引用本文： 林愛金, 王潔瓊, 易沙沙, 敖麗娟, 陳茉弦. 新生小鼠缺氧缺血性腦損傷學習記憶能力的性別差異研究. 華西醫學, 2019, 34(12): 1412-1416. doi: 10.7507/1002-0179.201907161 復制
缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）由圍產期缺氧缺血引起，主要導致白質病變[1]，并帶來長期神經發育障礙，如腦癱、學習障礙、多動癥、自閉癥[2-3]等。盡管新生兒醫學的進步使得患兒的存活率提高，但大多數國家 HIBD 的發生率仍有所增加[4]，且帶來嚴重的社會經濟負擔。臨床數據顯示大腦發育障礙的發生率存在性別差異，其中男性患病率高于女性，如男性發生早產、缺氧、腦室出血和感染的概率更高，男孩比女孩有更嚴重的長期認知缺陷，更有可能出現語言障礙和學習障礙[5]。然而，在許多涉及 HIBD 的基礎研究中，對雄性動物和雌性動物的使用并不明確，性別的差異尚未被考慮。因此，本實驗欲通過行為學探討性別對新生小鼠 HIBD 學習記憶能力的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無特定病原體級新生 C57BL/6 小鼠，日齡 10 d，50 只，雌雄各半，體質量 3.85～4.50 g，動物實驗許可證號為 SYXK（滇）K2015-0002，購買于昆明醫科大學實驗動物中心，光照控制 12 h，避光 12 h，室溫（23±2）℃，給予標準的飲用水和飼料，所有動物實驗均經昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會批準（KMMU2019066）。
1.2 儀器與設備
自制缺氧箱、Ox-Plus 氧濃度測試儀（鍵合電子有限公司）、異氟烷（山東科源制藥有限公司，貨號：H19990157）、5-0 帶線縫合針（友誠生物科技有限公司，貨號：1300512）、Morris 水迷宮實驗裝置、Y 迷宮實驗裝置，supermaze 視頻分析系統（上海欣軟科技有限公司）。
1.3 模型制備及分組
隨機數字表法將 50 只 C57BL/6 小鼠分為假手術組（22 只，雌雄各半）和缺氧缺血組（28 只，雌雄各半）。缺氧缺血組用異氟烷（25 μL/只）吸入麻醉后，將其固定在無菌動物手術臺上，切開頸部皮膚，切口為 5～10 mm，分離出左側頸總動脈，用 5-0 絲線雙重結扎左側頸總動脈后離斷，接著縫合傷口。整個手術過程時間控制在 10 min 內。手術后放在帶有母鼠氣味的墊料上休息 30 min，之后回到母鼠身邊休息 1 h，再置于含有 8% 氧氣和 92% 氮氣混合氣體的 34℃ 恒溫缺氧箱中 45 min。假手術組僅切開左側頸部皮膚，暴露頸總動脈，未結扎，并直接縫合傷口。造模結束后兩組小鼠放回母鼠身邊自由飲食。
1.4 小鼠模型的評價
1.4.1 神經行為學評價
用 Longa 評分測試[6]，于造模 24 h 后對小鼠進行神經缺損功能評分：① 0 分：無神經損傷癥狀；② 1 分：不能完全伸展對側前爪；③ 2 分：先癱瘓側轉圈；④ 3 分：向對側傾倒；⑤ 4 分：能自發行走，意識喪失。
1.4.2 腦組織形態及病理評估
行為學評分結束后，灌注取腦，經 4% 多聚甲醛浸泡固定，10%、15%、30% 蔗糖溶液梯度脫水、冷凍包埋劑包埋、10 μm 冰凍切片，常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察腦組織形態學改變。
1.5 行為學實驗
兩組小鼠在成年后，即出生第 60～62 天進行 Y 迷宮實驗，第 63～69 天進行 Morris 水迷宮實驗，觀察并記錄實驗數據。在實驗開始之前先讓動物適應環境 3 d。
1.5.1 Y 迷宮實驗
Y 迷宮由 3 個臂組成，臂與臂之間夾角為 120°，每個臂大小（長×寬×高）為 10 cm×5 cm×5 cm。首先用擋板遮住新異臂，將小鼠放在 Y 迷宮中自由探索 10 min。結束后將小鼠取出放回籠中休息 1 h；1 h 后將新異臂擋板取出，小鼠從起始臂進入，使其在 3 個臂自由活動，記錄其 5 min 內在 3 個臂的停留時間。
1.5.2 Morris 水迷宮實驗
Morris 水迷宮實驗裝置由圓形水池（水池直徑為 120 cm）、攝像系統、平臺（直徑×高度：6 cm×30 cm）以及動物行為軌跡分析系統組成。實驗分為 3 個階段進行：① 適應性訓練：實驗前 1 d 將小鼠放入無平臺的圓形水池中，自由游泳 10 min，使小鼠適應游泳。② 定位航行實驗：將平臺置于任一象限，每天將小鼠從水池的 4 個象限放入水中，連續 5 d，4 次/d，4 次均按照不同象限順序，每次訓練 90 s，一次訓練結束后休息 60 s 再進行下一次訓練。攝像系統將全程記錄小鼠的運動軌跡，限時 90 s，讓小鼠尋找并爬上隱藏平臺，在平臺停留時間>3 s 視為成功。90 s 內未找到平臺的將其引導置于平臺上站立 15 s，再將其從平臺上拿下來，休息 60 s，進行下一次訓練。若小鼠的逃避潛伏期>90 s，則記錄為 90 s，記錄小鼠的逃避潛伏期。③ 空間探索實驗：實驗第 7 天，撤掉平臺，將小鼠從水池壁任一位置放入無平臺水中（所有實驗小鼠同一入水點），自由游泳。記錄 90 s 內小鼠在目標區域停留時間以及目標區域進入次數。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行統計分析。計量資料服從正態分布以均數±標準差表示，采用完全隨機設計資料的方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用 LSD-t 檢驗。計數資料采用只數和百分比表示。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠模型評價
缺氧缺血組在造模過程中死亡 4 只，其中 1 只缺血處理死亡，3 只缺氧處理死亡；另外根據 Longa 評分測試排除 0 分模型小鼠 4 只（造模未成功），建模成功率為 71.4%（20/28），20 只模型小鼠入組實驗。假手術組建模過程無死亡小鼠，建模成功率為 100.0%（22/22），22 只模型小鼠均入組實驗。在后續 2 個月的生長發育中，缺氧缺血組和假手術組均無小鼠死亡。
HE 染色結果發現，缺氧缺血組左側大腦組織分層結構較不明顯，細胞腫脹，間隙增大，部分神經元細胞體積縮小，細胞核固縮且染色加深，細胞核不清楚。而假手術組大腦組織結構清晰，邊界清楚，細胞排列有序，形態規則。見圖 1。
圖1
兩組小鼠左側大腦皮質和海馬組織 HE 染色像
2.2 Y 迷宮實驗比較
缺氧缺血組的新異臂進入次數和新異臂總路程與假手術組比較，差異均有統計學意義［新異臂進入次數：（6.43±0.31） vs. （9.71±0.76）次，F=16.068，P<0.001；新異臂總路程：（10 768.31±671.13） vs. （17 269.17±2 122.01）mm，F=8.532，P=0.007］。同性別中組間比較，假手術組明顯高于缺氧缺血組，差異有統計學意義（雄性新異臂進入次數：P=0.001，雌性新異臂進入次數：P=0.012；雄性新異臂總路程： P=0.010，雌性新異臂總路程：P=0.046）；同一組別雌雄間比較，缺氧缺血組雌性的新異臂進入次數（P=0.039）和新異臂總路程（P=0.043）均高于缺氧缺血組雄性。見表 1。
表1
不同組別小鼠雌雄在 Y 迷宮實驗和 Morris 水迷宮實驗比較（
）
2.3 Morris水迷宮實驗比較
在定位航行實驗中，每次訓練各組小鼠學習尋找平臺的能力都得到相應提高，從第 1～5 天不同組別雌雄小鼠的逃避潛伏期都呈現逐漸下降趨勢（F=37.108，P<0.001）。兩組不同時間的逃避潛伏期經重復測量方差分析結果顯示，時間效應（F=9.282，P<0.001）、組別效應（F=22.167，P<0.001）均有統計學意義，組別與時間效應不存在交互作用（F=0.134，P=0.940）。從不同時間點來看，5 d 中不同組別同性別間分別比較，雄性的潛伏期差異均有意義（第 1 天：P=0.034；第 2 天：P=0.005；第 3 天：P<0.001；第 4 天：P=0.004；第 5 天：P<0.001），雌性在第 4 天及第 5 天差異有統計學意義（第 4 天：P=0.019；第 5 天：P=0.022）。同一組別雌雄間比較，缺氧缺血組第 4 天及第 5 天差異有統計學意義（第 4 天：P=0.044；第 5 天：P=0.043）。見表 1、圖 2。
圖2
不同組別小鼠雌雄逃避潛伏期隨時間的變化趨勢
在空間探索實驗中，缺氧缺血組和假手術組目標區域停留時間（F=8.297，P<0.001）和目標區域進入次數（F=4.042，P=0.014）組間比較，差異均有統計學意義。不同組別同性別間分別比較，缺氧缺血組低于假手術組，差異有統計學意義（雄性目標區域停留時間：P=0.003，雌性目標區域停留時間：P=0.038；雄性目標區域進入次數：P=0.006，雌性目標區域進入次數：P=0.041）；同一組別雌雄間比較，缺氧缺血組雄性低于雌性，差異有統計學意義（目標區域停留時間：P=0.018；目標區域進入次數：P=0.032）。見表 1。
3 討論
新生兒 HIBD 是一項嚴重的公共衛生問題，是造成新生兒腦損傷的主要原因之一，并可能導致長期的運動、行為和認知障礙[7]。性別是 HIBD 重要的危險因素之一，也是重要的預后預測因素之一。臨床上男嬰患腦癱的風險高于女嬰，男嬰的認知和運動障礙程度重于女嬰[8]。其他研究也報道了新生鼠 HIBD 模型中的行為表現，包括過度活躍、學習和記憶能力受損，出現焦慮情緒等[9-10]，但關于新生兒 HIBD 的性別差異的資料比較少。因此，文獻中對新生兒缺氧缺血腦損傷是否以性別依賴的方式發生尚不清楚。雖然對新生兒腦損傷的動物研究很少單獨報道雄性和雌性間的差異，但臨床文獻也表明，女性通常不像男性那樣表現出嚴重的認知或記憶缺陷，尤其是在記憶方面[11-12]。因此，我們研究了新生小鼠缺氧缺血模型的學習記憶能力性別差異。通常出生第 7～10 天的新生鼠被用來制作缺氧缺血模型，相當于人類妊娠 36～40 周，而 C57BL/6 小鼠對缺氧缺血損傷特別敏感，適合用于新生兒腦損傷的研究[13]。本研究采用兩種不同的行為學手段觀察新生小鼠缺氧缺血腦損傷后學習記憶能力，包括空間位置覺、方向覺（空間定位）和工作記憶能力是否存在性別差異。
Morris 水迷宮實驗是通過實驗動物學習尋找隱藏在水中平臺的一種強迫游泳實驗，被廣泛用于評價大小鼠的學習記憶能力[14]，分為定位航行實驗和空間探索實驗，定位航行實驗反映空間位置覺，而空間探索實驗反映小鼠對方向覺（空間定位）的學習記憶能力[15]。Morris 水迷宮實驗發現，從第 1～5 天不同組別小鼠的逃避潛伏期都呈現逐漸下降趨勢，表明在每次訓練中各組小鼠學習尋找平臺的能力都得到相應提高，HIBD 小鼠，無論雌性還是雄性空間位置覺都發生減退，但對雄性影響更顯著。而以往也曾報道，研究了 CCR2 信號轉導通路是否會影響新生鼠 HIBD 的認知障礙[16]；與假手術組相比，缺氧缺血損傷的 CCR2 敲除的雄性小鼠在水迷宮中表現出長期空間學習障礙。表明 CCR2 信號可能以一種性別特異性的方式作用其中。在空間探索實驗中發現小鼠發生缺氧缺血后出現空間定位能力障礙，雄性小鼠表現更差。
Y 迷宮實驗主要用于測試動物的工作記憶能力[17]，在 Y 迷宮實驗中，缺氧缺血組小鼠的新異臂進入次數和總路程都少于假手術組，且對雄性的影響高于對雌性的影響。以上結果表明，新生小鼠發生 HIBD 后，不同性別的小鼠學習記憶能力存在差異，HIBD 對雄性小鼠學習記憶能力的影響高于對雌性的影響。目前關于 HIBD 性別差異的機制有很多說法，Sukhanova 等[18]發現，急性缺氧缺血影響了谷胱甘肽氧化還原系統和腦源性神經營養因子在新生鼠大腦的表達存在性別差異。一些證據顯示男性早期神經發育紊亂導致認知障礙易感性增加，可能與新生兒男性血漿睪酮水平顯著升高有關或者雌激素/黃體酮可能具有保護作用有關[19]。盡管如此，其性別差異的具體機制還是未知的。
綜上所述，新生小鼠 HIBD 后空間位置覺和空間定位能力，以及短期的工作記憶能力出現明顯損傷，不同性別存在差異，雄性小鼠的學習記憶能力損傷更為明顯。本研究為后續新生小鼠 HIBD 后學習記憶能力受損情況的性別差異提供了初步的行為學證據，但還缺少性別差異的可能機制研究，因此應進一步深入研究內在機制，提供更可靠的依據，對新生兒 HIBD 的治療和預后可能具有一定的積極作用。
缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）由圍產期缺氧缺血引起，主要導致白質病變[1]，并帶來長期神經發育障礙，如腦癱、學習障礙、多動癥、自閉癥[2-3]等。盡管新生兒醫學的進步使得患兒的存活率提高，但大多數國家 HIBD 的發生率仍有所增加[4]，且帶來嚴重的社會經濟負擔。臨床數據顯示大腦發育障礙的發生率存在性別差異，其中男性患病率高于女性，如男性發生早產、缺氧、腦室出血和感染的概率更高，男孩比女孩有更嚴重的長期認知缺陷，更有可能出現語言障礙和學習障礙[5]。然而，在許多涉及 HIBD 的基礎研究中，對雄性動物和雌性動物的使用并不明確，性別的差異尚未被考慮。因此，本實驗欲通過行為學探討性別對新生小鼠 HIBD 學習記憶能力的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無特定病原體級新生 C57BL/6 小鼠，日齡 10 d，50 只，雌雄各半，體質量 3.85～4.50 g，動物實驗許可證號為 SYXK（滇）K2015-0002，購買于昆明醫科大學實驗動物中心，光照控制 12 h，避光 12 h，室溫（23±2）℃，給予標準的飲用水和飼料，所有動物實驗均經昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會批準（KMMU2019066）。
1.2 儀器與設備
自制缺氧箱、Ox-Plus 氧濃度測試儀（鍵合電子有限公司）、異氟烷（山東科源制藥有限公司，貨號：H19990157）、5-0 帶線縫合針（友誠生物科技有限公司，貨號：1300512）、Morris 水迷宮實驗裝置、Y 迷宮實驗裝置，supermaze 視頻分析系統（上海欣軟科技有限公司）。
1.3 模型制備及分組
隨機數字表法將 50 只 C57BL/6 小鼠分為假手術組（22 只，雌雄各半）和缺氧缺血組（28 只，雌雄各半）。缺氧缺血組用異氟烷（25 μL/只）吸入麻醉后，將其固定在無菌動物手術臺上，切開頸部皮膚，切口為 5～10 mm，分離出左側頸總動脈，用 5-0 絲線雙重結扎左側頸總動脈后離斷，接著縫合傷口。整個手術過程時間控制在 10 min 內。手術后放在帶有母鼠氣味的墊料上休息 30 min，之后回到母鼠身邊休息 1 h，再置于含有 8% 氧氣和 92% 氮氣混合氣體的 34℃ 恒溫缺氧箱中 45 min。假手術組僅切開左側頸部皮膚，暴露頸總動脈，未結扎，并直接縫合傷口。造模結束后兩組小鼠放回母鼠身邊自由飲食。
1.4 小鼠模型的評價
1.4.1 神經行為學評價
用 Longa 評分測試[6]，于造模 24 h 后對小鼠進行神經缺損功能評分：① 0 分：無神經損傷癥狀；② 1 分：不能完全伸展對側前爪；③ 2 分：先癱瘓側轉圈；④ 3 分：向對側傾倒；⑤ 4 分：能自發行走，意識喪失。
1.4.2 腦組織形態及病理評估
行為學評分結束后，灌注取腦，經 4% 多聚甲醛浸泡固定，10%、15%、30% 蔗糖溶液梯度脫水、冷凍包埋劑包埋、10 μm 冰凍切片，常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察腦組織形態學改變。
1.5 行為學實驗
兩組小鼠在成年后，即出生第 60～62 天進行 Y 迷宮實驗，第 63～69 天進行 Morris 水迷宮實驗，觀察并記錄實驗數據。在實驗開始之前先讓動物適應環境 3 d。
1.5.1 Y 迷宮實驗
Y 迷宮由 3 個臂組成，臂與臂之間夾角為 120°，每個臂大小（長×寬×高）為 10 cm×5 cm×5 cm。首先用擋板遮住新異臂，將小鼠放在 Y 迷宮中自由探索 10 min。結束后將小鼠取出放回籠中休息 1 h；1 h 后將新異臂擋板取出，小鼠從起始臂進入，使其在 3 個臂自由活動，記錄其 5 min 內在 3 個臂的停留時間。
1.5.2 Morris 水迷宮實驗
Morris 水迷宮實驗裝置由圓形水池（水池直徑為 120 cm）、攝像系統、平臺（直徑×高度：6 cm×30 cm）以及動物行為軌跡分析系統組成。實驗分為 3 個階段進行：① 適應性訓練：實驗前 1 d 將小鼠放入無平臺的圓形水池中，自由游泳 10 min，使小鼠適應游泳。② 定位航行實驗：將平臺置于任一象限，每天將小鼠從水池的 4 個象限放入水中，連續 5 d，4 次/d，4 次均按照不同象限順序，每次訓練 90 s，一次訓練結束后休息 60 s 再進行下一次訓練。攝像系統將全程記錄小鼠的運動軌跡，限時 90 s，讓小鼠尋找并爬上隱藏平臺，在平臺停留時間>3 s 視為成功。90 s 內未找到平臺的將其引導置于平臺上站立 15 s，再將其從平臺上拿下來，休息 60 s，進行下一次訓練。若小鼠的逃避潛伏期>90 s，則記錄為 90 s，記錄小鼠的逃避潛伏期。③ 空間探索實驗：實驗第 7 天，撤掉平臺，將小鼠從水池壁任一位置放入無平臺水中（所有實驗小鼠同一入水點），自由游泳。記錄 90 s 內小鼠在目標區域停留時間以及目標區域進入次數。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行統計分析。計量資料服從正態分布以均數±標準差表示，采用完全隨機設計資料的方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用 LSD-t 檢驗。計數資料采用只數和百分比表示。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠模型評價
缺氧缺血組在造模過程中死亡 4 只，其中 1 只缺血處理死亡，3 只缺氧處理死亡；另外根據 Longa 評分測試排除 0 分模型小鼠 4 只（造模未成功），建模成功率為 71.4%（20/28），20 只模型小鼠入組實驗。假手術組建模過程無死亡小鼠，建模成功率為 100.0%（22/22），22 只模型小鼠均入組實驗。在后續 2 個月的生長發育中，缺氧缺血組和假手術組均無小鼠死亡。
HE 染色結果發現，缺氧缺血組左側大腦組織分層結構較不明顯，細胞腫脹，間隙增大，部分神經元細胞體積縮小，細胞核固縮且染色加深，細胞核不清楚。而假手術組大腦組織結構清晰，邊界清楚，細胞排列有序，形態規則。見圖 1。
圖1
兩組小鼠左側大腦皮質和海馬組織 HE 染色像
2.2 Y 迷宮實驗比較
缺氧缺血組的新異臂進入次數和新異臂總路程與假手術組比較，差異均有統計學意義［新異臂進入次數：（6.43±0.31） vs. （9.71±0.76）次，F=16.068，P<0.001；新異臂總路程：（10 768.31±671.13） vs. （17 269.17±2 122.01）mm，F=8.532，P=0.007］。同性別中組間比較，假手術組明顯高于缺氧缺血組，差異有統計學意義（雄性新異臂進入次數：P=0.001，雌性新異臂進入次數：P=0.012；雄性新異臂總路程： P=0.010，雌性新異臂總路程：P=0.046）；同一組別雌雄間比較，缺氧缺血組雌性的新異臂進入次數（P=0.039）和新異臂總路程（P=0.043）均高于缺氧缺血組雄性。見表 1。
表1
不同組別小鼠雌雄在 Y 迷宮實驗和 Morris 水迷宮實驗比較（）
2.3 Morris水迷宮實驗比較
在定位航行實驗中，每次訓練各組小鼠學習尋找平臺的能力都得到相應提高，從第 1～5 天不同組別雌雄小鼠的逃避潛伏期都呈現逐漸下降趨勢（F=37.108，P<0.001）。兩組不同時間的逃避潛伏期經重復測量方差分析結果顯示，時間效應（F=9.282，P<0.001）、組別效應（F=22.167，P<0.001）均有統計學意義，組別與時間效應不存在交互作用（F=0.134，P=0.940）。從不同時間點來看，5 d 中不同組別同性別間分別比較，雄性的潛伏期差異均有意義（第 1 天：P=0.034；第 2 天：P=0.005；第 3 天：P<0.001；第 4 天：P=0.004；第 5 天：P<0.001），雌性在第 4 天及第 5 天差異有統計學意義（第 4 天：P=0.019；第 5 天：P=0.022）。同一組別雌雄間比較，缺氧缺血組第 4 天及第 5 天差異有統計學意義（第 4 天：P=0.044；第 5 天：P=0.043）。見表 1、圖 2。
圖2
不同組別小鼠雌雄逃避潛伏期隨時間的變化趨勢
在空間探索實驗中，缺氧缺血組和假手術組目標區域停留時間（F=8.297，P<0.001）和目標區域進入次數（F=4.042，P=0.014）組間比較，差異均有統計學意義。不同組別同性別間分別比較，缺氧缺血組低于假手術組，差異有統計學意義（雄性目標區域停留時間：P=0.003，雌性目標區域停留時間：P=0.038；雄性目標區域進入次數：P=0.006，雌性目標區域進入次數：P=0.041）；同一組別雌雄間比較，缺氧缺血組雄性低于雌性，差異有統計學意義（目標區域停留時間：P=0.018；目標區域進入次數：P=0.032）。見表 1。
3 討論
新生兒 HIBD 是一項嚴重的公共衛生問題，是造成新生兒腦損傷的主要原因之一，并可能導致長期的運動、行為和認知障礙[7]。性別是 HIBD 重要的危險因素之一，也是重要的預后預測因素之一。臨床上男嬰患腦癱的風險高于女嬰，男嬰的認知和運動障礙程度重于女嬰[8]。其他研究也報道了新生鼠 HIBD 模型中的行為表現，包括過度活躍、學習和記憶能力受損，出現焦慮情緒等[9-10]，但關于新生兒 HIBD 的性別差異的資料比較少。因此，文獻中對新生兒缺氧缺血腦損傷是否以性別依賴的方式發生尚不清楚。雖然對新生兒腦損傷的動物研究很少單獨報道雄性和雌性間的差異，但臨床文獻也表明，女性通常不像男性那樣表現出嚴重的認知或記憶缺陷，尤其是在記憶方面[11-12]。因此，我們研究了新生小鼠缺氧缺血模型的學習記憶能力性別差異。通常出生第 7～10 天的新生鼠被用來制作缺氧缺血模型，相當于人類妊娠 36～40 周，而 C57BL/6 小鼠對缺氧缺血損傷特別敏感，適合用于新生兒腦損傷的研究[13]。本研究采用兩種不同的行為學手段觀察新生小鼠缺氧缺血腦損傷后學習記憶能力，包括空間位置覺、方向覺（空間定位）和工作記憶能力是否存在性別差異。
Morris 水迷宮實驗是通過實驗動物學習尋找隱藏在水中平臺的一種強迫游泳實驗，被廣泛用于評價大小鼠的學習記憶能力[14]，分為定位航行實驗和空間探索實驗，定位航行實驗反映空間位置覺，而空間探索實驗反映小鼠對方向覺（空間定位）的學習記憶能力[15]。Morris 水迷宮實驗發現，從第 1～5 天不同組別小鼠的逃避潛伏期都呈現逐漸下降趨勢，表明在每次訓練中各組小鼠學習尋找平臺的能力都得到相應提高，HIBD 小鼠，無論雌性還是雄性空間位置覺都發生減退，但對雄性影響更顯著。而以往也曾報道，研究了 CCR2 信號轉導通路是否會影響新生鼠 HIBD 的認知障礙[16]；與假手術組相比，缺氧缺血損傷的 CCR2 敲除的雄性小鼠在水迷宮中表現出長期空間學習障礙。表明 CCR2 信號可能以一種性別特異性的方式作用其中。在空間探索實驗中發現小鼠發生缺氧缺血后出現空間定位能力障礙，雄性小鼠表現更差。
Y 迷宮實驗主要用于測試動物的工作記憶能力[17]，在 Y 迷宮實驗中，缺氧缺血組小鼠的新異臂進入次數和總路程都少于假手術組，且對雄性的影響高于對雌性的影響。以上結果表明，新生小鼠發生 HIBD 后，不同性別的小鼠學習記憶能力存在差異，HIBD 對雄性小鼠學習記憶能力的影響高于對雌性的影響。目前關于 HIBD 性別差異的機制有很多說法，Sukhanova 等[18]發現，急性缺氧缺血影響了谷胱甘肽氧化還原系統和腦源性神經營養因子在新生鼠大腦的表達存在性別差異。一些證據顯示男性早期神經發育紊亂導致認知障礙易感性增加，可能與新生兒男性血漿睪酮水平顯著升高有關或者雌激素/黃體酮可能具有保護作用有關[19]。盡管如此，其性別差異的具體機制還是未知的。
綜上所述，新生小鼠 HIBD 后空間位置覺和空間定位能力，以及短期的工作記憶能力出現明顯損傷，不同性別存在差異，雄性小鼠的學習記憶能力損傷更為明顯。本研究為后續新生小鼠 HIBD 后學習記憶能力受損情況的性別差異提供了初步的行為學證據，但還缺少性別差異的可能機制研究，因此應進一步深入研究內在機制，提供更可靠的依據，對新生兒 HIBD 的治療和預后可能具有一定的積極作用。
