引用本文： 韓冰, 趙謙, 姜濤, 鄧斌, 馮立, 連世超, 孔祥民. 微 RNA-21 調控脊髓損傷后成纖維細胞功能的研究. 華西醫學, 2020, 35(7): 845-850. doi: 10.7507/1002-0179.202001126 復制
脊髓損傷是一類由中樞神經損傷導致的軀體運動功能障礙綜合征，目前尚無有效治療手段[1-2]。損傷后阻礙軸突再生的主要因素是損傷中心處形成的瘢痕組織，而纖維瘢痕是瘢痕組織的重要構成成分[3-4]。成纖維細胞在腦脊膜和血管中的存在量豐富，這也是纖維化形成的前提條件[5-7]。脊髓損傷后脊膜和血管中的成纖維細胞、巨噬細胞等[8]，侵入損傷區域，介導損傷組織的纖維化[9-10]。成纖維細胞增殖、活化和分泌改變了細胞外基質的原有組分，分泌的纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、Ⅰ 型膠原蛋白（typeⅠcollagen，ColⅠ）和 Ⅳ 型膠原蛋白（typeⅣ collagen，ColⅣ）等纖維化相關蛋白沉積聚集[11-13]，最終形成瘢痕阻礙神經生長[14]。微 RNA（microRNA，miRNA）可通過結合信使 RNA（messengerRNA，mRNA）的 3′端非翻譯區區域調控基因表達[15-16]，microRNA-21-5p（miR-21）在多個器官內均有促纖維化的作用[17]，本研究評估了 miR-21 對脊髓損傷后的脊髓成纖維細胞纖維化的影響，并為研究脊髓損傷后抑制纖維瘢痕形成和促進神經元再生的機制提供了新的思路。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
原代脊髓成纖維細胞購于武漢原代細胞公司，用于培養、鑒定、轉染和檢測。胎牛血清、胰蛋白酶、改良伊格爾培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）、慶大霉素兩性霉素 B 混合液購于美國 GIBCO 公司。Bulge-LoopTM miRNA 反轉錄試劑盒（ssD089261711）、Bulge-LoopTM miRNA 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（MQP-0101）、miR-21 引物（ssD089230931）、U6 核小 RNA（ssD090471006）引物、miR-21 模擬物（miR10000530）和抑制劑（miR10000530）購于廣州銳博公司；一抗及二抗稀釋液購于美國 GIBCO 公司；FN 引物、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、B 淋巴細胞瘤-2 基因相關 X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，BAX）抗體購于英國 abcam 公司，ColⅠ 抗體購于索萊寶公司；TRIZOL、PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒，ColⅠa1、ColⅠa2、ColⅣ 引物購于大連 Takara 公司。
生物安全柜、恒溫二氧化碳培養箱、-80℃ 超低溫冰箱購于美國 Thermo 公司；移液器購于德國 Eppendorff 公司；熒光顯微鏡購于日本尼康公司；電泳儀 DYY-6C 購于北京六一儀器廠、實時熒光定量逆轉錄（quantitative real-time reverse transcription，qRT）-PCR儀 ABI PRISM? 7500 購于美國 Invitrogen 公司；高壓滅菌鍋、制冰機購于日本 SANYO 公司。
1.2 脊髓成纖維細胞培養及免疫熒光鑒定
脊髓成纖維原代細胞用改良伊格爾培養基培養，2～3 d 換液，待細胞生長到 80% 以上后消化傳代。使用六孔板爬片培養細胞 48 h 后取出爬片，固定，血清封閉，一抗 ColⅠ（1∶200）4℃ 孵育過夜。二抗（1∶400）覆蓋組織，室溫孵育 50 min，PBS 沖洗，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，PBS 洗滌后封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
1.3 體外劃痕法脊髓損傷模型的建立
將第 3 代成纖維細胞傳代種植于 60 mm 培養皿中，待細胞生長至 80% 融合后，用無菌 200 μL 微量移液器吸頭在培養皿中均勻劃成橫縱劃痕損傷，劃痕寬約 1 mm，間距 5 mm，呈“#”字形。劃痕后，PBS 沖洗去除損傷的細胞碎片， 補加新鮮培養基繼續培養，于損傷后 48 h 取足量損傷細胞及對照組細胞于上海吉凱基因公司行 miRNA 芯片分析。
1.4 miR-21 模擬物、抑制劑轉染及效率檢測
將 miR-21 模擬物、抑制劑及陰性對照添加至細胞培養基，轉染脊髓成纖維細胞，48 h 后進行劃痕實驗，劃痕后 48 h 使用 Trizol 法[17]收取細胞總 RNA。紫外熒光光度計純度和濃度后，反轉錄互補 DNA（complementary DNA，cDNA），取適量 cDNA 為模板配制 20 μL 反應體系在 PCR 擴增儀中進行擴增。使用 SYBR Green-Ⅰ非序列特異性的熒光染料實時檢測擴增情況，使用 U6 為內參分析表達情況。miRNA 擴增條件為 95℃ 預變性 10 min，隨后 95℃ 2 s，退火延伸 60℃ 30 s（40 個循環）。實驗重復 3 次，數據采用 2-ΔΔCt法[17]進行分析 miR-21 的表達效率，引物設計見表 1。
表1
qRT-PCR 引物列表
1.5 qRT-PCR 檢測活化指標
RNA 提取及反轉錄同上，取適量 cDNA 為模板配制 20 μL 反應體系在 PCR 擴增儀中進行擴增。使用 SYBR 染料實時檢測擴增情況，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參分析表達情況。蛋白編碼基因擴增條件為 95℃ 預變性 30 s，隨后 95℃5 s，退火延伸 60℃ 34 s（40 個循環）。實驗重復 3 次，數據采用 2-ΔΔCt法進行分析，引物設計見表 1。
1.6 蛋白質印跡分析法（Western Blot，WB）
按 1 mL 裂解液中加入 10 μL 苯甲基磺酰氟的比例混合裂解液后，六孔板每孔加入 100 μL。冰板上裂解后使用蛋白質定量法測定蛋白濃度。加入 5× Loading Buffer，水浴鍋內 100℃ 加熱 10 min。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏氟乙烯膜轉膜后 5% 脫脂奶粉溶液室溫封閉 1 h，洗滌緩沖液洗膜 3 次，5 min/次。一抗 FN（1∶5 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）、PCAN（1∶500）、GAPDH（1∶10 000）4℃ 孵育過夜。二抗（1∶5 000）室溫孵育 1 h，洗滌緩沖液洗膜 3 次，每次 5 min，均勻涂加發光顯影劑后暗盒內顯影。
1.7 觀察指標
① 成纖維細胞劃痕損傷后 miR-21 與纖維化相關 mRNA 和蛋白的表達變化；② 調控 miR-21 后凋亡、增殖和纖維化相關 mRNA 和蛋白表達變化。
1.8 統計學方法
用 GraphPad 8.0.2 軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示。根據實驗設計，兩組間比較使用 t 檢驗；多組間比較使用單因素方差分析，若差異有統計學意義，則使用 Dunnet-t 檢驗進行各組與對照組間的兩兩比較。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 脊髓成纖維細胞的鑒定及細胞損傷模型的構建
免疫熒光鑒定脊髓成纖維細胞，細胞質由于 ColⅠ 的特異性表達呈綠色，細胞核呈藍色（圖 1a）。脊髓成纖維細胞劃痕損傷之后，損傷處邊緣（藍色線段標記）的成纖維細胞逐漸變小，形態變為圓形或短梭形（圖 1b）。
圖1
脊髓成纖維細胞鑒定及劃痕損傷模型的建立
a. 熒光顯微鏡下觀察，脊髓成纖維細胞 ColⅠ 免疫熒光鑒定，細胞質呈綠色，細胞核呈藍色；b. 光學顯微鏡下觀察，為劃痕損傷后的脊髓成纖維細胞，藍色線段之間的區域為劃痕區域
qRT-PCR 檢測損傷組的纖維化相關基因，包括 ColⅠa1、ColⅠa2、Col Ⅳ 和 FN，表達量較對照組差異明顯，損傷組纖維化相關基因表達明顯升高（>1.5 倍，P<0.05），見圖 2a～2d。WB 結果進一步證實損傷組的 FN 蛋白表達增加（>1.5 倍，P<0.05），見圖 2e、2f。
圖2
劃痕損傷后纖維化相關指標的檢測
a～d. qRT-PCR 檢測脊髓成纖維細胞劃痕損傷組和對照組纖維化相關基因（
2.2 脊髓成纖維細損傷后 miR-21 的表達變化
使用高通量篩選損傷組與對照組差異表達的 miRNA，損傷組 miR-21 顯著上調，見圖 3a。經 qRT-PCR 檢測，損傷組 miR-21 表達比對照組有明顯升高（倍數>1.5，P<0.05），見圖 3b。這些結果提示劃痕損傷后小鼠脊髓成纖維細胞中 miR-21 的表達明顯上升。
圖3
脊髓成纖維細胞劃痕損傷后 48 h miRNA 差異表達聚類圖、qRT-PCR 驗證以及轉染效率的鑒定
a. 脊髓成纖維細胞劃痕損傷 48 h 后細胞中差異表達的 miRNA 聚類圖，紅色方格表示 miRNA 在組織中高表達，綠色方格表示低表達，miR-21 表達顯著上調（>1.5 倍，
2.3 miR-21 對脊髓損傷后成纖維細胞活化相關基因表達的影響
使用轉染 miR-21 模擬物、抑制劑及亂序對照組的方法過表達和抑制原代成纖維細胞中 miR-21 表達水平。經過 RT-PCR 檢測，轉染效果良好，見圖 3c。在轉染 miR-21 模擬物的細胞中，纖維化相關基因顯著上調（P<0.05）；而轉染 miR-21 抑制劑的細胞，纖維化相關基因的表達量顯著降低（P<0.05），見圖 4a～4d。這表明 miR-21 的上調促進了原代脊髓成纖維細胞中纖維化相關基因的表達，而下調 miR-21 抑制了纖維化相關基因的表達，提示 miR-21 對纖維化相關基因有直接調控作用。
圖4
miR-21 過表達/抑制后纖維化相關基因表達情況的變化
a～d. qRT-PCR 檢測調控 miR-21 后脊髓成纖維細胞纖維化相關基因（
2.4 miR-21 對損傷后脊髓成纖維細胞增殖和凋亡的影響
通過 Bcl-2 和 Bax 的蛋白表達水平來評估細胞凋亡的水平。上調 miR-21 后 Bcl-2 表達明顯升高，Bax 蛋白表達顯著降低（P<0.05）；下調 miR-21 后 Bcl-2 蛋白表達顯著降低，Bax 蛋白表達顯著升高（P<0.05），見圖 5a。通過 PCNA 的表達量評估細胞增殖的情況， WB 分析顯示，與對照組相比，miR-21 模擬物組 PCNA 蛋白表達增加（P<0.05），而 miR-21 抑制劑組 PCNA 蛋白表達量顯著降低（P<0.05），見圖 5b。以上結果提示 miR-21 可促進脊髓成纖維細胞增殖。
圖5
miR-21 調控對成纖維細胞增殖和凋亡情況的影響
a. Bax、Bcl-2、β-ACTIN 蛋白表達情況的 WB 檢測結果；b. PCNA、β-ACTIN 蛋白表達情況的 WB 檢測結果
3 討論
脊髓損傷后運動和感覺功能的恢復是現代醫學的難題，研究表明功能的恢復必須通過神經再生和神經連接的再通來實現，而瘢痕組織的阻擋是神經恢復連接的主要障礙[18]。脊髓損傷后損傷中心處形成纖維瘢痕，膠質瘢痕環繞在纖維瘢痕周圍，與混雜其中的巨噬細胞一起構成瘢痕組織[19]。纖維瘢痕是瘢痕組織的核心，也是神經最難突破的致密瘢塊，對脊髓損傷后的功能恢復影響巨大[20]。因此對脊髓損傷后成纖維細胞纖維化進程中的分子機制進行深入研究，有助于實現脊髓損傷后神經功能恢復。
纖維瘢痕由損傷部位的血管細胞和脊膜來源的成纖維細胞，以及大量成纖維細胞分泌的細胞外基質，如纖維連接蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白等成分組成。本研究對原代脊髓成纖維細胞進行劃痕損傷，損傷后 FN、Col I、Col IV 等 ECM 基因的上調說明我們成功誘導脊髓成纖維細胞的活化，從而成功構建了體外損傷模型。
miRNA 是一類高度保守的 RNA，廣泛存在于各種生物中，參與生理和病理進程[21]。在各種神經病變相關模型包括脊髓損傷模型中存在廣泛的 miRNA 差異表達[22]，其中多個研究表明 miR-21 是脊髓損傷后表達量高且顯著差異表達的 miRNA[23]， 甚至在脊髓損傷后 3 d，miR-21 是脊髓組織中差異表達最顯著同時也是上調最顯著的 miRNA[24]。本研究對脊髓成纖維細胞機械損傷前后進行了 miRNA 芯片分析，設定差異表達 1.5 倍為閾值，篩選差異表達的 miRNA。損傷后 miR-21 符合高表達且表達量差異上調，PCR 驗證結果與芯片一致，結合文獻中的研究基礎，本研究繼續對 miR-21 的功能進行探索。
miR-21 在不同器官組織的纖維化中起關鍵作用：miR-21 可以促進肝臟纖維化；加速心肌纖維化，導致心室結構重塑[25-27]；而且與腎臟及肺纖維化密切相關[28-29]。我們通過上、下調脊髓成纖維細胞中 miR-21 水平驗證其是否和脊髓成纖維細胞纖維化相關，結果顯示，與對照組相比，纖維化相關基因在 miR-21 模擬物組中表達升高，但在 miR-21 抑制劑組中表達降低。結果說明損傷后高表達的 miR-21 可以促進纖維化進程的演進，促進纖維瘢痕的形成，從而對神經功能的恢復起到了限制性的作用。
成纖維細胞的增殖和凋亡與組織纖維化的病理過程密切相關。現有研究證明 miR-21 在腫瘤中促進腫瘤細胞增殖，并抑制其凋亡[30]。因此，為了闡明 miR-21 在脊髓損傷后纖維化中的可能作用，我們通過轉染 miR-21 模擬物/抑制劑的方法觀察脊髓成纖維細胞的增殖和凋亡情況。結果顯示上調 miR-21 的表達量可促進脊髓成纖維細胞增殖，抑制其凋亡；下調 miR-21 可以抑制脊髓成纖維細胞增殖，促進其凋亡。因此，我們認為 miR-21 也可以通過促進脊髓損傷后成纖維細胞的增殖，并且抑制其凋亡來參與纖維化的進程。
總結全文，本研究使用脊髓成纖維細胞劃痕模型，發現 miR-21 在損傷后表達升高，而且由于 miRNA 靶向調節一對多的特性，miR-21 的升高能夠直接促進纖維化相關基因表達，又可以促進成纖維細胞增殖、抑制其凋亡，從而通過活化、增殖和凋亡 3 種途徑調控纖維瘢痕的形成。
未來將進一步通過體內、體外實驗研究 miR-21 參與脊髓損傷后成纖維細胞活化的具體靶標蛋白及信號通路，為尋求脊髓損傷的治療策略提供新的思路、治療靶點及基礎理論依據。
利益沖突聲明：所有作者認可文章無相關利益沖突。
脊髓損傷是一類由中樞神經損傷導致的軀體運動功能障礙綜合征，目前尚無有效治療手段[1-2]。損傷后阻礙軸突再生的主要因素是損傷中心處形成的瘢痕組織，而纖維瘢痕是瘢痕組織的重要構成成分[3-4]。成纖維細胞在腦脊膜和血管中的存在量豐富，這也是纖維化形成的前提條件[5-7]。脊髓損傷后脊膜和血管中的成纖維細胞、巨噬細胞等[8]，侵入損傷區域，介導損傷組織的纖維化[9-10]。成纖維細胞增殖、活化和分泌改變了細胞外基質的原有組分，分泌的纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、Ⅰ 型膠原蛋白（typeⅠcollagen，ColⅠ）和 Ⅳ 型膠原蛋白（typeⅣ collagen，ColⅣ）等纖維化相關蛋白沉積聚集[11-13]，最終形成瘢痕阻礙神經生長[14]。微 RNA（microRNA，miRNA）可通過結合信使 RNA（messengerRNA，mRNA）的 3′端非翻譯區區域調控基因表達[15-16]，microRNA-21-5p（miR-21）在多個器官內均有促纖維化的作用[17]，本研究評估了 miR-21 對脊髓損傷后的脊髓成纖維細胞纖維化的影響，并為研究脊髓損傷后抑制纖維瘢痕形成和促進神經元再生的機制提供了新的思路。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
原代脊髓成纖維細胞購于武漢原代細胞公司，用于培養、鑒定、轉染和檢測。胎牛血清、胰蛋白酶、改良伊格爾培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）、慶大霉素兩性霉素 B 混合液購于美國 GIBCO 公司。Bulge-LoopTM miRNA 反轉錄試劑盒（ssD089261711）、Bulge-LoopTM miRNA 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（MQP-0101）、miR-21 引物（ssD089230931）、U6 核小 RNA（ssD090471006）引物、miR-21 模擬物（miR10000530）和抑制劑（miR10000530）購于廣州銳博公司；一抗及二抗稀釋液購于美國 GIBCO 公司；FN 引物、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、B 淋巴細胞瘤-2 基因相關 X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，BAX）抗體購于英國 abcam 公司，ColⅠ 抗體購于索萊寶公司；TRIZOL、PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒，ColⅠa1、ColⅠa2、ColⅣ 引物購于大連 Takara 公司。
生物安全柜、恒溫二氧化碳培養箱、-80℃ 超低溫冰箱購于美國 Thermo 公司；移液器購于德國 Eppendorff 公司；熒光顯微鏡購于日本尼康公司；電泳儀 DYY-6C 購于北京六一儀器廠、實時熒光定量逆轉錄（quantitative real-time reverse transcription，qRT）-PCR儀 ABI PRISM? 7500 購于美國 Invitrogen 公司；高壓滅菌鍋、制冰機購于日本 SANYO 公司。
1.2 脊髓成纖維細胞培養及免疫熒光鑒定
脊髓成纖維原代細胞用改良伊格爾培養基培養，2～3 d 換液，待細胞生長到 80% 以上后消化傳代。使用六孔板爬片培養細胞 48 h 后取出爬片，固定，血清封閉，一抗 ColⅠ（1∶200）4℃ 孵育過夜。二抗（1∶400）覆蓋組織，室溫孵育 50 min，PBS 沖洗，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，PBS 洗滌后封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
1.3 體外劃痕法脊髓損傷模型的建立
將第 3 代成纖維細胞傳代種植于 60 mm 培養皿中，待細胞生長至 80% 融合后，用無菌 200 μL 微量移液器吸頭在培養皿中均勻劃成橫縱劃痕損傷，劃痕寬約 1 mm，間距 5 mm，呈“#”字形。劃痕后，PBS 沖洗去除損傷的細胞碎片， 補加新鮮培養基繼續培養，于損傷后 48 h 取足量損傷細胞及對照組細胞于上海吉凱基因公司行 miRNA 芯片分析。
1.4 miR-21 模擬物、抑制劑轉染及效率檢測
將 miR-21 模擬物、抑制劑及陰性對照添加至細胞培養基，轉染脊髓成纖維細胞，48 h 后進行劃痕實驗，劃痕后 48 h 使用 Trizol 法[17]收取細胞總 RNA。紫外熒光光度計純度和濃度后，反轉錄互補 DNA（complementary DNA，cDNA），取適量 cDNA 為模板配制 20 μL 反應體系在 PCR 擴增儀中進行擴增。使用 SYBR Green-Ⅰ非序列特異性的熒光染料實時檢測擴增情況，使用 U6 為內參分析表達情況。miRNA 擴增條件為 95℃ 預變性 10 min，隨后 95℃ 2 s，退火延伸 60℃ 30 s（40 個循環）。實驗重復 3 次，數據采用 2-ΔΔCt法[17]進行分析 miR-21 的表達效率，引物設計見表 1。
表1
qRT-PCR 引物列表
1.5 qRT-PCR 檢測活化指標
RNA 提取及反轉錄同上，取適量 cDNA 為模板配制 20 μL 反應體系在 PCR 擴增儀中進行擴增。使用 SYBR 染料實時檢測擴增情況，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參分析表達情況。蛋白編碼基因擴增條件為 95℃ 預變性 30 s，隨后 95℃5 s，退火延伸 60℃ 34 s（40 個循環）。實驗重復 3 次，數據采用 2-ΔΔCt法進行分析，引物設計見表 1。
1.6 蛋白質印跡分析法（Western Blot，WB）
按 1 mL 裂解液中加入 10 μL 苯甲基磺酰氟的比例混合裂解液后，六孔板每孔加入 100 μL。冰板上裂解后使用蛋白質定量法測定蛋白濃度。加入 5× Loading Buffer，水浴鍋內 100℃ 加熱 10 min。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏氟乙烯膜轉膜后 5% 脫脂奶粉溶液室溫封閉 1 h，洗滌緩沖液洗膜 3 次，5 min/次。一抗 FN（1∶5 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）、PCAN（1∶500）、GAPDH（1∶10 000）4℃ 孵育過夜。二抗（1∶5 000）室溫孵育 1 h，洗滌緩沖液洗膜 3 次，每次 5 min，均勻涂加發光顯影劑后暗盒內顯影。
1.7 觀察指標
① 成纖維細胞劃痕損傷后 miR-21 與纖維化相關 mRNA 和蛋白的表達變化；② 調控 miR-21 后凋亡、增殖和纖維化相關 mRNA 和蛋白表達變化。
1.8 統計學方法
用 GraphPad 8.0.2 軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示。根據實驗設計，兩組間比較使用 t 檢驗；多組間比較使用單因素方差分析，若差異有統計學意義，則使用 Dunnet-t 檢驗進行各組與對照組間的兩兩比較。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 脊髓成纖維細胞的鑒定及細胞損傷模型的構建
免疫熒光鑒定脊髓成纖維細胞，細胞質由于 ColⅠ 的特異性表達呈綠色，細胞核呈藍色（圖 1a）。脊髓成纖維細胞劃痕損傷之后，損傷處邊緣（藍色線段標記）的成纖維細胞逐漸變小，形態變為圓形或短梭形（圖 1b）。
圖1
脊髓成纖維細胞鑒定及劃痕損傷模型的建立
a. 熒光顯微鏡下觀察，脊髓成纖維細胞 ColⅠ 免疫熒光鑒定，細胞質呈綠色，細胞核呈藍色；b. 光學顯微鏡下觀察，為劃痕損傷后的脊髓成纖維細胞，藍色線段之間的區域為劃痕區域
qRT-PCR 檢測損傷組的纖維化相關基因，包括 ColⅠa1、ColⅠa2、Col Ⅳ 和 FN，表達量較對照組差異明顯，損傷組纖維化相關基因表達明顯升高（>1.5 倍，P<0.05），見圖 2a～2d。WB 結果進一步證實損傷組的 FN 蛋白表達增加（>1.5 倍，P<0.05），見圖 2e、2f。
圖2
劃痕損傷后纖維化相關指標的檢測
a～d. qRT-PCR 檢測脊髓成纖維細胞劃痕損傷組和對照組纖維化相關基因（
2.2 脊髓成纖維細損傷后 miR-21 的表達變化
使用高通量篩選損傷組與對照組差異表達的 miRNA，損傷組 miR-21 顯著上調，見圖 3a。經 qRT-PCR 檢測，損傷組 miR-21 表達比對照組有明顯升高（倍數>1.5，P<0.05），見圖 3b。這些結果提示劃痕損傷后小鼠脊髓成纖維細胞中 miR-21 的表達明顯上升。
圖3
脊髓成纖維細胞劃痕損傷后 48 h miRNA 差異表達聚類圖、qRT-PCR 驗證以及轉染效率的鑒定
a. 脊髓成纖維細胞劃痕損傷 48 h 后細胞中差異表達的 miRNA 聚類圖，紅色方格表示 miRNA 在組織中高表達，綠色方格表示低表達，miR-21 表達顯著上調（>1.5 倍，
2.3 miR-21 對脊髓損傷后成纖維細胞活化相關基因表達的影響
使用轉染 miR-21 模擬物、抑制劑及亂序對照組的方法過表達和抑制原代成纖維細胞中 miR-21 表達水平。經過 RT-PCR 檢測，轉染效果良好，見圖 3c。在轉染 miR-21 模擬物的細胞中，纖維化相關基因顯著上調（P<0.05）；而轉染 miR-21 抑制劑的細胞，纖維化相關基因的表達量顯著降低（P<0.05），見圖 4a～4d。這表明 miR-21 的上調促進了原代脊髓成纖維細胞中纖維化相關基因的表達，而下調 miR-21 抑制了纖維化相關基因的表達，提示 miR-21 對纖維化相關基因有直接調控作用。
圖4
miR-21 過表達/抑制后纖維化相關基因表達情況的變化
a～d. qRT-PCR 檢測調控 miR-21 后脊髓成纖維細胞纖維化相關基因（
2.4 miR-21 對損傷后脊髓成纖維細胞增殖和凋亡的影響
通過 Bcl-2 和 Bax 的蛋白表達水平來評估細胞凋亡的水平。上調 miR-21 后 Bcl-2 表達明顯升高，Bax 蛋白表達顯著降低（P<0.05）；下調 miR-21 后 Bcl-2 蛋白表達顯著降低，Bax 蛋白表達顯著升高（P<0.05），見圖 5a。通過 PCNA 的表達量評估細胞增殖的情況， WB 分析顯示，與對照組相比，miR-21 模擬物組 PCNA 蛋白表達增加（P<0.05），而 miR-21 抑制劑組 PCNA 蛋白表達量顯著降低（P<0.05），見圖 5b。以上結果提示 miR-21 可促進脊髓成纖維細胞增殖。
圖5
miR-21 調控對成纖維細胞增殖和凋亡情況的影響
a. Bax、Bcl-2、β-ACTIN 蛋白表達情況的 WB 檢測結果；b. PCNA、β-ACTIN 蛋白表達情況的 WB 檢測結果
3 討論
脊髓損傷后運動和感覺功能的恢復是現代醫學的難題，研究表明功能的恢復必須通過神經再生和神經連接的再通來實現，而瘢痕組織的阻擋是神經恢復連接的主要障礙[18]。脊髓損傷后損傷中心處形成纖維瘢痕，膠質瘢痕環繞在纖維瘢痕周圍，與混雜其中的巨噬細胞一起構成瘢痕組織[19]。纖維瘢痕是瘢痕組織的核心，也是神經最難突破的致密瘢塊，對脊髓損傷后的功能恢復影響巨大[20]。因此對脊髓損傷后成纖維細胞纖維化進程中的分子機制進行深入研究，有助于實現脊髓損傷后神經功能恢復。
纖維瘢痕由損傷部位的血管細胞和脊膜來源的成纖維細胞，以及大量成纖維細胞分泌的細胞外基質，如纖維連接蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白等成分組成。本研究對原代脊髓成纖維細胞進行劃痕損傷，損傷后 FN、Col I、Col IV 等 ECM 基因的上調說明我們成功誘導脊髓成纖維細胞的活化，從而成功構建了體外損傷模型。
miRNA 是一類高度保守的 RNA，廣泛存在于各種生物中，參與生理和病理進程[21]。在各種神經病變相關模型包括脊髓損傷模型中存在廣泛的 miRNA 差異表達[22]，其中多個研究表明 miR-21 是脊髓損傷后表達量高且顯著差異表達的 miRNA[23]， 甚至在脊髓損傷后 3 d，miR-21 是脊髓組織中差異表達最顯著同時也是上調最顯著的 miRNA[24]。本研究對脊髓成纖維細胞機械損傷前后進行了 miRNA 芯片分析，設定差異表達 1.5 倍為閾值，篩選差異表達的 miRNA。損傷后 miR-21 符合高表達且表達量差異上調，PCR 驗證結果與芯片一致，結合文獻中的研究基礎，本研究繼續對 miR-21 的功能進行探索。
miR-21 在不同器官組織的纖維化中起關鍵作用：miR-21 可以促進肝臟纖維化；加速心肌纖維化，導致心室結構重塑[25-27]；而且與腎臟及肺纖維化密切相關[28-29]。我們通過上、下調脊髓成纖維細胞中 miR-21 水平驗證其是否和脊髓成纖維細胞纖維化相關，結果顯示，與對照組相比，纖維化相關基因在 miR-21 模擬物組中表達升高，但在 miR-21 抑制劑組中表達降低。結果說明損傷后高表達的 miR-21 可以促進纖維化進程的演進，促進纖維瘢痕的形成，從而對神經功能的恢復起到了限制性的作用。
成纖維細胞的增殖和凋亡與組織纖維化的病理過程密切相關。現有研究證明 miR-21 在腫瘤中促進腫瘤細胞增殖，并抑制其凋亡[30]。因此，為了闡明 miR-21 在脊髓損傷后纖維化中的可能作用，我們通過轉染 miR-21 模擬物/抑制劑的方法觀察脊髓成纖維細胞的增殖和凋亡情況。結果顯示上調 miR-21 的表達量可促進脊髓成纖維細胞增殖，抑制其凋亡；下調 miR-21 可以抑制脊髓成纖維細胞增殖，促進其凋亡。因此，我們認為 miR-21 也可以通過促進脊髓損傷后成纖維細胞的增殖，并且抑制其凋亡來參與纖維化的進程。
總結全文，本研究使用脊髓成纖維細胞劃痕模型，發現 miR-21 在損傷后表達升高，而且由于 miRNA 靶向調節一對多的特性，miR-21 的升高能夠直接促進纖維化相關基因表達，又可以促進成纖維細胞增殖、抑制其凋亡，從而通過活化、增殖和凋亡 3 種途徑調控纖維瘢痕的形成。
未來將進一步通過體內、體外實驗研究 miR-21 參與脊髓損傷后成纖維細胞活化的具體靶標蛋白及信號通路，為尋求脊髓損傷的治療策略提供新的思路、治療靶點及基礎理論依據。
利益沖突聲明：所有作者認可文章無相關利益沖突。
