引用本文： 吳鯤鵬, 趙洵穎, 劉齊, 周婷慧, 張維, 楊帆, 趙星, 胡秀英, 趙會玲, 左浩江. 西南區域核心地區中老年男性自然人群飲酒量與口腔菌群關系初探. 華西醫學, 2021, 36(2): 230-237. doi: 10.7507/1002-0179.201910096 復制
飲酒可以提升興奮度，在全球范圍，飲酒都是社會各階層親朋聚會和商業社交的重要元素，但任何水平的飲酒都不能促進健康[1]。長期大量飲酒不僅會產生酒精依賴，影響工作和家庭，還會增加口腔癌、咽癌、食道癌、結腸直腸癌、肝癌、喉癌和女性乳腺癌的風險，危害健康[2-4]。以口腔鱗狀細胞癌為例，多數病例在癌癥晚期才被發現，預后不良[5]。因此，針對腫瘤及其危險因素的早期診斷，特別是對有著較高飲酒率的中國中老年男性[6]至關重要。口腔細菌參與炎癥并與多種癌癥的發展相關。現有研究多聚焦于口腔菌群作為癌癥生物標志物的可能性[5, 7-8]，但對口腔菌群與酒精等癌癥危險因素生物標志物的探索仍然有限[9-11]。而在癌癥負擔高于全國的西南區域[12]，相關研究未見報道。基于菌群的地域差異[13]，本研究為尋找西南區域核心地區中老年男性自然人群中超量飲酒標志物，采用高通量二代測序技術，并結合飲酒問卷探索目標人群不同飲酒量對口腔菌群多樣性的影響，尋找西南區域核心地區中老年男性中超量飲酒標志物，初步探討超量飲酒相關菌群與飲酒相關癌癥的關系，為促進我國西南區域大健康和精準預防提供參考。
1 資料與方法
1.1 研究對象
2018 年 3 月－6 月，在西南區域核心地區隨機選擇一社區進行采樣，篩選調查對象。納入標準（全部滿足）：① 年齡 40～79 歲；② 漢族；③ 男性；④ 在成都地區常住半年及以上（調查前 12 個月內在成都居住時間≥6 個月）；⑤ 自愿參加項目，同意采集生物樣本并簽署知情同意書；⑥ 健康狀況：經社區醫生核查，受試者無任何惡性腫瘤病史及化學治療、放射治療史，無任何不良藥物使用史（嗎啡及相關類型藥物的依賴性非藥物性使用史），無任何器官移植等原因需要長期服用免疫抑制劑病史，無明確的乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、梅毒、艾滋病等疾病史，無精神性疾患或其他相關疾病；⑦ 近期無服用或者注射抗菌藥物史；⑧ 表達和理解能力正常。排除標準（滿足其一）：① 不愿實名身份登記者；② 患有嚴重殘疾不能接受檢查者；③ 有明顯口腔疾病；④ 唾液菌群測序失敗或未達分析標準。本研究已通過四川大學華西公共衛生學院倫理委員會審批（2018309）。
1.2 研究方法
1.2.1 分組
根據調查對象特征，設置超量飲酒組、適量飲酒組、不飲酒組。根據《中國居民膳食指南（2016）》[14]，對男性飲酒者，將每天飲用超過 25 g 酒精（等同于日飲酒量>50 mL 高度白酒、75 mL 38% 酒精度白酒、250 mL 葡萄酒或 750 mL 啤酒）的調查對象歸入超量飲酒組，將每天飲用不超過 25 g 酒精者歸入適量飲酒組，將不飲酒者歸入不飲酒組。
1.2.2 主要材料及設備
制冰機（SIM-F140AY65-PC），購自日本松下電器產業株式會社；?80℃ 冰箱（DW-HL858S），購自中國青島海爾股份有限公司；GenMagBio 全自動核酸提取純化儀，購自中國金麥格生物技術有限公司；Agilent 2100 生物分析儀，購自美國 Agilent Technologies 公司；Qubit3.0 熒光定量儀，購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；MiSeq 測序平臺，購自美國 Illumina 公司；GenMag 細菌基因組 DNA 提取試劑盒，購自中國金麥格生物技術有限公司；KAPA HiFi HotStart PCR 試劑盒，購自美國 Kapa Biosystems 公司；Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒，購自美國 Beckman Coulter 公司；MiSeq Reagent V2 Kits 測序試劑盒，購自美國 Illumina 公司。
1.2.3 問卷調查
在簽署知情同意書后，對調查對象進行問卷調查。問卷調查參考《西南區域自然人群隊列研究》問卷[15]，收集調查對象的人口統計學信息（姓名、性別、民族、身高、體重、出生日期、婚姻狀況、教育水平、職業、家庭成員、家庭經濟、居住狀態）、健康情況（用藥史、疾病史等）、行為方式（運動、睡眠等）及目標變量（飲酒史）的相關信息。
1.2.4 樣品采集
調查對象用純凈水漱口后進行 1.2.3 的問卷調查，在問卷調查完畢后（>10 min），再讓調查對象將唾液吐入事先準備好的樣本杯中，要求唾液量盡量到達 3.0 mL 且不能有痰液，然后蓋上樣本杯蓋子，記錄采樣信息后放入裝有冰盒的凍存盒中在 3 h 內低溫運輸至實驗室，用 2 mL 凍存管分裝，保存于?80℃ 冰箱。
1.2.5 16S 核糖體 RNA（ribosomal RNA，rRNA）基因測序
唾液樣本送至人和未來生物科技（長沙）有限公司提取核酸建庫測序。采用 GenMag 細菌基因組提取試劑盒提取核酸。合成引物，341F：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，805R：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’[16]，以 16S rRNA 基因的 V3-V4 區為擴增子區域構建文庫，于 Illumina MiSeq 平臺進行 PE250 雙端測序。
基于 QIIME 1.17 軟件對下機數據進行分離過濾、數據拼接，以相似度>97% 聚類成“操作分類單元”（operational taxonomic unit，OTU），將 OTU 序列比對到 Silva 細菌 16S 數據庫上進行物種注釋，獲得樣本菌群組成。
1.3 統計學方法
采用 R 3.6.0、SPSS 20.0、Python 3.7 軟件進行統計分析及制圖。計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用例數表示。組間比較時，年齡采用單因素方差分析，吸煙情況采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，體質量指數（body mass index，BMI）（參考《中國成人超重和肥胖癥預防控制指南》[17]的建議：BMI≥24 kg/m2 者為超重）采用 χ2 檢驗。雙側檢驗水準取 α=0.05。
以測序獲得的 OTU 表格為基礎數據，以觀察到的 OTU 數指示豐富度，均一化處理后通過單因素方差分析和 SNK 法分別在不飲酒組、適量飲酒組、超量飲酒組間兩兩比較各組間 α 多樣性（豐富度、多樣性）的差異，包括豐富度覆蓋估算（abundance-based coverage estimator，ACE）指數、Chao1 指數、香農指數（Shannon 指數）、辛普森指數（Simpson 指數）[18]；用計算 UniFrac 距離的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）比較 β 多樣性[19]；基于 R 的 stats 包和 Python 的 scipy 包對生物分類學為屬的水平進行組間豐富度差異分析（基于親緣關系，菌群可按門、綱、目、科、屬進行分類。通常微生物在屬水平有較穩定的特性，因此本研究對生物分類學為屬的水平組間差異進行分析），尋找具有差異的菌屬，采用 Spearman 等級相關計算口腔菌群與飲酒強度的相關性；基于R 的 randomForest 包和 plotROC 包通過隨機森林分析和受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析并獲得曲線下面積（area under curve，AUC）值進行西南區域人群飲酒標志物（口腔細菌）的探索[20-21]（0.5≤AUC<0.7 有較低準確性，0.7≤AUC<0.9 有一定準確性，AUC≥0.9 有較高準確性）；采用隱性狀態重建群落進化分析（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析預測不同飲酒量下中老年男性的口腔菌群功能；采用物種累積曲線觀察樣本量是否充足。上述資料涉及組間比較時，各組均滿足正態性檢驗的采用單因素方差分析，組間差異若有統計學意義則進一步采用 Dunnett-t 檢驗以不飲酒組為參照進行兩兩比較；不全滿足正態分布的采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，組間差異若有統計學意義則進一步采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗以不飲酒組為參照進行兩兩比較，并采用錯誤發現率法校正 P 值。雙側檢驗水準取 α=0.05。
2 結果
2.1 人口統計學特征
共納入 59 例漢族男性調查對象。其中，不飲酒組 23 例（39.0%），適量飲酒組 23 例（39.0%），超量飲酒組 13 例（22.0%）。參與者平均年齡（61.90±8.85）歲，3 組年齡、BMI 比較，差異均無統計學意義（P>0.05），但吸煙情況差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
人口統計學特征及菌群 α 多樣性
2.2 α 多樣性分析
各樣本下機數據的測序質量值 Q20（錯誤識別的概率為 1% 的堿基）均大于 95%，Q30（錯誤識別的概率為 0.1% 的堿基）均大于 93%，符合測序公司實驗室內部的測序質量合格標準。且 OTU 抽平后，各樣本稀釋曲線趨于平緩，提示測序數據量合理，足以反映該樣本中絕大部分菌群的多樣性信息。各組 α 多樣性分析的結果見表 1。與不飲酒組和適量飲酒組相比，超量飲酒組 ACE 指數增加，差異有統計學意義（P=0.017、0.025），Chao1 指數增加，差異有統計學意義（P=0.005、0.016）；其余各組間多樣性指數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3 β 多樣性分析
PCoA 分析結果見圖 1a，各組樣本點并未出現明顯的聚集情況。在貢獻度為 18.72% 的第一主坐標下，各組在第一主坐標位置也無顯著差異（圖 1b），提示飲酒并未明顯改變口腔菌群的 β 多樣性。
圖1
PCoA 分析及其第一主坐標分布
a. PCoA 分析；b. PCoA 分析第一主坐標分布。non：不飲酒組，mo：適量飲酒組，ex：超量飲酒組
2.4 組間豐富度差異分析
不飲酒組 α 變形菌綱未分類菌（unclassified_c_Alphaproteobacteria）顯著低于適量飲酒組和超量飲酒組，適量飲酒組消化鏈球菌科［XI］［G-7］菌（Peptostreptococcaceae_［XI］［G-7］）顯著低于不飲酒組和超量飲酒組，超量飲酒組消化鏈球菌（Peptostreptococcus）、TM7 門［G-6］菌（TM7_［G-6］）顯著高于不飲酒組和適量飲酒組。見圖 2。
圖2
組間豐富度差異檢驗
a. 不飲酒組與適量飲酒組屬水平差異分析；b. 不飲酒組與超量飲酒組屬水平差異分析；c. 適量飲酒組與超量飲酒組屬水平組間差異分析。縱坐標為兩組比較有差異的菌屬；non：不飲酒組，mo：適量飲酒組，ex：超量飲酒組
2.5 口腔菌群與飲酒量的相關分析
采用 Spearman 等級相關計算口腔菌群豐度與飲酒強度的相關性，發現 α 變形菌綱未分類菌（unclassified_c_Alphaproteobacteria）（rs=0.277，P=0.022）、凝聚桿菌（Aggregatibacter）（rs=0.273，P=0.015）、羅氏菌（Rothia）（rs=0.276，P=0.040）、錐形桿菌（Pyramidobacter）（rs=0.261，P=0.042）、苛求球菌（Fastidiosipila）（rs=0.282，P=0.031）與飲酒量呈正相關（圖 3）。
圖3
口腔菌群與飲酒強度的相關分析散點圖
a. 飲酒分組與 α 變形菌綱未分類菌豐富度散點圖；b. 飲酒分組與凝聚桿菌豐富度散點圖；c. 飲酒分組與羅氏菌豐富度散點圖；d. 飲酒分組與錐形桿菌豐富度散點圖；e. 飲酒分組與苛求球菌豐富度散點圖。non：不飲酒組，mo：適量飲酒組，ex：超量飲酒組
2.6 ROC 曲線分析
通過隨機森林分析，挑選出對樣本分類最關鍵的物種。隨機森林分析發現，毛螺菌科［G-8］菌（Lachnosipiraceae-［G-8］）、硬壁門未分類菌（unclassified_p_Firmicutes）、TM7 門［G-6］菌（TM7_ ［G_6］）是不飲酒組與超量飲酒組的重要差異菌株（圖 4a）。將上述 3 種菌進行 ROC 曲線分析，獲得 AUC 值為 0.915（圖 4b）。
圖4
不飲酒組與超量飲酒組口腔菌群的模型預測分析
a. 隨機森林分析屬水平變量重要性點圖；b. 屬水平的 ROC 分析
2.7 不同飲酒量組口腔菌群功能預測
運用 PICRUSt 基于 KEGG 數據集和 OTU 值統計各代謝通路的豐度表，預測不同飲酒量組口腔菌群功能變化。預測結果發現，與不飲酒組相比，超量飲酒組在癌癥相關通路水平變化差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
不同飲酒量組口腔菌群功能預測
2.8 物種累積曲線
本研究根據生物樣本 16S rRNA 基因測序結果繪制的物種累積曲線（圖 5），發現當樣本量為 50 時曲線已趨于平緩，說明當前的樣本量（n=59）可反映口腔菌群的真實存在情況。
圖5
物種累積曲線
紅線對應本研究樣本量（
3 討論
本研究探討了西南區域核心地區中老年男性自然人群飲酒量與唾液口腔菌群的關系。在排除性別[22]、年齡、種族、BMI 對口腔菌群影響的前提下，本研究發現在 α 多樣性上，超量飲酒組、適量飲酒組的豐富度 ACE 指數和豐富度 Chao1 指數增加（P<0.05），結果與已有報道[9]一致，提示酒精可影響口腔菌群菌落總數。這可能與酒精直接和間接改變口腔細菌生長環境，降低唾液 pH 值，提高齲齒、牙周炎和黏膜病變患病率有關[23-24]。
本研究在菌群結構 PCoA 分析中未見飲酒水平使微生物群落結構有明顯變化。Fan 等[9]基于美國人群的研究發現，重度飲酒者和中度飲酒者在 PCoA 分析的第一個主坐標上與非飲酒人群有統計學差異，這可能與中美居民膳食指南中超量飲酒標準、樣本量及人種差異等有關[14, 25-26]。
本研究在菌群種類分析發現，超量飲酒組消化鏈球菌，TM7 門［G-6］菌豐富度顯著高于不飲酒組和適量飲酒組，不飲酒組 α 變形菌綱未分類菌顯著低于適量飲酒組。此外，本研究在 Spearman 相關分析中也發現，α 變形菌綱未分類菌等細菌豐度與飲酒量呈正相關。結果提示，飲酒量差異可能改變特定口腔菌群種類豐度。Pushalkar 等[27]研究發現，與對照組相比消化鏈球菌是口腔鱗狀細胞癌人群中最常見的菌屬之一。而近期研究也發現，消化鏈球菌可望成為口腔鱗狀細胞癌的菌群標志物之一[9]。由于消化鏈球菌與慢性炎癥相關[28]，結合本研究發現，我們推測酒精作為口腔鱗狀細胞癌的危險因素改變口腔菌群，提高消化鏈球菌豐度，促進慢性炎癥，改變癌癥相關通路，進而刺激口腔鱗狀細胞癌的發生。
本研究通過 ROC 曲線分析發現 3 個屬的口腔菌群可有效區分超量飲酒人群與不飲酒人群，這 3 個屬細菌組成的變化可能具有構成生物標志物的潛力。考慮到菌群受地域飲食等因素影響[13]，該發現可為西南區域自然人群中超量飲酒相關疾病的標志物探索提供依據。需要說明的是，從整體上看，ROC 曲線分析結果與相關性分析結果應有部分一致，但本研究中兩種結果在個位數水平（僅有幾個菌的結果）未見重疊，我們推測這可能與口腔菌群種類有上百種之多，及兩種分析方法不同有關。
盡管本研究有出現存在統計學意義的組間差距，但西南地區中老年人數龐大，在后續的研究中，可以考慮增大樣本量、多點采樣等方式進一步增加樣本的代表性，使得結果更具有普適性。另外，由于本研究的調查對象的吸煙情況在各組間不全相同，可能會對結果造成影響，在將來的研究中需加以控制。
綜上，本研究采集 59 例西南區域漢族男性自然人群唾液樣本進行 16S rRNA 基因測序，結合飲酒問卷調查，發現超量飲酒可提高口腔菌群豐富度，改變消化鏈球菌、TM7 門［G-6］菌等特定菌種豐度，調節癌癥相關通路。ROC 曲線分析發現 TM7 門［G-6］菌等 3 種菌屬可有效區分目標人群中不飲酒組與超量飲酒組。結合已有文獻發現，消化鏈球菌等與超量飲酒相關的口腔菌群與口腔癌關系密切。該研究可望為癌癥危險因素生物標志物的探索提供參考。
飲酒可以提升興奮度，在全球范圍，飲酒都是社會各階層親朋聚會和商業社交的重要元素，但任何水平的飲酒都不能促進健康[1]。長期大量飲酒不僅會產生酒精依賴，影響工作和家庭，還會增加口腔癌、咽癌、食道癌、結腸直腸癌、肝癌、喉癌和女性乳腺癌的風險，危害健康[2-4]。以口腔鱗狀細胞癌為例，多數病例在癌癥晚期才被發現，預后不良[5]。因此，針對腫瘤及其危險因素的早期診斷，特別是對有著較高飲酒率的中國中老年男性[6]至關重要。口腔細菌參與炎癥并與多種癌癥的發展相關。現有研究多聚焦于口腔菌群作為癌癥生物標志物的可能性[5, 7-8]，但對口腔菌群與酒精等癌癥危險因素生物標志物的探索仍然有限[9-11]。而在癌癥負擔高于全國的西南區域[12]，相關研究未見報道。基于菌群的地域差異[13]，本研究為尋找西南區域核心地區中老年男性自然人群中超量飲酒標志物，采用高通量二代測序技術，并結合飲酒問卷探索目標人群不同飲酒量對口腔菌群多樣性的影響，尋找西南區域核心地區中老年男性中超量飲酒標志物，初步探討超量飲酒相關菌群與飲酒相關癌癥的關系，為促進我國西南區域大健康和精準預防提供參考。
1 資料與方法
1.1 研究對象
2018 年 3 月－6 月，在西南區域核心地區隨機選擇一社區進行采樣，篩選調查對象。納入標準（全部滿足）：① 年齡 40～79 歲；② 漢族；③ 男性；④ 在成都地區常住半年及以上（調查前 12 個月內在成都居住時間≥6 個月）；⑤ 自愿參加項目，同意采集生物樣本并簽署知情同意書；⑥ 健康狀況：經社區醫生核查，受試者無任何惡性腫瘤病史及化學治療、放射治療史，無任何不良藥物使用史（嗎啡及相關類型藥物的依賴性非藥物性使用史），無任何器官移植等原因需要長期服用免疫抑制劑病史，無明確的乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、梅毒、艾滋病等疾病史，無精神性疾患或其他相關疾病；⑦ 近期無服用或者注射抗菌藥物史；⑧ 表達和理解能力正常。排除標準（滿足其一）：① 不愿實名身份登記者；② 患有嚴重殘疾不能接受檢查者；③ 有明顯口腔疾病；④ 唾液菌群測序失敗或未達分析標準。本研究已通過四川大學華西公共衛生學院倫理委員會審批（2018309）。
1.2 研究方法
1.2.1 分組
根據調查對象特征，設置超量飲酒組、適量飲酒組、不飲酒組。根據《中國居民膳食指南（2016）》[14]，對男性飲酒者，將每天飲用超過 25 g 酒精（等同于日飲酒量>50 mL 高度白酒、75 mL 38% 酒精度白酒、250 mL 葡萄酒或 750 mL 啤酒）的調查對象歸入超量飲酒組，將每天飲用不超過 25 g 酒精者歸入適量飲酒組，將不飲酒者歸入不飲酒組。
1.2.2 主要材料及設備
制冰機（SIM-F140AY65-PC），購自日本松下電器產業株式會社；?80℃ 冰箱（DW-HL858S），購自中國青島海爾股份有限公司；GenMagBio 全自動核酸提取純化儀，購自中國金麥格生物技術有限公司；Agilent 2100 生物分析儀，購自美國 Agilent Technologies 公司；Qubit3.0 熒光定量儀，購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；MiSeq 測序平臺，購自美國 Illumina 公司；GenMag 細菌基因組 DNA 提取試劑盒，購自中國金麥格生物技術有限公司；KAPA HiFi HotStart PCR 試劑盒，購自美國 Kapa Biosystems 公司；Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒，購自美國 Beckman Coulter 公司；MiSeq Reagent V2 Kits 測序試劑盒，購自美國 Illumina 公司。
1.2.3 問卷調查
在簽署知情同意書后，對調查對象進行問卷調查。問卷調查參考《西南區域自然人群隊列研究》問卷[15]，收集調查對象的人口統計學信息（姓名、性別、民族、身高、體重、出生日期、婚姻狀況、教育水平、職業、家庭成員、家庭經濟、居住狀態）、健康情況（用藥史、疾病史等）、行為方式（運動、睡眠等）及目標變量（飲酒史）的相關信息。
1.2.4 樣品采集
調查對象用純凈水漱口后進行 1.2.3 的問卷調查，在問卷調查完畢后（>10 min），再讓調查對象將唾液吐入事先準備好的樣本杯中，要求唾液量盡量到達 3.0 mL 且不能有痰液，然后蓋上樣本杯蓋子，記錄采樣信息后放入裝有冰盒的凍存盒中在 3 h 內低溫運輸至實驗室，用 2 mL 凍存管分裝，保存于?80℃ 冰箱。
1.2.5 16S 核糖體 RNA（ribosomal RNA，rRNA）基因測序
唾液樣本送至人和未來生物科技（長沙）有限公司提取核酸建庫測序。采用 GenMag 細菌基因組提取試劑盒提取核酸。合成引物，341F：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，805R：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’[16]，以 16S rRNA 基因的 V3-V4 區為擴增子區域構建文庫，于 Illumina MiSeq 平臺進行 PE250 雙端測序。
基于 QIIME 1.17 軟件對下機數據進行分離過濾、數據拼接，以相似度>97% 聚類成“操作分類單元”（operational taxonomic unit，OTU），將 OTU 序列比對到 Silva 細菌 16S 數據庫上進行物種注釋，獲得樣本菌群組成。
1.3 統計學方法
采用 R 3.6.0、SPSS 20.0、Python 3.7 軟件進行統計分析及制圖。計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用例數表示。組間比較時，年齡采用單因素方差分析，吸煙情況采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，體質量指數（body mass index，BMI）（參考《中國成人超重和肥胖癥預防控制指南》[17]的建議：BMI≥24 kg/m2 者為超重）采用 χ2 檢驗。雙側檢驗水準取 α=0.05。
以測序獲得的 OTU 表格為基礎數據，以觀察到的 OTU 數指示豐富度，均一化處理后通過單因素方差分析和 SNK 法分別在不飲酒組、適量飲酒組、超量飲酒組間兩兩比較各組間 α 多樣性（豐富度、多樣性）的差異，包括豐富度覆蓋估算（abundance-based coverage estimator，ACE）指數、Chao1 指數、香農指數（Shannon 指數）、辛普森指數（Simpson 指數）[18]；用計算 UniFrac 距離的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）比較 β 多樣性[19]；基于 R 的 stats 包和 Python 的 scipy 包對生物分類學為屬的水平進行組間豐富度差異分析（基于親緣關系，菌群可按門、綱、目、科、屬進行分類。通常微生物在屬水平有較穩定的特性，因此本研究對生物分類學為屬的水平組間差異進行分析），尋找具有差異的菌屬，采用 Spearman 等級相關計算口腔菌群與飲酒強度的相關性；基于R 的 randomForest 包和 plotROC 包通過隨機森林分析和受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析并獲得曲線下面積（area under curve，AUC）值進行西南區域人群飲酒標志物（口腔細菌）的探索[20-21]（0.5≤AUC<0.7 有較低準確性，0.7≤AUC<0.9 有一定準確性，AUC≥0.9 有較高準確性）；采用隱性狀態重建群落進化分析（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析預測不同飲酒量下中老年男性的口腔菌群功能；采用物種累積曲線觀察樣本量是否充足。上述資料涉及組間比較時，各組均滿足正態性檢驗的采用單因素方差分析，組間差異若有統計學意義則進一步采用 Dunnett-t 檢驗以不飲酒組為參照進行兩兩比較；不全滿足正態分布的采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，組間差異若有統計學意義則進一步采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗以不飲酒組為參照進行兩兩比較，并采用錯誤發現率法校正 P 值。雙側檢驗水準取 α=0.05。
2 結果
2.1 人口統計學特征
共納入 59 例漢族男性調查對象。其中，不飲酒組 23 例（39.0%），適量飲酒組 23 例（39.0%），超量飲酒組 13 例（22.0%）。參與者平均年齡（61.90±8.85）歲，3 組年齡、BMI 比較，差異均無統計學意義（P>0.05），但吸煙情況差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
人口統計學特征及菌群 α 多樣性
2.2 α 多樣性分析
各樣本下機數據的測序質量值 Q20（錯誤識別的概率為 1% 的堿基）均大于 95%，Q30（錯誤識別的概率為 0.1% 的堿基）均大于 93%，符合測序公司實驗室內部的測序質量合格標準。且 OTU 抽平后，各樣本稀釋曲線趨于平緩，提示測序數據量合理，足以反映該樣本中絕大部分菌群的多樣性信息。各組 α 多樣性分析的結果見表 1。與不飲酒組和適量飲酒組相比，超量飲酒組 ACE 指數增加，差異有統計學意義（P=0.017、0.025），Chao1 指數增加，差異有統計學意義（P=0.005、0.016）；其余各組間多樣性指數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3 β 多樣性分析
PCoA 分析結果見圖 1a，各組樣本點并未出現明顯的聚集情況。在貢獻度為 18.72% 的第一主坐標下，各組在第一主坐標位置也無顯著差異（圖 1b），提示飲酒并未明顯改變口腔菌群的 β 多樣性。
圖1
PCoA 分析及其第一主坐標分布
a. PCoA 分析；b. PCoA 分析第一主坐標分布。non：不飲酒組，mo：適量飲酒組，ex：超量飲酒組
2.4 組間豐富度差異分析
不飲酒組 α 變形菌綱未分類菌（unclassified_c_Alphaproteobacteria）顯著低于適量飲酒組和超量飲酒組，適量飲酒組消化鏈球菌科［XI］［G-7］菌（Peptostreptococcaceae_［XI］［G-7］）顯著低于不飲酒組和超量飲酒組，超量飲酒組消化鏈球菌（Peptostreptococcus）、TM7 門［G-6］菌（TM7_［G-6］）顯著高于不飲酒組和適量飲酒組。見圖 2。
圖2
組間豐富度差異檢驗
a. 不飲酒組與適量飲酒組屬水平差異分析；b. 不飲酒組與超量飲酒組屬水平差異分析；c. 適量飲酒組與超量飲酒組屬水平組間差異分析。縱坐標為兩組比較有差異的菌屬；non：不飲酒組，mo：適量飲酒組，ex：超量飲酒組
2.5 口腔菌群與飲酒量的相關分析
采用 Spearman 等級相關計算口腔菌群豐度與飲酒強度的相關性，發現 α 變形菌綱未分類菌（unclassified_c_Alphaproteobacteria）（rs=0.277，P=0.022）、凝聚桿菌（Aggregatibacter）（rs=0.273，P=0.015）、羅氏菌（Rothia）（rs=0.276，P=0.040）、錐形桿菌（Pyramidobacter）（rs=0.261，P=0.042）、苛求球菌（Fastidiosipila）（rs=0.282，P=0.031）與飲酒量呈正相關（圖 3）。
圖3
口腔菌群與飲酒強度的相關分析散點圖
a. 飲酒分組與 α 變形菌綱未分類菌豐富度散點圖；b. 飲酒分組與凝聚桿菌豐富度散點圖；c. 飲酒分組與羅氏菌豐富度散點圖；d. 飲酒分組與錐形桿菌豐富度散點圖；e. 飲酒分組與苛求球菌豐富度散點圖。non：不飲酒組，mo：適量飲酒組，ex：超量飲酒組
2.6 ROC 曲線分析
通過隨機森林分析，挑選出對樣本分類最關鍵的物種。隨機森林分析發現，毛螺菌科［G-8］菌（Lachnosipiraceae-［G-8］）、硬壁門未分類菌（unclassified_p_Firmicutes）、TM7 門［G-6］菌（TM7_ ［G_6］）是不飲酒組與超量飲酒組的重要差異菌株（圖 4a）。將上述 3 種菌進行 ROC 曲線分析，獲得 AUC 值為 0.915（圖 4b）。
圖4
不飲酒組與超量飲酒組口腔菌群的模型預測分析
a. 隨機森林分析屬水平變量重要性點圖；b. 屬水平的 ROC 分析
2.7 不同飲酒量組口腔菌群功能預測
運用 PICRUSt 基于 KEGG 數據集和 OTU 值統計各代謝通路的豐度表，預測不同飲酒量組口腔菌群功能變化。預測結果發現，與不飲酒組相比，超量飲酒組在癌癥相關通路水平變化差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
不同飲酒量組口腔菌群功能預測
2.8 物種累積曲線
本研究根據生物樣本 16S rRNA 基因測序結果繪制的物種累積曲線（圖 5），發現當樣本量為 50 時曲線已趨于平緩，說明當前的樣本量（n=59）可反映口腔菌群的真實存在情況。
圖5
物種累積曲線
紅線對應本研究樣本量（
3 討論
本研究探討了西南區域核心地區中老年男性自然人群飲酒量與唾液口腔菌群的關系。在排除性別[22]、年齡、種族、BMI 對口腔菌群影響的前提下，本研究發現在 α 多樣性上，超量飲酒組、適量飲酒組的豐富度 ACE 指數和豐富度 Chao1 指數增加（P<0.05），結果與已有報道[9]一致，提示酒精可影響口腔菌群菌落總數。這可能與酒精直接和間接改變口腔細菌生長環境，降低唾液 pH 值，提高齲齒、牙周炎和黏膜病變患病率有關[23-24]。
本研究在菌群結構 PCoA 分析中未見飲酒水平使微生物群落結構有明顯變化。Fan 等[9]基于美國人群的研究發現，重度飲酒者和中度飲酒者在 PCoA 分析的第一個主坐標上與非飲酒人群有統計學差異，這可能與中美居民膳食指南中超量飲酒標準、樣本量及人種差異等有關[14, 25-26]。
本研究在菌群種類分析發現，超量飲酒組消化鏈球菌，TM7 門［G-6］菌豐富度顯著高于不飲酒組和適量飲酒組，不飲酒組 α 變形菌綱未分類菌顯著低于適量飲酒組。此外，本研究在 Spearman 相關分析中也發現，α 變形菌綱未分類菌等細菌豐度與飲酒量呈正相關。結果提示，飲酒量差異可能改變特定口腔菌群種類豐度。Pushalkar 等[27]研究發現，與對照組相比消化鏈球菌是口腔鱗狀細胞癌人群中最常見的菌屬之一。而近期研究也發現，消化鏈球菌可望成為口腔鱗狀細胞癌的菌群標志物之一[9]。由于消化鏈球菌與慢性炎癥相關[28]，結合本研究發現，我們推測酒精作為口腔鱗狀細胞癌的危險因素改變口腔菌群，提高消化鏈球菌豐度，促進慢性炎癥，改變癌癥相關通路，進而刺激口腔鱗狀細胞癌的發生。
本研究通過 ROC 曲線分析發現 3 個屬的口腔菌群可有效區分超量飲酒人群與不飲酒人群，這 3 個屬細菌組成的變化可能具有構成生物標志物的潛力。考慮到菌群受地域飲食等因素影響[13]，該發現可為西南區域自然人群中超量飲酒相關疾病的標志物探索提供依據。需要說明的是，從整體上看，ROC 曲線分析結果與相關性分析結果應有部分一致，但本研究中兩種結果在個位數水平（僅有幾個菌的結果）未見重疊，我們推測這可能與口腔菌群種類有上百種之多，及兩種分析方法不同有關。
盡管本研究有出現存在統計學意義的組間差距，但西南地區中老年人數龐大，在后續的研究中，可以考慮增大樣本量、多點采樣等方式進一步增加樣本的代表性，使得結果更具有普適性。另外，由于本研究的調查對象的吸煙情況在各組間不全相同，可能會對結果造成影響，在將來的研究中需加以控制。
綜上，本研究采集 59 例西南區域漢族男性自然人群唾液樣本進行 16S rRNA 基因測序，結合飲酒問卷調查，發現超量飲酒可提高口腔菌群豐富度，改變消化鏈球菌、TM7 門［G-6］菌等特定菌種豐度，調節癌癥相關通路。ROC 曲線分析發現 TM7 門［G-6］菌等 3 種菌屬可有效區分目標人群中不飲酒組與超量飲酒組。結合已有文獻發現，消化鏈球菌等與超量飲酒相關的口腔菌群與口腔癌關系密切。該研究可望為癌癥危險因素生物標志物的探索提供參考。
