引用本文： 龍丹, 馮莉, 陳雪璐, 李勝富, 周彥妮. 免疫熒光檢測 p53 與線粒體共定位的實驗方法探索. 華西醫學, 2020, 35(8): 948-953. doi: 10.7507/1002-0179.201908146 復制
近年來，多種核定位蛋白被發現不僅在細胞核內表達，還可定位至細胞器。已有大量研究報道：在不同組織和細胞中，多種應激均可誘導 p53 進入線粒體[1-3]；低氧誘導因子 1α 不僅可定位于線粒體[4]，還可定位至過氧化物酶體[5]；糖皮質激素受體、信號傳導及轉錄激活因子 3 等也可在應激條件下進入線粒體[6-7]。核定位蛋白進入細胞器中行使功能已成為研究熱點，然而在研究這些蛋白在非核細胞器中的表達時，仍存在以下問題：① 線粒體分重線粒體和輕線粒體[8-9]，分離純化難度大；② 不同細胞器的得率不同，難以準確地反映蛋白在細胞不同亞結構間的表達比例；③ 可能蛋白在核內信號太強，無法捕捉到細胞器中的信號。Marchenko 研究團隊報道其在首次研究 p53 在線粒體中的定位時，因為核內信號過強掩蓋了細胞質信號，因此未能通過免疫熒光捕捉到內源性 p53 與線粒體的共定位[10-11]。因此，本研究希望通過檢測不同固定方式、不同通透條件對破膜程度的影響，尋找僅破細胞膜、不破核膜的條件，探索可避開核內信號干擾，檢測蛋白在細胞質細胞器中表達的免疫熒光方案。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 細胞的培養
人宮頸癌細胞系（HeLa）購自中國科學院上海細胞庫，用含 10% 胎牛血清的低限量 Eagle 培養基（minimum Eagle’s medium，MEM）在培養箱中靜置培養。如需缺氧，于三氣培養箱中，1% 氧濃度下靜置培養。
1.2 主要試劑及儀器
1.2.1 主要試劑
MEM 培養基（美國 Gibco 公司）；胎牛血清（以色列 Biological Industries 公司）；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國 Sigma 公司）；多聚-D-賴氨酸（poly-D-lysine，PDL）（美國 Sigma 公司）；細胞裂解液（美國 Thermo Fisher 公司）；抗葡萄糖調節蛋白 75（Grp75）抗體、山羊抗小鼠免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）（H+L）（DyLight550）、山羊抗兔 IgG（H+L）（Alexa Fluor 488）（英國 Abcam 公司）；抗 p53 抗體（美國 Proteintech 公司）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國 Cell Signaling Technology 公司）；超敏電化學發光法（electrochemiluminescence，ECL）顯色劑（北京四正柏生物科技有限公司）。
1.2.2 主要儀器
MCO-15AC 恒溫二氧化碳培養箱、JOUAN IG750 三氣培養箱（日本 Sanyo 株式會社）；Legend Micro 17R 水平式低溫離心機（美國 Thermo Fisher 公司）；超聲破碎儀（TENLIN-150D，江蘇天翎儀器有限公司）；Fusion FX 凝膠成像系統（法國 Vilber 公司）；A1 共聚焦顯微鏡（日本 Nikon 株式會社）。
1.3 免疫印跡
作為重要的促凋亡蛋白，現有研究報道缺氧可誘導 p53 表達上調[12-13]。為確認 HeLa 細胞經低氧處理 24 h 后 p53 表達情況，我們采用免疫印跡檢測了常氧組和缺氧組 p53 的表達。Hela 細胞分常氧組和缺氧組培養，消化并收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后加入適量裂解液超聲破碎，離心，取上清液，測定濃度；剩余液體加入上樣緩沖液沸水浴；按 20 μg 總蛋白量上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，使用 5% 脫脂奶粉于 37℃ 封閉 1 h；使用 5% 脫脂奶粉按 1∶500 稀釋抗 p53 抗體，1∶1 000 稀釋抗 GAPDH 抗體，4℃ 過夜；Tris-HCl 緩沖鹽溶液（Tris Buffered saline Tween，TBST）洗 3 次，10 min/次；按 1∶1 000 稀釋抗兔二抗，37℃ 孵育 1 h，TBST 洗 3 次，10 min/次；加入 ECL 顯色劑曝光。用凝膠成像系統檢測免疫反應蛋白條帶。實驗重復 3 次。
1.4 免疫熒光
在研究蛋白質分布的免疫熒光實驗中，使用 4% 多聚甲醛和預冷甲醇固定較為普遍[14-15]，也有部分研究使用甲醇：丙酮（體積比 1∶1）混合液（以下簡稱“混合液”）固定[11]。為探究不同固定方式對規避核內信號的影響，我們分別使用這 3 種固定方式對常氧和缺氧后 p53 在細胞內的分布進行檢測。考慮到甲醇和混合液具有較強的通透效果，因此，此 2 組不額外使用聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X 100）通透，多聚甲醛組使用 0.1% Triton-X 100 通透。
將 14 mm 細胞爬片（NEST）置于 24 孔板中，使用 PDL 包被 5 min 后無菌去離子水洗 2 次并自然干燥；將細胞正常消化并重懸，按 5×104個/孔計算加入到孔板中，十字搖勻后放入恒溫二氧化碳培養箱中靜置培養。培養 24 h 后確認細胞貼壁并完全伸展開，缺氧組放入三氣培養箱中低氧培養 24 h，常氧組繼續在恒溫二氧化碳培養箱中培養 24 h。
1.4.1 甲醇及混合液固定
使用 PBS 涮洗爬片 2 次，分別加入甲醇或混合液固定 10 min，其中甲醇組在 4℃ 固定，混合液組在常溫固定；PBS 洗 3 次，10 min/次，直接使用 1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）于 37℃ 封閉 30 min。
1.4.2 4% 多聚甲醛固定
使用 PBS 涮洗爬片 2 次后加入 4% 多聚甲醛常溫固定 10 min，PBS 洗 3 次，10 min/次；按分組分別使用 0.1%、0.05%、0.025%、0.01% 和 0.005% Triton-X 100 常溫通透 10 min；PBS 洗 3 次，10 min/次；將爬片置于載玻片上，放入濕盒中，使用 1% BSA 于 37℃ 封閉 30 min。
使用 1% BSA 配制抗 Grp75 一抗（1∶50）和抗 p53 一抗（1∶200），于濕盒中 4℃ 孵育過夜；PBS 洗 3 次，10 min/次；使用 1% BSA 配制山羊抗小鼠 IgG（H+L）（DyLight550）（1∶400）和山羊抗兔 IgG（H+L）（Alexa Fluor 488）（1∶500），于濕盒中 37℃ 孵育 1 h，PBS 洗 3 次，10 min/次；加入 DAPI（1 μg/mL）染色 5 min，PBS 洗 2 次，10 min/次；使用抗熒光淬滅封片劑封片并在共聚焦顯微鏡下觀察染色情況。抗 Grp75 標記線粒體（紅色），抗 p53 抗體標記 p53（綠色），DAPI 標記細胞核（藍色），若 p53 進入線粒體，即共定位則為黃色或橙色。
1.4.3 二次通透法
使用 PBS 涮洗爬片 2 次后加入 4% 多聚甲醛常溫固定 10 min，PBS 洗 3 次，10 min/次；分別使用 0.01% 和 0.005% Triton-X 100 常溫固定 10 min；PBS 洗 3 次，10 min/次；將爬片置于載玻片上，放入濕盒中，使用 1% BSA 于 37℃ 封閉 30 min；僅孵育抗 p53 抗體，4℃ 過夜；PBS 洗 3 次，10 min/次；使用 0.1% Triton-X 100 重新常溫通透 10 min；PBS 洗 3 次，10 min/次；孵育抗 Grp75 抗體，4℃ 過夜；PBS 洗 3 次，10 min/次；使用 1% BSA 配制山羊抗小鼠 IgG（H+L）（DyLight550）（1∶400）和山羊抗兔 IgG（H+L）（Alexa Fluor 488）（1∶500），于濕盒中 37℃ 孵育 1 h，PBS 洗 3 次，10 min/次；加入 DAPI（1 μg/mL）染色 5 min，PBS 洗 2 次，10 min/次；使用抗熒光淬滅封片劑封片并在共聚焦顯微鏡下觀察染色情況。
1.5 統計學方法
用 GraphPad Prism 7 軟件進行統計處理。計量資料以均數±標準差表示，根據實驗設計，兩組間比較使用 t 檢驗。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 缺氧上調 p53 表達
免疫印跡結果顯示，常氧組 p53 表達為 1，缺氧組 p53 表達為 1.431±0.072，差異有統計學意義（t=5.934，P=0.004）。見圖 1。
圖1
常氧組與缺氧組免疫印跡法檢測 p53 表達
a. p53 表達情況的免疫印跡檢測結果，可見缺氧誘導 p53 表達上調；b. p53 表達的免疫印跡灰度分析，以 GAPDH 為內參進行校正，**
2.2 不同固定方式對 p53 分布檢測的影響
不同固定方式下，缺氧組信號均強于常氧組，與免疫印跡結果一致；多聚甲醛固定組信號主要在細胞核內，細胞質內幾乎無信號，無明顯蛋白與線粒體共定位；甲醇和混合液組細胞核和細胞質內均有信號，二者缺氧組均可觀察到明顯共定位，但混合液組共定位更為明顯。見圖 2。
圖2
不同方式固定后免疫熒光檢測 p53 分布情況
線粒體為紅色，p53 為綠色，若 p53 進入線粒體，即共定位，則為黃色或橙色
2.3 不同通透條件對 p53 分布檢測的影響
0.05% 和 0.025% Triton-X 100 通透后細胞質內信號相對增強，但僅可觀察到微弱的共定位；而使用 0.01% 和 0.005% Triton-X 100 通透后，細胞核內無信號，僅細胞質內可見信號，但線粒體標記失敗。見圖 3。
圖3
不同通透條件處理后免疫熒光檢測 p53 分布
線粒體為紅色，p53 為綠色，若 p53 進入線粒體，即共定位，則為黃色或橙色
2.4 二次通透后 p53 分布檢測
二次通透后，線粒體標記效果與各組相近，且可明顯觀察到 p53 與線粒體的共定位。見圖 4。
圖4
二次通透后免疫熒光檢測
線粒體為紅色，p53 為綠色，若 p53 進入線粒體，即共定位，則為黃色或橙色
3 討論
越來越多的研究顯示：核蛋白可同時進入線粒體行使重要功能。線粒體作為一種參與多種生理、病理過程的重要細胞器也廣受關注。研究核蛋白在線粒體中的表達及功能是當前的研究熱點。p53 作為關鍵的腫瘤抑制因子，是近年來研究較多的一種核-線粒體雙定位蛋白[3, 16]。自 Marchenko 等[10]發現其進入線粒體即可獨立誘導細胞凋亡以來，已有多個研究證實低氧可誘導其定位線粒體[17]。因此，本研究以 p53 在線粒體與細胞核間分布為例，探索檢測其與線粒體共定位的免疫熒光優化方案，為蛋白的線粒體定位及蛋白與非核細胞器定位研究提供依據和參考。
本研究結果顯示：使用甲醇、甲醇：丙酮混合液固定及 4% 多聚甲醛固定后結合適當濃度 Triton X-100 通透均可捕捉到 p53 與線粒體的共定位。其中，混合液固定后檢測到的共定位信號最為明顯。有意思的是，混合液和甲醇固定組未使用破膜劑通透的情況下細胞核內依然有明顯信號，提示甲醇和混合液有顯著通透效果。但多聚甲醛組使用 0.1% Triton X-100 同樣可破核膜，最終檢測到細胞質中 p53 信號卻明顯弱于另 2 組。我們推測，甲醇和混合液的穿透性強，或能較均勻地到達細胞內各個結構，從而均勻地作用于細胞內多種膜結構，而 Triton X-100 的穿透力相對較弱，作為細胞內最大的細胞器，加之核膜無復雜的折疊結構，細胞核最易被 Triton X-100 穿透，而線粒體內膜折疊成嵴，外膜與內質網等交聯，可能不易均勻地被通透。
使用 4% 多聚甲醛固定后需要結合適當低濃度的 Triton X-100 通透才可避開核內信號干擾，并需要二次正常通透保證線粒體的標記效果。盡管操作更為繁瑣，但相比可顯著捕捉到共定位的混合液固定仍有其優勢，即可完全避免核內信號的干擾，研究蛋白質在線粒體中的表達隨處理時間延長或改變的變化。值得注意的是，在本研究中，我們使用抗 Grp75 抗體標記線粒體。Grp75 主要位于線粒體基質中[18]，在低濃度 Triton X-100 通透下，標記線粒體失敗。我們推測：如果待測目標蛋白同樣定位于線粒體基質中，多聚甲醛固定結合二次通透法或不能有效檢測共定位。此外，根據以往操作經驗，不同細胞對 Triton X-100 通透的敏感度并不一致，在使用二次通透法時，第一次通透使用的低濃度或許有一定差異。
在本研究中，使用不同固定方式或不同通透條件觀測到的 p53 在核/質分布比例不完全相同，提示實驗條件的差異將導致觀測到的結果不同，即通過免疫熒光觀察到的蛋白質核/質分布比不能完全真實地反映蛋白質的分布。分析蛋白質分布比例仍需要諸如基于梯度離心的細胞器純化等多種實驗互相佐證。盡管本研究僅以 p53 為例探索了其與線粒體共定位的最佳免疫熒光條件，研究結果仍可推廣應用于研究其他蛋白質與線粒體的共定位，尤其是對于在線粒體中的表達量明顯低于細胞核內表達的蛋白質，使用混合液固定或二次通透法均有利于測得共定位并分析其在線粒體中表達變化趨勢。同樣地，對于蛋白質定位于其他非核細胞的研究，本研究結果也可提供參考。
近年來，多種核定位蛋白被發現不僅在細胞核內表達，還可定位至細胞器。已有大量研究報道：在不同組織和細胞中，多種應激均可誘導 p53 進入線粒體[1-3]；低氧誘導因子 1α 不僅可定位于線粒體[4]，還可定位至過氧化物酶體[5]；糖皮質激素受體、信號傳導及轉錄激活因子 3 等也可在應激條件下進入線粒體[6-7]。核定位蛋白進入細胞器中行使功能已成為研究熱點，然而在研究這些蛋白在非核細胞器中的表達時，仍存在以下問題：① 線粒體分重線粒體和輕線粒體[8-9]，分離純化難度大；② 不同細胞器的得率不同，難以準確地反映蛋白在細胞不同亞結構間的表達比例；③ 可能蛋白在核內信號太強，無法捕捉到細胞器中的信號。Marchenko 研究團隊報道其在首次研究 p53 在線粒體中的定位時，因為核內信號過強掩蓋了細胞質信號，因此未能通過免疫熒光捕捉到內源性 p53 與線粒體的共定位[10-11]。因此，本研究希望通過檢測不同固定方式、不同通透條件對破膜程度的影響，尋找僅破細胞膜、不破核膜的條件，探索可避開核內信號干擾，檢測蛋白在細胞質細胞器中表達的免疫熒光方案。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 細胞的培養
人宮頸癌細胞系（HeLa）購自中國科學院上海細胞庫，用含 10% 胎牛血清的低限量 Eagle 培養基（minimum Eagle’s medium，MEM）在培養箱中靜置培養。如需缺氧，于三氣培養箱中，1% 氧濃度下靜置培養。
1.2 主要試劑及儀器
1.2.1 主要試劑
MEM 培養基（美國 Gibco 公司）；胎牛血清（以色列 Biological Industries 公司）；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國 Sigma 公司）；多聚-D-賴氨酸（poly-D-lysine，PDL）（美國 Sigma 公司）；細胞裂解液（美國 Thermo Fisher 公司）；抗葡萄糖調節蛋白 75（Grp75）抗體、山羊抗小鼠免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）（H+L）（DyLight550）、山羊抗兔 IgG（H+L）（Alexa Fluor 488）（英國 Abcam 公司）；抗 p53 抗體（美國 Proteintech 公司）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國 Cell Signaling Technology 公司）；超敏電化學發光法（electrochemiluminescence，ECL）顯色劑（北京四正柏生物科技有限公司）。
1.2.2 主要儀器
MCO-15AC 恒溫二氧化碳培養箱、JOUAN IG750 三氣培養箱（日本 Sanyo 株式會社）；Legend Micro 17R 水平式低溫離心機（美國 Thermo Fisher 公司）；超聲破碎儀（TENLIN-150D，江蘇天翎儀器有限公司）；Fusion FX 凝膠成像系統（法國 Vilber 公司）；A1 共聚焦顯微鏡（日本 Nikon 株式會社）。
1.3 免疫印跡
作為重要的促凋亡蛋白，現有研究報道缺氧可誘導 p53 表達上調[12-13]。為確認 HeLa 細胞經低氧處理 24 h 后 p53 表達情況，我們采用免疫印跡檢測了常氧組和缺氧組 p53 的表達。Hela 細胞分常氧組和缺氧組培養，消化并收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后加入適量裂解液超聲破碎，離心，取上清液，測定濃度；剩余液體加入上樣緩沖液沸水浴；按 20 μg 總蛋白量上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，使用 5% 脫脂奶粉于 37℃ 封閉 1 h；使用 5% 脫脂奶粉按 1∶500 稀釋抗 p53 抗體，1∶1 000 稀釋抗 GAPDH 抗體，4℃ 過夜；Tris-HCl 緩沖鹽溶液（Tris Buffered saline Tween，TBST）洗 3 次，10 min/次；按 1∶1 000 稀釋抗兔二抗，37℃ 孵育 1 h，TBST 洗 3 次，10 min/次；加入 ECL 顯色劑曝光。用凝膠成像系統檢測免疫反應蛋白條帶。實驗重復 3 次。
1.4 免疫熒光
在研究蛋白質分布的免疫熒光實驗中，使用 4% 多聚甲醛和預冷甲醇固定較為普遍[14-15]，也有部分研究使用甲醇：丙酮（體積比 1∶1）混合液（以下簡稱“混合液”）固定[11]。為探究不同固定方式對規避核內信號的影響，我們分別使用這 3 種固定方式對常氧和缺氧后 p53 在細胞內的分布進行檢測。考慮到甲醇和混合液具有較強的通透效果，因此，此 2 組不額外使用聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X 100）通透，多聚甲醛組使用 0.1% Triton-X 100 通透。
將 14 mm 細胞爬片（NEST）置于 24 孔板中，使用 PDL 包被 5 min 后無菌去離子水洗 2 次并自然干燥；將細胞正常消化并重懸，按 5×104個/孔計算加入到孔板中，十字搖勻后放入恒溫二氧化碳培養箱中靜置培養。培養 24 h 后確認細胞貼壁并完全伸展開，缺氧組放入三氣培養箱中低氧培養 24 h，常氧組繼續在恒溫二氧化碳培養箱中培養 24 h。
1.4.1 甲醇及混合液固定
使用 PBS 涮洗爬片 2 次，分別加入甲醇或混合液固定 10 min，其中甲醇組在 4℃ 固定，混合液組在常溫固定；PBS 洗 3 次，10 min/次，直接使用 1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）于 37℃ 封閉 30 min。
1.4.2 4% 多聚甲醛固定
使用 PBS 涮洗爬片 2 次后加入 4% 多聚甲醛常溫固定 10 min，PBS 洗 3 次，10 min/次；按分組分別使用 0.1%、0.05%、0.025%、0.01% 和 0.005% Triton-X 100 常溫通透 10 min；PBS 洗 3 次，10 min/次；將爬片置于載玻片上，放入濕盒中，使用 1% BSA 于 37℃ 封閉 30 min。
使用 1% BSA 配制抗 Grp75 一抗（1∶50）和抗 p53 一抗（1∶200），于濕盒中 4℃ 孵育過夜；PBS 洗 3 次，10 min/次；使用 1% BSA 配制山羊抗小鼠 IgG（H+L）（DyLight550）（1∶400）和山羊抗兔 IgG（H+L）（Alexa Fluor 488）（1∶500），于濕盒中 37℃ 孵育 1 h，PBS 洗 3 次，10 min/次；加入 DAPI（1 μg/mL）染色 5 min，PBS 洗 2 次，10 min/次；使用抗熒光淬滅封片劑封片并在共聚焦顯微鏡下觀察染色情況。抗 Grp75 標記線粒體（紅色），抗 p53 抗體標記 p53（綠色），DAPI 標記細胞核（藍色），若 p53 進入線粒體，即共定位則為黃色或橙色。
1.4.3 二次通透法
使用 PBS 涮洗爬片 2 次后加入 4% 多聚甲醛常溫固定 10 min，PBS 洗 3 次，10 min/次；分別使用 0.01% 和 0.005% Triton-X 100 常溫固定 10 min；PBS 洗 3 次，10 min/次；將爬片置于載玻片上，放入濕盒中，使用 1% BSA 于 37℃ 封閉 30 min；僅孵育抗 p53 抗體，4℃ 過夜；PBS 洗 3 次，10 min/次；使用 0.1% Triton-X 100 重新常溫通透 10 min；PBS 洗 3 次，10 min/次；孵育抗 Grp75 抗體，4℃ 過夜；PBS 洗 3 次，10 min/次；使用 1% BSA 配制山羊抗小鼠 IgG（H+L）（DyLight550）（1∶400）和山羊抗兔 IgG（H+L）（Alexa Fluor 488）（1∶500），于濕盒中 37℃ 孵育 1 h，PBS 洗 3 次，10 min/次；加入 DAPI（1 μg/mL）染色 5 min，PBS 洗 2 次，10 min/次；使用抗熒光淬滅封片劑封片并在共聚焦顯微鏡下觀察染色情況。
1.5 統計學方法
用 GraphPad Prism 7 軟件進行統計處理。計量資料以均數±標準差表示，根據實驗設計，兩組間比較使用 t 檢驗。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 缺氧上調 p53 表達
免疫印跡結果顯示，常氧組 p53 表達為 1，缺氧組 p53 表達為 1.431±0.072，差異有統計學意義（t=5.934，P=0.004）。見圖 1。
圖1
常氧組與缺氧組免疫印跡法檢測 p53 表達
a. p53 表達情況的免疫印跡檢測結果，可見缺氧誘導 p53 表達上調；b. p53 表達的免疫印跡灰度分析，以 GAPDH 為內參進行校正，**
2.2 不同固定方式對 p53 分布檢測的影響
不同固定方式下，缺氧組信號均強于常氧組，與免疫印跡結果一致；多聚甲醛固定組信號主要在細胞核內，細胞質內幾乎無信號，無明顯蛋白與線粒體共定位；甲醇和混合液組細胞核和細胞質內均有信號，二者缺氧組均可觀察到明顯共定位，但混合液組共定位更為明顯。見圖 2。
圖2
不同方式固定后免疫熒光檢測 p53 分布情況
線粒體為紅色，p53 為綠色，若 p53 進入線粒體，即共定位，則為黃色或橙色
2.3 不同通透條件對 p53 分布檢測的影響
0.05% 和 0.025% Triton-X 100 通透后細胞質內信號相對增強，但僅可觀察到微弱的共定位；而使用 0.01% 和 0.005% Triton-X 100 通透后，細胞核內無信號，僅細胞質內可見信號，但線粒體標記失敗。見圖 3。
圖3
不同通透條件處理后免疫熒光檢測 p53 分布
線粒體為紅色，p53 為綠色，若 p53 進入線粒體，即共定位，則為黃色或橙色
2.4 二次通透后 p53 分布檢測
二次通透后，線粒體標記效果與各組相近，且可明顯觀察到 p53 與線粒體的共定位。見圖 4。
圖4
二次通透后免疫熒光檢測
線粒體為紅色，p53 為綠色，若 p53 進入線粒體，即共定位，則為黃色或橙色
3 討論
越來越多的研究顯示：核蛋白可同時進入線粒體行使重要功能。線粒體作為一種參與多種生理、病理過程的重要細胞器也廣受關注。研究核蛋白在線粒體中的表達及功能是當前的研究熱點。p53 作為關鍵的腫瘤抑制因子，是近年來研究較多的一種核-線粒體雙定位蛋白[3, 16]。自 Marchenko 等[10]發現其進入線粒體即可獨立誘導細胞凋亡以來，已有多個研究證實低氧可誘導其定位線粒體[17]。因此，本研究以 p53 在線粒體與細胞核間分布為例，探索檢測其與線粒體共定位的免疫熒光優化方案，為蛋白的線粒體定位及蛋白與非核細胞器定位研究提供依據和參考。
本研究結果顯示：使用甲醇、甲醇：丙酮混合液固定及 4% 多聚甲醛固定后結合適當濃度 Triton X-100 通透均可捕捉到 p53 與線粒體的共定位。其中，混合液固定后檢測到的共定位信號最為明顯。有意思的是，混合液和甲醇固定組未使用破膜劑通透的情況下細胞核內依然有明顯信號，提示甲醇和混合液有顯著通透效果。但多聚甲醛組使用 0.1% Triton X-100 同樣可破核膜，最終檢測到細胞質中 p53 信號卻明顯弱于另 2 組。我們推測，甲醇和混合液的穿透性強，或能較均勻地到達細胞內各個結構，從而均勻地作用于細胞內多種膜結構，而 Triton X-100 的穿透力相對較弱，作為細胞內最大的細胞器，加之核膜無復雜的折疊結構，細胞核最易被 Triton X-100 穿透，而線粒體內膜折疊成嵴，外膜與內質網等交聯，可能不易均勻地被通透。
使用 4% 多聚甲醛固定后需要結合適當低濃度的 Triton X-100 通透才可避開核內信號干擾，并需要二次正常通透保證線粒體的標記效果。盡管操作更為繁瑣，但相比可顯著捕捉到共定位的混合液固定仍有其優勢，即可完全避免核內信號的干擾，研究蛋白質在線粒體中的表達隨處理時間延長或改變的變化。值得注意的是，在本研究中，我們使用抗 Grp75 抗體標記線粒體。Grp75 主要位于線粒體基質中[18]，在低濃度 Triton X-100 通透下，標記線粒體失敗。我們推測：如果待測目標蛋白同樣定位于線粒體基質中，多聚甲醛固定結合二次通透法或不能有效檢測共定位。此外，根據以往操作經驗，不同細胞對 Triton X-100 通透的敏感度并不一致，在使用二次通透法時，第一次通透使用的低濃度或許有一定差異。
在本研究中，使用不同固定方式或不同通透條件觀測到的 p53 在核/質分布比例不完全相同，提示實驗條件的差異將導致觀測到的結果不同，即通過免疫熒光觀察到的蛋白質核/質分布比不能完全真實地反映蛋白質的分布。分析蛋白質分布比例仍需要諸如基于梯度離心的細胞器純化等多種實驗互相佐證。盡管本研究僅以 p53 為例探索了其與線粒體共定位的最佳免疫熒光條件，研究結果仍可推廣應用于研究其他蛋白質與線粒體的共定位，尤其是對于在線粒體中的表達量明顯低于細胞核內表達的蛋白質，使用混合液固定或二次通透法均有利于測得共定位并分析其在線粒體中表達變化趨勢。同樣地，對于蛋白質定位于其他非核細胞的研究，本研究結果也可提供參考。
