下降。Nam 等[23]認為，丁香酚可通過抑制基質金屬蛋白酶 9 從而抑制人纖維母細胞瘤的轉移。
綜上，在本研究中，對于放射抗拒食管鱗狀細胞癌細胞 KYSER，丁香乙醇提取物能通過誘導細胞自噬和促進凋亡、細胞周期阻滯、抑制細胞能量代謝、抑制遷徙等機制發揮直接和間接的抗腫瘤作用，這為臨床解決腫瘤放射抗拒提供了新途徑。然而，丁香作為一種新發現的抗腫瘤香料植物，尚有諸多方面需要進一步探索和研究，比如其活性最高的抗腫瘤單體成分、分子水平的抗腫瘤機制、藥物代謝動力學參數、毒理學參數以及與其他抗腫瘤手段的最佳聯合方式等。
