引用本文： 王友麗, 陳菊屏, 萬運強. 姜黃素對脂多糖誘導肺泡巨噬細胞炎癥、凋亡影響及機制. 華西醫學, 2020, 35(2): 192-197. doi: 10.7507/1002-0179.201910090 復制
脂多糖來源于革蘭陰性菌，是一種炎癥刺激物，當其作用于人類或動物等其他生物細胞時將表現出多種生物活性，引發炎癥的發生、機體感染，最終導致機體發生一系列損傷，包括肺相關性損傷[1]。姜黃素是姜黃中的一種多酚，具有降血脂、抗凝、抗氧化、利膽、抗癌、抗炎癥、抗凋亡等作用[2-3]。然而，姜黃素在脂多糖誘導的肺相關性損傷中的保護作用及其作用機制還不清楚。微 RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼單鏈 RNA 分子，主要通過影響靶信使 RNA 穩定性和/或轉錄后調控發揮作用，從而參與多種疾病的發生發展過程[4]。既往相關研究證實， miRNA-132（miR-132）能通過膽堿能抗炎途徑抑制脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥，在調節炎癥反應中發揮了重要作用[5]。因此，本研究探討了姜黃素對脂多糖刺激下肺泡巨噬細胞（RAW264.7）的炎癥及凋亡影響以及 miR-132 和下游基因是否參與這個過程，來探討姜黃素對脂多糖誘導肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡的保護作用及機制，從而為肺相關性損傷保護及治療提供更多的依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
小鼠肺泡巨噬細胞（RAW 264.7）（中國醫學科學院細胞培養中心），脂多糖（美國 Sigma 公司），姜黃素（成都赫布瑞有限公司），空載體、人工合成的 miR-132 類似物及抑制劑（天津賽爾有限公司），酶聯免疫吸附測定試劑盒（美國 R&D Systems 公司），蛋白抗體（美國 Abcam 公司），小 RNA 試劑盒（美國 Omega 公司），逆轉錄試劑盒（日本 ToYoBo 公司），流式細胞儀（型號：FACSCanto II，美國 Becton–Dickinson 公司），abi-7500 定量實時聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）系統（型號：7500 Fast Real-Time PCR System，美國 Applied Biosystems 公司）。
1.2 細胞培養
1.2.1 姜黃素處理肺泡巨噬細胞培養
小鼠肺泡巨噬細胞培養于 Dulbecco 改良 Eagle 培養基完全培養基（10% 胎牛血清+100 μg/mL 鏈霉素+100 U/mL 青霉素，37℃、5% 二氧化碳）。將培養的細胞分為 4 組，分別為對照組（細胞未進行任何處理）、脂多糖處理組（100 μg/mL 脂多糖處理細胞）、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組（細胞培養基中加入 100 μg/mL 脂多糖和 50 μmol/L 姜黃素進行處理）及脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組（細胞培養基中加入 100 μg/mL 脂多糖和 100 μmol/L 姜黃素進行處理）。藥物處理 48 h 后，進行后續實驗（包括炎癥因子、凋亡、基因及蛋白檢測），每組實驗重復 3 次。
1.2.2 miRNA 轉染肺泡巨噬細胞培養
培養未進行任何處理的小鼠肺泡巨噬細胞［使用上述同一時間同一批號的小鼠肺泡巨噬細胞（RAW 264.7）］，將其分為 3 組（空白組、miR-132 類似物組、miR-132 抑制劑組），用于后續轉染 miR-132 表達實驗。
1.3 基因及 miRNA 測定
根據 miRNA 提取試劑盒的操作說明，分別提取各組（對照組、脂多糖處理組、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組、脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組）肺泡巨噬細胞總 RNA，通過紫外分光光度計方法檢測提取 RNA 的濃度及純度，通過瓊脂糖凝膠電泳方法檢測提取 RNA 的完整性，根據逆轉錄試劑盒的操作說明，2 μg RNA 樣品逆轉錄為互補 DNA。通過 abi-7500 qRT-PCR 系統檢測高遷移率族蛋白 B1（high mobility group protein B1，HMGB1）基因及 miR-132 表達，U6 作為 miR-132 的內參，β-actin 作為 HMGB1 的內參，基因及 miRNA 相對表達通過 2?ΔΔct 方法進行計算，HMGB1 引物設計為：5′-GATGGGCAAAGGAGATCCTA-3′（正向）和 5′-CTTGGTCTCCCTTTGGGG-3′（反向）[6]。
1.4 蛋白測定
對照組、脂多糖處理組、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組及脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組的肺泡巨噬細胞收集后用放射免疫沉淀法裂解液進行裂解，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，各組取 50 μg 總蛋白進行 10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，200 mA 電流轉移到聚偏氟乙烯膜上，5% 脫脂牛奶封閉膜，一抗 4℃ 孵育過夜（HMGB1），然后，室溫下二抗孵育 2 h，用電化學發光液對蛋白印跡條帶進行顯影，最后條帶通過 Quantity One 軟件（版本 4.0）掃描和量化。
1.5 細胞凋亡測定
根據［膜聯蛋白 V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）］/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法使用操作說明，磷酸鹽緩沖液洗滌不同實驗組（對照組、脂多糖處理組、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組及脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組）肺泡巨噬細胞，膜聯蛋白 V 染色，20 min 后，流式細胞儀（美國 Becton–Dickinson 公司）分析細胞凋亡情況。
1.6 炎癥因子測定
根據酶聯免疫吸附法試劑盒使用操作說明，通過酶聯免疫吸附法測定不同實驗組（對照組、脂多糖處理組、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組及脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組）肺泡巨噬細胞中白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 表達水平。
1.7 miRNA 轉染
根據 miRNA 轉染系統使用操作說明，將空載體、人工合成的 miR-132 類似物及抑制劑通過 lipofectamine 2000 系統分別轉染至未另外進行任何處理的 1.2.2 中的小鼠肺泡巨噬細胞，分為空白組、miR-132 類似物組、miR-132 抑制劑組，誘導 miR-132 在正常巨噬細胞中的不同表達，24 h 后，進行后續實驗（包括炎癥因子、凋亡及基因檢測），相關實驗步驟同實驗步驟 1.3、1.5、1.6，每組實驗重復 3 次。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，方差齊時組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 法；方差不齊時組間比較采用秩和檢驗。計數資料以只數和百分比表示。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 姜黃素對肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥因子的影響
相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞凋亡增加，IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平升高（P<0.05）；相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞凋亡減少，IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平降低（P<0.05），且姜黃素濃度越大，作用越明顯（P<0.05）。見圖 1、表 1。
圖1
各組流式細胞圖
a. 對照組；b. 脂多糖組；c. 脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組；d. 脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組。橫坐標/縱坐標表示 FITC/PI 熒光信號相對強度的值；Q1-UL：死亡細胞，Q1-UR：晚期凋亡細胞，Q1-LL：正常細胞，Q1-LR：早期凋亡細胞；圖中的百分比代表每個區域細胞率，總和為 100%
表1
各組炎癥水平、miR-132 及 HMGB1 基因表達比較（n=3，
）
2.2 姜黃素對 miR-132 和 HMGB1 表達水平的影響
相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達增加，HMGB1 表達減少（P<0.05）；相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達減少，HMGB1 表達增加（P<0.05）；且姜黃素濃度越大，作用越明顯（P<0.05）。見表 1、圖 2。
圖2
蛋白印跡法檢測 HMGB1 在肺泡巨噬細胞表達
a. 不同組蛋白印跡條帶；b. 不同組蛋白印跡條帶灰度值比值（*與對照組比較，
2.3 miR-132 和 HMGB1 在肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥中作用
相比于空白組，miR-132 類似物組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達增加（P<0.05），HMGB1 表達減少（P<0.05），肺泡巨噬細胞凋亡增加，炎癥因子 IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平增加（P<0.05）；相比于 miR-132 類似物組，miR-132 抑制劑組肺泡巨噬細胞 miR-132 相對表達減少（P<0.05），HMGB1 表達增加（P<0.05），肺泡巨噬細胞凋亡減少，炎癥因子 IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平減少（P<0.05）。見表 2 及圖 3、4。
表2
miR-132 和 HMGB1 在肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥因子中作用（n=3，
）
圖3
各組 HMGB1 蛋白表達
a. 不同組蛋白印跡條帶；b. 不同組蛋白印跡條帶灰度值比值（*與空白組比較，
圖4
各組流式細胞圖
a. 空白組；b. miR-132 類似物組；c. miR-132 抑制劑組。橫坐標/縱坐標表示 FITC/PI 熒光信號相對強度的值；Q1-UL：死亡細胞，Q1-UR：晚期凋亡細胞，Q1-LL：正常細胞，Q1-LR：早期凋亡細胞；圖中百分比代表每個區域細胞率，總和為 100%
3 討論
已有研究表明，脂多糖刺激下急性肺損傷發生時肺泡巨噬細胞發生凋亡[7]，另外，脂多糖刺激下肺泡巨噬細胞伴有高炎癥反應[8]。此外，研究也發現了姜黃素在治療肺損傷中肺泡上皮細胞的凋亡指數顯著降低[9]。姜黃素對脂多糖刺激的細胞產生 IL-8、巨噬細胞炎性蛋白-1α、單核細胞趨化蛋白-1、IL-1β 和 TNF-α 有抑制作用[10]。然而姜黃素對脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡的影響是不清楚的。在本研究中，首先，相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞凋亡增加，IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平升高。脂多糖為革蘭陰性菌細胞壁組成成分，是一種炎癥刺激物，處理肺泡巨噬細胞后將導致急性炎癥反應的發生，而炎癥發生將進一步導致肺泡巨噬細胞凋亡。其次，相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞凋亡減少，IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平降低，且姜黃素濃度越大，作用越明顯。姜黃素是姜黃中的一種多酚，具有抗炎癥、抗凋亡作用；經姜黃素和脂多糖處理后，姜黃素具有的抗炎癥、抗凋亡作用對脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞急性炎癥反應及凋亡起到了相應的保護作用。
miRNA 參與了肺泡巨噬細胞的一些重要生理功能，如自噬、溶酶體、自溶、凋亡和細胞周期調控。有研究報道，在脂多糖刺激的肺泡巨噬細胞中 miR-132 表達增加[5]，且在脂多糖刺激支氣管上皮 BEAS-2B 細胞中 miR-132 表達也增加，miR-132 過表達參與了 BEAS-2B 細胞的炎癥及凋亡過程，且經木犀草素（抗炎癥、凋亡）處理后 BEAS-2B 細胞 miR-132 表達降低[11]。此外，有研究也報道 miR-132 參與了姜黃素對非小細胞肺癌細胞凋亡影響過程，姜黃素在促進非小細胞肺癌細胞凋亡過程中調控 miR-132 表達[12]。在本研究中，相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達增加；相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達減少，且姜黃素濃度越大，作用越明顯。miR-132 是一種非編碼小 RNA，通過轉錄后調控發揮作用，脂多糖處理肺泡巨噬細胞后發生的病理狀態導致肺泡巨噬細胞內 miR-132 表達增加，從而調控下游一系列的病理過程，而經姜黃素處理后，這種保護作用（抗炎癥、凋亡）通過降低肺泡巨噬細胞內 miR-132 表達發揮作用。因此，miR-132 參與姜黃素減少脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡過程。HMGB1 屬于 DNA 修復蛋白轉錄調節基因，有研究報道了 HMGB1 在一些涉及高炎癥反應和凋亡病理生理過程中表達降低[13-14]，且下調 HMGB1 基因表達可抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[15]。本研究中，相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞 HMGB1 表達減少（P<0.05）；相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞 HMGB1 表達增加，且姜黃素濃度越大，作用越明顯。HMGB1 通過編碼蛋白發揮作用，脂多糖處理肺泡巨噬細胞后發生的病理狀態導致肺泡巨噬細胞內 HMGB1 表達降低，從而調控下游一系列的病理過程，而經姜黃素處理后，這種保護作用（抗炎癥、凋亡）通過提高肺泡巨噬細胞內 HMGB1 表達發揮作用。因此，HMGB1 也參與姜黃素減少脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡過程。
最后，本研究通過調控肺泡巨噬細胞 miR-132 表達，結果發現上調 miR-132 表達能降低肺泡巨噬細胞 HMGB1 表達，增加肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥；下調 miR-132 表達能增加肺泡巨噬細胞 HMGB1 表達，減少肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥。這些結果也進一步佐證了 miR-132 和 HMGB1 參與姜黃素減少脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡過程。
綜上所述，姜黃素可通過降低 miR-132 表達、上調 HMGB1 表達，減少脂多糖誘導肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡。
脂多糖來源于革蘭陰性菌，是一種炎癥刺激物，當其作用于人類或動物等其他生物細胞時將表現出多種生物活性，引發炎癥的發生、機體感染，最終導致機體發生一系列損傷，包括肺相關性損傷[1]。姜黃素是姜黃中的一種多酚，具有降血脂、抗凝、抗氧化、利膽、抗癌、抗炎癥、抗凋亡等作用[2-3]。然而，姜黃素在脂多糖誘導的肺相關性損傷中的保護作用及其作用機制還不清楚。微 RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼單鏈 RNA 分子，主要通過影響靶信使 RNA 穩定性和/或轉錄后調控發揮作用，從而參與多種疾病的發生發展過程[4]。既往相關研究證實， miRNA-132（miR-132）能通過膽堿能抗炎途徑抑制脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥，在調節炎癥反應中發揮了重要作用[5]。因此，本研究探討了姜黃素對脂多糖刺激下肺泡巨噬細胞（RAW264.7）的炎癥及凋亡影響以及 miR-132 和下游基因是否參與這個過程，來探討姜黃素對脂多糖誘導肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡的保護作用及機制，從而為肺相關性損傷保護及治療提供更多的依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
小鼠肺泡巨噬細胞（RAW 264.7）（中國醫學科學院細胞培養中心），脂多糖（美國 Sigma 公司），姜黃素（成都赫布瑞有限公司），空載體、人工合成的 miR-132 類似物及抑制劑（天津賽爾有限公司），酶聯免疫吸附測定試劑盒（美國 R&D Systems 公司），蛋白抗體（美國 Abcam 公司），小 RNA 試劑盒（美國 Omega 公司），逆轉錄試劑盒（日本 ToYoBo 公司），流式細胞儀（型號：FACSCanto II，美國 Becton–Dickinson 公司），abi-7500 定量實時聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）系統（型號：7500 Fast Real-Time PCR System，美國 Applied Biosystems 公司）。
1.2 細胞培養
1.2.1 姜黃素處理肺泡巨噬細胞培養
小鼠肺泡巨噬細胞培養于 Dulbecco 改良 Eagle 培養基完全培養基（10% 胎牛血清+100 μg/mL 鏈霉素+100 U/mL 青霉素，37℃、5% 二氧化碳）。將培養的細胞分為 4 組，分別為對照組（細胞未進行任何處理）、脂多糖處理組（100 μg/mL 脂多糖處理細胞）、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組（細胞培養基中加入 100 μg/mL 脂多糖和 50 μmol/L 姜黃素進行處理）及脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組（細胞培養基中加入 100 μg/mL 脂多糖和 100 μmol/L 姜黃素進行處理）。藥物處理 48 h 后，進行后續實驗（包括炎癥因子、凋亡、基因及蛋白檢測），每組實驗重復 3 次。
1.2.2 miRNA 轉染肺泡巨噬細胞培養
培養未進行任何處理的小鼠肺泡巨噬細胞［使用上述同一時間同一批號的小鼠肺泡巨噬細胞（RAW 264.7）］，將其分為 3 組（空白組、miR-132 類似物組、miR-132 抑制劑組），用于后續轉染 miR-132 表達實驗。
1.3 基因及 miRNA 測定
根據 miRNA 提取試劑盒的操作說明，分別提取各組（對照組、脂多糖處理組、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組、脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組）肺泡巨噬細胞總 RNA，通過紫外分光光度計方法檢測提取 RNA 的濃度及純度，通過瓊脂糖凝膠電泳方法檢測提取 RNA 的完整性，根據逆轉錄試劑盒的操作說明，2 μg RNA 樣品逆轉錄為互補 DNA。通過 abi-7500 qRT-PCR 系統檢測高遷移率族蛋白 B1（high mobility group protein B1，HMGB1）基因及 miR-132 表達，U6 作為 miR-132 的內參，β-actin 作為 HMGB1 的內參，基因及 miRNA 相對表達通過 2?ΔΔct 方法進行計算，HMGB1 引物設計為：5′-GATGGGCAAAGGAGATCCTA-3′（正向）和 5′-CTTGGTCTCCCTTTGGGG-3′（反向）[6]。
1.4 蛋白測定
對照組、脂多糖處理組、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組及脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組的肺泡巨噬細胞收集后用放射免疫沉淀法裂解液進行裂解，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，各組取 50 μg 總蛋白進行 10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，200 mA 電流轉移到聚偏氟乙烯膜上，5% 脫脂牛奶封閉膜，一抗 4℃ 孵育過夜（HMGB1），然后，室溫下二抗孵育 2 h，用電化學發光液對蛋白印跡條帶進行顯影，最后條帶通過 Quantity One 軟件（版本 4.0）掃描和量化。
1.5 細胞凋亡測定
根據［膜聯蛋白 V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）］/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法使用操作說明，磷酸鹽緩沖液洗滌不同實驗組（對照組、脂多糖處理組、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組及脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組）肺泡巨噬細胞，膜聯蛋白 V 染色，20 min 后，流式細胞儀（美國 Becton–Dickinson 公司）分析細胞凋亡情況。
1.6 炎癥因子測定
根據酶聯免疫吸附法試劑盒使用操作說明，通過酶聯免疫吸附法測定不同實驗組（對照組、脂多糖處理組、脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組及脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組）肺泡巨噬細胞中白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 表達水平。
1.7 miRNA 轉染
根據 miRNA 轉染系統使用操作說明，將空載體、人工合成的 miR-132 類似物及抑制劑通過 lipofectamine 2000 系統分別轉染至未另外進行任何處理的 1.2.2 中的小鼠肺泡巨噬細胞，分為空白組、miR-132 類似物組、miR-132 抑制劑組，誘導 miR-132 在正常巨噬細胞中的不同表達，24 h 后，進行后續實驗（包括炎癥因子、凋亡及基因檢測），相關實驗步驟同實驗步驟 1.3、1.5、1.6，每組實驗重復 3 次。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，方差齊時組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 法；方差不齊時組間比較采用秩和檢驗。計數資料以只數和百分比表示。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 姜黃素對肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥因子的影響
相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞凋亡增加，IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平升高（P<0.05）；相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞凋亡減少，IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平降低（P<0.05），且姜黃素濃度越大，作用越明顯（P<0.05）。見圖 1、表 1。
圖1
各組流式細胞圖
a. 對照組；b. 脂多糖組；c. 脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組；d. 脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組。橫坐標/縱坐標表示 FITC/PI 熒光信號相對強度的值；Q1-UL：死亡細胞，Q1-UR：晚期凋亡細胞，Q1-LL：正常細胞，Q1-LR：早期凋亡細胞；圖中的百分比代表每個區域細胞率，總和為 100%
表1
各組炎癥水平、miR-132 及 HMGB1 基因表達比較（n=3，）
2.2 姜黃素對 miR-132 和 HMGB1 表達水平的影響
相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達增加，HMGB1 表達減少（P<0.05）；相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達減少，HMGB1 表達增加（P<0.05）；且姜黃素濃度越大，作用越明顯（P<0.05）。見表 1、圖 2。
圖2
蛋白印跡法檢測 HMGB1 在肺泡巨噬細胞表達
a. 不同組蛋白印跡條帶；b. 不同組蛋白印跡條帶灰度值比值（*與對照組比較，
2.3 miR-132 和 HMGB1 在肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥中作用
相比于空白組，miR-132 類似物組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達增加（P<0.05），HMGB1 表達減少（P<0.05），肺泡巨噬細胞凋亡增加，炎癥因子 IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平增加（P<0.05）；相比于 miR-132 類似物組，miR-132 抑制劑組肺泡巨噬細胞 miR-132 相對表達減少（P<0.05），HMGB1 表達增加（P<0.05），肺泡巨噬細胞凋亡減少，炎癥因子 IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平減少（P<0.05）。見表 2 及圖 3、4。
表2
miR-132 和 HMGB1 在肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥因子中作用（n=3，）
圖3
各組 HMGB1 蛋白表達
a. 不同組蛋白印跡條帶；b. 不同組蛋白印跡條帶灰度值比值（*與空白組比較，
圖4
各組流式細胞圖
a. 空白組；b. miR-132 類似物組；c. miR-132 抑制劑組。橫坐標/縱坐標表示 FITC/PI 熒光信號相對強度的值；Q1-UL：死亡細胞，Q1-UR：晚期凋亡細胞，Q1-LL：正常細胞，Q1-LR：早期凋亡細胞；圖中百分比代表每個區域細胞率，總和為 100%
3 討論
已有研究表明，脂多糖刺激下急性肺損傷發生時肺泡巨噬細胞發生凋亡[7]，另外，脂多糖刺激下肺泡巨噬細胞伴有高炎癥反應[8]。此外，研究也發現了姜黃素在治療肺損傷中肺泡上皮細胞的凋亡指數顯著降低[9]。姜黃素對脂多糖刺激的細胞產生 IL-8、巨噬細胞炎性蛋白-1α、單核細胞趨化蛋白-1、IL-1β 和 TNF-α 有抑制作用[10]。然而姜黃素對脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡的影響是不清楚的。在本研究中，首先，相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞凋亡增加，IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平升高。脂多糖為革蘭陰性菌細胞壁組成成分，是一種炎癥刺激物，處理肺泡巨噬細胞后將導致急性炎癥反應的發生，而炎癥發生將進一步導致肺泡巨噬細胞凋亡。其次，相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞凋亡減少，IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平降低，且姜黃素濃度越大，作用越明顯。姜黃素是姜黃中的一種多酚，具有抗炎癥、抗凋亡作用；經姜黃素和脂多糖處理后，姜黃素具有的抗炎癥、抗凋亡作用對脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞急性炎癥反應及凋亡起到了相應的保護作用。
miRNA 參與了肺泡巨噬細胞的一些重要生理功能，如自噬、溶酶體、自溶、凋亡和細胞周期調控。有研究報道，在脂多糖刺激的肺泡巨噬細胞中 miR-132 表達增加[5]，且在脂多糖刺激支氣管上皮 BEAS-2B 細胞中 miR-132 表達也增加，miR-132 過表達參與了 BEAS-2B 細胞的炎癥及凋亡過程，且經木犀草素（抗炎癥、凋亡）處理后 BEAS-2B 細胞 miR-132 表達降低[11]。此外，有研究也報道 miR-132 參與了姜黃素對非小細胞肺癌細胞凋亡影響過程，姜黃素在促進非小細胞肺癌細胞凋亡過程中調控 miR-132 表達[12]。在本研究中，相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達增加；相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞 miR-132 表達減少，且姜黃素濃度越大，作用越明顯。miR-132 是一種非編碼小 RNA，通過轉錄后調控發揮作用，脂多糖處理肺泡巨噬細胞后發生的病理狀態導致肺泡巨噬細胞內 miR-132 表達增加，從而調控下游一系列的病理過程，而經姜黃素處理后，這種保護作用（抗炎癥、凋亡）通過降低肺泡巨噬細胞內 miR-132 表達發揮作用。因此，miR-132 參與姜黃素減少脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡過程。HMGB1 屬于 DNA 修復蛋白轉錄調節基因，有研究報道了 HMGB1 在一些涉及高炎癥反應和凋亡病理生理過程中表達降低[13-14]，且下調 HMGB1 基因表達可抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[15]。本研究中，相比于對照組，脂多糖組肺泡巨噬細胞 HMGB1 表達減少（P<0.05）；相比于脂多糖組，脂多糖+50 μmol/L 姜黃素組和脂多糖+100 μmol/L 姜黃素組肺泡巨噬細胞 HMGB1 表達增加，且姜黃素濃度越大，作用越明顯。HMGB1 通過編碼蛋白發揮作用，脂多糖處理肺泡巨噬細胞后發生的病理狀態導致肺泡巨噬細胞內 HMGB1 表達降低，從而調控下游一系列的病理過程，而經姜黃素處理后，這種保護作用（抗炎癥、凋亡）通過提高肺泡巨噬細胞內 HMGB1 表達發揮作用。因此，HMGB1 也參與姜黃素減少脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡過程。
最后，本研究通過調控肺泡巨噬細胞 miR-132 表達，結果發現上調 miR-132 表達能降低肺泡巨噬細胞 HMGB1 表達，增加肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥；下調 miR-132 表達能增加肺泡巨噬細胞 HMGB1 表達，減少肺泡巨噬細胞凋亡及炎癥。這些結果也進一步佐證了 miR-132 和 HMGB1 參與姜黃素減少脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡過程。
綜上所述，姜黃素可通過降低 miR-132 表達、上調 HMGB1 表達，減少脂多糖誘導肺泡巨噬細胞炎癥及凋亡。
