引用本文： 戴仲秋, 唐思詩, 范玉潔, 宋啟飛, 王遠芳, 袁余, 舒玲, 謝軼. 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在分枝桿菌鑒定中的應用. 華西醫學, 2019, 34(8): 844-849. doi: 10.7507/1002-0179.201907080 復制
據世界衛生組織估計，全球約有 1/4 的人感染結核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC），而每年約有 1 000 萬新增結核病例，每年死亡 500 萬病例，全球結核形勢不容忽視[1]。近年來非結核分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）引起的感染也越來越多，NTM 感染引起的疾病也越發引起關注[2]。MTC 感染和 NTM 感染發病的治療完全不同，現階段微生物的檢驗方法無法滿足臨床對分枝桿菌治療的需求，目前分枝桿菌實驗室診斷的主要方法包括抗酸染色、羅丹明-金胺 O 染色、分枝桿菌培養、結核 T 淋巴細胞 γ 干擾素釋放實驗和結核抗體實驗等。熒光染色、結核 T 淋巴細胞 γ 干擾素釋放實驗和結核抗體靈敏度高但特異性相對較差。抗酸染色是一種微生物實驗室廣泛使用的檢測方法，該方法特異性高，但靈敏度極差，常出現漏檢。抗酸染色能確證抗酸陽性菌，但不能排除 NTM、諾卡菌屬（弱抗酸染色）、紅球菌屬、戈登菌屬等其他細菌的干擾，分枝桿菌培養特異性強，但結核分枝桿菌代謝較慢，生長周期很長，陽性菌再通過傳統的方法進行鑒定耗時更長，目前可以快速對 NTM 和 MTC 進行鑒定區別的主要方法是 MPT64 膠體金法、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）法，其中 PCR 方法是細菌鑒定中的金標準，但操作較為復雜，耗費較高，需要熟練的操作人員，且 NTM 的鑒定較為復雜，不同的 NTM 菌株使用 PCR-測序引物不同，尚未有統一的實驗室測序方案[3]。因此，結核分枝桿菌的鑒定需要實驗室統一的、操作相對簡單且快速可行的鑒定方法，而 MALDI-TOF MS 法對結核分枝桿菌的鑒定提供了一種新的微生物學手段[4]，其可在普通細菌鑒定中已經得到充分應用，而該方法在分枝桿菌中的應用效果尚未得到充分評估，因此本研究將 MALDI-TOF MS 法應用于臨床分離的分枝桿菌鑒定中去，以驗證其在分枝桿菌鑒定中的可行性以及準確性等。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 一般資料
收集 2014 年—2017 年四川大學華西醫院所有結核分枝桿菌培養陽性且抗酸染色陽性的待測菌株，并剔除同一時間、同一患者送檢的重復菌株。本研究已通過四川大學華西醫院臨床試驗與生物醫學倫理專委會審查［2014 年審（198）號］。
1.2 方法
納入菌株需全部經歷抗酸染色、初步鑒定、MALDI-TOF MS 法鑒定和雙重引物 PCR（duplex primer-polymerase chain reaction，Duplex-PCR）鑒定。
1.2.1 分枝桿菌培養和抗酸染色
分枝桿菌培養采用中性羅氏培養基（珠海貝索生物技術有限公司）和 BACREC MGIT 960 結核培養儀［美國 Becton Dickinson，碧迪醫療器械（上海）有限公司］培養，按照廠家說明書進行。陽性標本進行抗酸染色確認為抗酸桿菌。采用全自動抗酸染片儀進行染色（上海皓信生物科技有限公司），染色方法為改良的萋-尼染色法。
1.2.2 初步鑒定
通過結核分枝桿菌藥敏試劑盒（鄭州安圖生物工程股份有限公司）中的對硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）/噻吩-2-羧酸肼（2-thiophenecarboxylic acid hydrazide，TCH）[5]來初步區分結核分枝桿菌、牛型結核分枝桿菌和 NTM。
1.2.3 MALDI-TOF MS 法鑒定
采用德國布魯克公司的 MALDI-TOF MS 儀器鑒定，操作方法：MALDI-TOF MS 法根據廠家建議方法進行，并根據實驗室具備條件略作改進。首先對菌株進行生物滅活，將分枝桿菌液體培養管采用 95℃ 水浴加熱 30 min，以離心力 18 759 ×g 離心 3～5 min，然后棄掉上清液，保留沉淀。加入 500 μL 水洗滌 3 次，渦旋震蕩重懸菌體，以離心力 18 759 ×g 離心 2 min，然后棄掉上清液，保留沉淀。加入 900 μL 無水乙醇，300 μL 去離子水，置 5～10 min，以離心力 18 759 ×g 離心 2 min，然后棄掉上清液，保留沉淀。加入一定量玻璃珠（0.5 mm），依菌體體積加入 10～50 μL 乙腈，劇烈震蕩 5～10 min。加入同乙腈等體積的 70% 甲酸溶液，劇烈震蕩 3 min。以離心力 18 759 ×g 離心 3 min，取 1 μL 上清液用于質譜靶板，待靶板晾干后，加入 1 μL 新鮮配置的 α-氰-4-羥基苯丙烯酸基質溶液，晾干靶板，放入質譜儀運行鑒定，并記錄質譜鑒定結果及鑒定分數［質譜的鑒定分數代表質譜鑒定結果（圖譜）與數據庫的匹配程度，分值越高代表匹配度越高］。根據使用說明書>1.9 分為可信，<1.5 分為不可信，因此以 1.5 和 1.9 分對菌株進行分組分析，剔除<1.5 分菌株。
1.2.4 Duplex-PCR 鑒定 MCT 和 NTM
Duplex-PCR 鑒定是以 PCR 方法檢測 MTC 菌株基因組中特征性的 rpoB 基因[6]。將標本置于金屬浴加熱器中 100 ℃ 煮沸裂解 10 min，冷卻后 12 000 r/min 離心 10 min，取上清液置于另一無菌 1.5 mL 塑料離心管中，該上清液即為 PCR 擴增模板 DNA，-80 ℃ 低溫冰箱保存待用；PCR 引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司完成合成，MTC 特異性序列使用引物 tbcl 和 tbcr5，NTM 特異性序列使用引物 M5 和 RM3[7]；反應總體系 20 μL。體系配制：2 × TSINGKE Master Mix（成都擎科梓熙生物技術有限公司）7.5 μL，去離子水 5.5 μL，引物 2 μL（0.5 μL×4，10 μM），5 μL DNA 模板。每次配制 100 份 PCR 預混液，混勻后用微量加樣器將 15 μL 預混液分別加入至 96 孔板的每個孔中，然后分別將實驗菌株 5 μL DNA 模板加入至 96 孔中，做好記錄并放入 PCR 儀器（美國 Bio-Bad 公司）進行擴增；使用 1.5% 瓊脂糖凝膠（含 GoldView TM 核酸染料）電泳 PCR 擴增產物（5 μL 點樣量），設定 135 V 電壓、400 mA 電流電泳 35 min。使用 100 bp DNA ladder Marker（成都擎科梓熙生物技術有限公司）確定相對分子質量的大小，以標準菌株 H37 Rv 相應 PCR 擴增產物作為陽性對照，去離子水作為陰性對照。用 Bio-Rad Gel DocXR（美國 Bio-Bad 公司）凝膠成像儀分析電泳結果，電泳結果出現 235 bp 條帶，即為 MTC 菌株，結果出現 136 bp 條帶為 NTM，結果若無條帶，重復試驗，重復 2 次后均無目的條帶出現，判定該標本 DNA 提取失敗，最后以 Duplex-PCR 方法為鑒定金標準與傳統 PNB/TCH 法和 MALDI-TOF MS 法相互比較。
1.2.5 16S 核糖體 RNA（ribosomal RNA，rRNA）基因測序[8 ]
將培養的標準菌株及臨床陽性培養菌株經高壓滅菌后，取 1 mL 混懸液于 100℃ 熱板煮沸裂解，20～30 min，12 000 r/min 離心 5 min，取上清液備用（–80℃ 冷凍保存）；將 Duplex-PCR 擴增條帶在 136 bp 的疑似 NTM 菌株進行擴增測序，運用引物 TB-28S（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 TB-264（5’-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3’）[9]進行 PCR 擴增，產物大小 570 bp（引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司完成合成）；PCR 擴增體系：離子水 13 μL，2×Master mix（成都擎科梓熙生物技術有限公司）25 μL，引物 2 μL（各 1 μL），10 μL DNA 模板；做好記錄并放入 PCR 儀器（美國 Bio-Bad 公司）進行擴增，將 PCR 陽性產物送擎科生物技術有限公司進行測序。
1.3 統計學方法
采用 Excel、SPSS 21.0 軟件將收集到的相關數據進行統計學分析。偏態分布的計量資料采用中位數表示；計數資料采用例數、株數和百分比表示。鑒定結果比較采用 kappa 檢驗，kappa<0.4 說明一致程度不夠理想，kappa≥0.75 說明取得相當滿意的一致程度。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 樣本信息
篩選出就診且送檢培養陽性的患者 237 例。其中，男 153 例，女 84 例，男女性別比為 1.82∶1；中位年齡 38 歲，其中≤20 歲 31 例（13.08%）、21～40 歲 92 例（38.82%）、41～60 歲 59 例（24.89%）、>60 歲 55 例（23.21%）。科室來源分別為：結核科 129 例（54.43%）、門/急診 51 例（21.52%）、呼吸科 21 例（8.86%）、骨科 11 例（4.64%）、其他科室 25 例（10.55%）。標本類型構成以痰液標本最多（60.76%），其次是肺泡灌洗液（17.30%）、胸腹水（6.75%）等，見表1。
表1
2014 年—2016 年結核病患者培養陽性標本構成（n=237）
2.2 鑒定結果
237 株分枝桿菌中，Duplex-PCR 鑒定確證 MTC 218 株，NTM 19 株；PNB/TCH 法鑒定結果為 MTC 209 株，NTM 28 株；MALDI-TOF MS 法鑒定結果為 MTC 199 株，NTM 32 株，其他 6 株；PNB/TCH 與 Duplex-PCR 結果一致性較好（kappa=0.788，P<0.01）；MALDI-TOF MS 與 Duplex-PCR 結果存在一致性（kappa=0.541，P<0.01）；PNB/TCH 與 MALDI-TOF MS 法的鑒定結果存在一致性（kappa=0.581，P<0.01）。見表2～4，部分結果見圖1。
表2
PNB/TCH 法與 Duplex-PCR 鑒定結果比較
表4
MALDI-TOF MS 法與 PNB/TCH 法鑒定結果比較
圖1
運用Duplex-PCR對MTC和NTM進行區分的部分結果
使用 100 bp DNA ladder Marker 確定相對分子質量的大小，以標準菌株 H37Rv 相應 PCR 擴增產物作為陽性對照，NTM 結果為 136 bp，MTC 結果為 235 bp，各泳道代表不同的菌株通過 Duplex-PCR 方法擴增后所得到的電泳結果，從左到右分別為各個樣本電泳圖中雙重引物 PCR 所得到的產物片段大小 1～14 號和 17 號為 MTC，產物大小為 235 bp，15 和 16 號為 NTM，產物大小為 136 bp
表3
MALDI-TOF MS 法與 Duplex-PCR 鑒定結果比較
PNB/TCH 法對 MTC 鑒定靈敏度為 95.9%，特異度為 100.0%，陽性預測值 100.0%，陰性預測值 67.9%；對 NTM 鑒定靈敏度為 100.0%，特異度為 95.9%，陽性預測值 67.9%，陰性預測值 100.0%。MALDI-TOF MS 法對 MTC 鑒定靈敏度為 91.3%，特異度為 100.0%，陽性預測值 100.0%，陰性預測值 50.0%；對 NTM 鑒定靈敏度為 68.4%，特異度為 94.0%，陽性預測值 40.6%，陰性預測值 97.1%。
2.3 MALDI-TOF MS 法對分枝桿菌鑒定的結果
MALDI-TOF MS 法鑒定的 199 株結核分枝桿菌中，鑒定分數>1.9 分的菌株 168 株（84.4%），1.5～1.9 分的菌株 31 株（15.6%）；其中 NTM 的 MALDI-TOF MS 鑒定結果與 16S rRNA 基因測序結果見表5。部分菌株 MALDI-TOF MS 鑒定所得到的蛋白指紋峰值圖譜結果見圖2。
表5
MALDI-TOF MS 與 16S rRNA 測序對 NTM 鑒定結果比較（株）
圖2
運用 MALDI-TOF MS 區分 MTC 和 NTM 所得到的部分結果
橫坐標
3 討論
2004 年 MALDI- TOF MS 基質液的改進，使得應用蛋白對細菌鑒定的方法可以真正的在臨床應用[10]，目前國內外使用 MALDI-TOF-MS 法進行細菌鑒定、耐藥檢測、細菌分型以及毒力檢測的研究受到關注，方法應用和改進層出不窮。然而較少的研究摸索 MALDI-TOF MS 對分枝桿菌進行臨床常規的鑒定方法[11-13]。
分枝桿菌的抗酸染色和分離鑒定是影響結核病診斷、治療的關鍵因素，分枝桿菌因其特殊的代謝方式，傳統的鑒定手段需要 4 周以上的時間，而目前臨床常用的利用 PNB 和 TCH 來鑒定分枝桿菌的方法也需要 2 周左右的時間[14-15]。分枝桿菌的鑒定分為區別 MTC 和 NTM 以及鑒定 NTM 到種水平的 2 個步驟，結核分枝桿菌抗原 MPT64 檢測金標方法和 PNB/TCH 方法均是區別 MTC 和 NTM 的方法；其中結核分枝桿菌抗原 MPT64 檢測金標方法特異度和靈敏度 100%，顯示出較好的應用前景[16-17]，PNB/TCH 方法是利用藥物對分枝桿菌生物毒性進行區分鑒定[18]，但結核分枝桿菌抗原 MPT64 檢測金標法和 PNB/TCH 方法均是表型分類方法之一，不能將 NTM 鑒定到種水平，并且其他非分枝桿菌屬的細菌生長，容易干擾鑒定結果，而不同的 NTM 菌株感染治方案存才差異[19]。MALDI-TOF MS 鑒定和 PCR-測序鑒定分枝桿菌既可區別 MTC 和 NTM 又可將 NTM 鑒定到種水平，然而 PCR-測序方法步驟復雜，操作要求高，測序比對時間較長；而 MALDI- TOF MS 鑒定時間短，僅需數小時，準確性高，無需復雜的操作，有廣闊的應用前景[20-21]，但質譜鑒定的原理是通過對蛋白分析得出細菌的蛋白指紋圖譜，再通過計算機算法與數據庫進行比較，得出一個與結果高相似度的歸類并以分值的形式體現，因此數據庫容量對 MALDI-TOF-MS 鑒定結果的正確性有很大影響[22]；本研究使用的 MALDI-TOF-MS，其分枝桿菌數據庫為 Bruker 公司委托法國馬賽 POLMIT 醫院的分枝桿菌參考實驗室建立的，包括 62 種 177 株參考菌，整個數據庫有 3 438 條目錄，Bruker 公司生產的質譜儀所使用的 MTC 數據庫是根據歐美地區 MTC 非北京株蛋白的指紋圖譜建立，而亞洲地區主要是以 MTC 北京株為主，在遺傳距離上存在差異，存在蛋白表達差異的可能[23]，在本研究中無論是 MTC 還是 NTM 鑒定中均有部分樣本被鑒定錯誤，并且數據庫中缺少胞內分枝桿菌蛋白指紋圖譜，可能就是由于數據不夠完善所致；德國 Bruker 公司生產的質譜儀提供自建庫功能，可按照標準方法進一步擴充完善數據庫儲備，但在自建分枝桿菌數據庫過程中，由于分枝桿菌在生長傳代過程中極易發生細胞壁缺失，發生 L 型變異，而結核的 L 型變異會導致蛋白的構成發生改變[24]，因此在擴充質譜自建庫的時候應當選用新鮮傳代的菌落來提取蛋白。
質譜鑒定分析要求必須能夠提取到足夠分析的待測細菌的生物蛋白，在進行分枝桿菌在分枝桿菌蛋白提取過程中，由于分枝桿菌的特殊生物結構，普通的方法無法破壞分枝桿菌的細胞壁結構，需要添加甲酸、乙腈以及 0.5 mm 的硅珠進行碾磨提取[25]。由于結核分枝桿菌具有很強的生物危害性，在滅活分枝桿菌的方法上，以往我們曾嘗試過 100 ℃ 以上高壓滅活的方法，但實驗結果結果很不理想，之后采用 95 ℃ 30 min 水浴的方法，質譜鑒定分值明顯提高。而在質譜樣本處理過程中，各步驟操作應當連續，盡量避免中途樣本長時間擱置；在本研究中，使用的滅活方法是直接對分枝桿菌液體培養指示管進行95 ℃水浴加熱的方法，在水浴后應當盡早離心去掉上清液，避免溫度降低后析出其他雜質對結果產生影響；在加入無水乙醇后，樣本不宜靜置過長時間，否則在后續處理過程中會影響最終結果。
本研究結果表明質譜對 MTC 的鑒定、NTM 鑒定與傳統 PNB/TCH 鑒定方法結果存在一致性，相較傳統的分枝桿菌鑒定方法需要數周時間，MALDI-TOF MS 法對分枝桿菌的鑒定僅需要數小時便能得到結果，且 MALDI-TOF 鑒定分枝桿菌成本低廉，因此有望成為新的鑒定分枝桿菌的方法，在臨床微生物實驗室常規使用。
據世界衛生組織估計，全球約有 1/4 的人感染結核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC），而每年約有 1 000 萬新增結核病例，每年死亡 500 萬病例，全球結核形勢不容忽視[1]。近年來非結核分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）引起的感染也越來越多，NTM 感染引起的疾病也越發引起關注[2]。MTC 感染和 NTM 感染發病的治療完全不同，現階段微生物的檢驗方法無法滿足臨床對分枝桿菌治療的需求，目前分枝桿菌實驗室診斷的主要方法包括抗酸染色、羅丹明-金胺 O 染色、分枝桿菌培養、結核 T 淋巴細胞 γ 干擾素釋放實驗和結核抗體實驗等。熒光染色、結核 T 淋巴細胞 γ 干擾素釋放實驗和結核抗體靈敏度高但特異性相對較差。抗酸染色是一種微生物實驗室廣泛使用的檢測方法，該方法特異性高，但靈敏度極差，常出現漏檢。抗酸染色能確證抗酸陽性菌，但不能排除 NTM、諾卡菌屬（弱抗酸染色）、紅球菌屬、戈登菌屬等其他細菌的干擾，分枝桿菌培養特異性強，但結核分枝桿菌代謝較慢，生長周期很長，陽性菌再通過傳統的方法進行鑒定耗時更長，目前可以快速對 NTM 和 MTC 進行鑒定區別的主要方法是 MPT64 膠體金法、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）法，其中 PCR 方法是細菌鑒定中的金標準，但操作較為復雜，耗費較高，需要熟練的操作人員，且 NTM 的鑒定較為復雜，不同的 NTM 菌株使用 PCR-測序引物不同，尚未有統一的實驗室測序方案[3]。因此，結核分枝桿菌的鑒定需要實驗室統一的、操作相對簡單且快速可行的鑒定方法，而 MALDI-TOF MS 法對結核分枝桿菌的鑒定提供了一種新的微生物學手段[4]，其可在普通細菌鑒定中已經得到充分應用，而該方法在分枝桿菌中的應用效果尚未得到充分評估，因此本研究將 MALDI-TOF MS 法應用于臨床分離的分枝桿菌鑒定中去，以驗證其在分枝桿菌鑒定中的可行性以及準確性等。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 一般資料
收集 2014 年—2017 年四川大學華西醫院所有結核分枝桿菌培養陽性且抗酸染色陽性的待測菌株，并剔除同一時間、同一患者送檢的重復菌株。本研究已通過四川大學華西醫院臨床試驗與生物醫學倫理專委會審查［2014 年審（198）號］。
1.2 方法
納入菌株需全部經歷抗酸染色、初步鑒定、MALDI-TOF MS 法鑒定和雙重引物 PCR（duplex primer-polymerase chain reaction，Duplex-PCR）鑒定。
1.2.1 分枝桿菌培養和抗酸染色
分枝桿菌培養采用中性羅氏培養基（珠海貝索生物技術有限公司）和 BACREC MGIT 960 結核培養儀［美國 Becton Dickinson，碧迪醫療器械（上海）有限公司］培養，按照廠家說明書進行。陽性標本進行抗酸染色確認為抗酸桿菌。采用全自動抗酸染片儀進行染色（上海皓信生物科技有限公司），染色方法為改良的萋-尼染色法。
1.2.2 初步鑒定
通過結核分枝桿菌藥敏試劑盒（鄭州安圖生物工程股份有限公司）中的對硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）/噻吩-2-羧酸肼（2-thiophenecarboxylic acid hydrazide，TCH）[5]來初步區分結核分枝桿菌、牛型結核分枝桿菌和 NTM。
1.2.3 MALDI-TOF MS 法鑒定
采用德國布魯克公司的 MALDI-TOF MS 儀器鑒定，操作方法：MALDI-TOF MS 法根據廠家建議方法進行，并根據實驗室具備條件略作改進。首先對菌株進行生物滅活，將分枝桿菌液體培養管采用 95℃ 水浴加熱 30 min，以離心力 18 759 ×g 離心 3～5 min，然后棄掉上清液，保留沉淀。加入 500 μL 水洗滌 3 次，渦旋震蕩重懸菌體，以離心力 18 759 ×g 離心 2 min，然后棄掉上清液，保留沉淀。加入 900 μL 無水乙醇，300 μL 去離子水，置 5～10 min，以離心力 18 759 ×g 離心 2 min，然后棄掉上清液，保留沉淀。加入一定量玻璃珠（0.5 mm），依菌體體積加入 10～50 μL 乙腈，劇烈震蕩 5～10 min。加入同乙腈等體積的 70% 甲酸溶液，劇烈震蕩 3 min。以離心力 18 759 ×g 離心 3 min，取 1 μL 上清液用于質譜靶板，待靶板晾干后，加入 1 μL 新鮮配置的 α-氰-4-羥基苯丙烯酸基質溶液，晾干靶板，放入質譜儀運行鑒定，并記錄質譜鑒定結果及鑒定分數［質譜的鑒定分數代表質譜鑒定結果（圖譜）與數據庫的匹配程度，分值越高代表匹配度越高］。根據使用說明書>1.9 分為可信，<1.5 分為不可信，因此以 1.5 和 1.9 分對菌株進行分組分析，剔除<1.5 分菌株。
1.2.4 Duplex-PCR 鑒定 MCT 和 NTM
Duplex-PCR 鑒定是以 PCR 方法檢測 MTC 菌株基因組中特征性的 rpoB 基因[6]。將標本置于金屬浴加熱器中 100 ℃ 煮沸裂解 10 min，冷卻后 12 000 r/min 離心 10 min，取上清液置于另一無菌 1.5 mL 塑料離心管中，該上清液即為 PCR 擴增模板 DNA，-80 ℃ 低溫冰箱保存待用；PCR 引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司完成合成，MTC 特異性序列使用引物 tbcl 和 tbcr5，NTM 特異性序列使用引物 M5 和 RM3[7]；反應總體系 20 μL。體系配制：2 × TSINGKE Master Mix（成都擎科梓熙生物技術有限公司）7.5 μL，去離子水 5.5 μL，引物 2 μL（0.5 μL×4，10 μM），5 μL DNA 模板。每次配制 100 份 PCR 預混液，混勻后用微量加樣器將 15 μL 預混液分別加入至 96 孔板的每個孔中，然后分別將實驗菌株 5 μL DNA 模板加入至 96 孔中，做好記錄并放入 PCR 儀器（美國 Bio-Bad 公司）進行擴增；使用 1.5% 瓊脂糖凝膠（含 GoldView TM 核酸染料）電泳 PCR 擴增產物（5 μL 點樣量），設定 135 V 電壓、400 mA 電流電泳 35 min。使用 100 bp DNA ladder Marker（成都擎科梓熙生物技術有限公司）確定相對分子質量的大小，以標準菌株 H37 Rv 相應 PCR 擴增產物作為陽性對照，去離子水作為陰性對照。用 Bio-Rad Gel DocXR（美國 Bio-Bad 公司）凝膠成像儀分析電泳結果，電泳結果出現 235 bp 條帶，即為 MTC 菌株，結果出現 136 bp 條帶為 NTM，結果若無條帶，重復試驗，重復 2 次后均無目的條帶出現，判定該標本 DNA 提取失敗，最后以 Duplex-PCR 方法為鑒定金標準與傳統 PNB/TCH 法和 MALDI-TOF MS 法相互比較。
1.2.5 16S 核糖體 RNA（ribosomal RNA，rRNA）基因測序[8 ]
將培養的標準菌株及臨床陽性培養菌株經高壓滅菌后，取 1 mL 混懸液于 100℃ 熱板煮沸裂解，20～30 min，12 000 r/min 離心 5 min，取上清液備用（–80℃ 冷凍保存）；將 Duplex-PCR 擴增條帶在 136 bp 的疑似 NTM 菌株進行擴增測序，運用引物 TB-28S（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 TB-264（5’-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3’）[9]進行 PCR 擴增，產物大小 570 bp（引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司完成合成）；PCR 擴增體系：離子水 13 μL，2×Master mix（成都擎科梓熙生物技術有限公司）25 μL，引物 2 μL（各 1 μL），10 μL DNA 模板；做好記錄并放入 PCR 儀器（美國 Bio-Bad 公司）進行擴增，將 PCR 陽性產物送擎科生物技術有限公司進行測序。
1.3 統計學方法
采用 Excel、SPSS 21.0 軟件將收集到的相關數據進行統計學分析。偏態分布的計量資料采用中位數表示；計數資料采用例數、株數和百分比表示。鑒定結果比較采用 kappa 檢驗，kappa<0.4 說明一致程度不夠理想，kappa≥0.75 說明取得相當滿意的一致程度。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 樣本信息
篩選出就診且送檢培養陽性的患者 237 例。其中，男 153 例，女 84 例，男女性別比為 1.82∶1；中位年齡 38 歲，其中≤20 歲 31 例（13.08%）、21～40 歲 92 例（38.82%）、41～60 歲 59 例（24.89%）、>60 歲 55 例（23.21%）。科室來源分別為：結核科 129 例（54.43%）、門/急診 51 例（21.52%）、呼吸科 21 例（8.86%）、骨科 11 例（4.64%）、其他科室 25 例（10.55%）。標本類型構成以痰液標本最多（60.76%），其次是肺泡灌洗液（17.30%）、胸腹水（6.75%）等，見表1。
表1
2014 年—2016 年結核病患者培養陽性標本構成（n=237）
2.2 鑒定結果
237 株分枝桿菌中，Duplex-PCR 鑒定確證 MTC 218 株，NTM 19 株；PNB/TCH 法鑒定結果為 MTC 209 株，NTM 28 株；MALDI-TOF MS 法鑒定結果為 MTC 199 株，NTM 32 株，其他 6 株；PNB/TCH 與 Duplex-PCR 結果一致性較好（kappa=0.788，P<0.01）；MALDI-TOF MS 與 Duplex-PCR 結果存在一致性（kappa=0.541，P<0.01）；PNB/TCH 與 MALDI-TOF MS 法的鑒定結果存在一致性（kappa=0.581，P<0.01）。見表2～4，部分結果見圖1。
表2
PNB/TCH 法與 Duplex-PCR 鑒定結果比較
表4
MALDI-TOF MS 法與 PNB/TCH 法鑒定結果比較
圖1
運用Duplex-PCR對MTC和NTM進行區分的部分結果
使用 100 bp DNA ladder Marker 確定相對分子質量的大小，以標準菌株 H37Rv 相應 PCR 擴增產物作為陽性對照，NTM 結果為 136 bp，MTC 結果為 235 bp，各泳道代表不同的菌株通過 Duplex-PCR 方法擴增后所得到的電泳結果，從左到右分別為各個樣本電泳圖中雙重引物 PCR 所得到的產物片段大小 1～14 號和 17 號為 MTC，產物大小為 235 bp，15 和 16 號為 NTM，產物大小為 136 bp
表3
MALDI-TOF MS 法與 Duplex-PCR 鑒定結果比較
PNB/TCH 法對 MTC 鑒定靈敏度為 95.9%，特異度為 100.0%，陽性預測值 100.0%，陰性預測值 67.9%；對 NTM 鑒定靈敏度為 100.0%，特異度為 95.9%，陽性預測值 67.9%，陰性預測值 100.0%。MALDI-TOF MS 法對 MTC 鑒定靈敏度為 91.3%，特異度為 100.0%，陽性預測值 100.0%，陰性預測值 50.0%；對 NTM 鑒定靈敏度為 68.4%，特異度為 94.0%，陽性預測值 40.6%，陰性預測值 97.1%。
2.3 MALDI-TOF MS 法對分枝桿菌鑒定的結果
MALDI-TOF MS 法鑒定的 199 株結核分枝桿菌中，鑒定分數>1.9 分的菌株 168 株（84.4%），1.5～1.9 分的菌株 31 株（15.6%）；其中 NTM 的 MALDI-TOF MS 鑒定結果與 16S rRNA 基因測序結果見表5。部分菌株 MALDI-TOF MS 鑒定所得到的蛋白指紋峰值圖譜結果見圖2。
表5
MALDI-TOF MS 與 16S rRNA 測序對 NTM 鑒定結果比較（株）
圖2
運用 MALDI-TOF MS 區分 MTC 和 NTM 所得到的部分結果
橫坐標
3 討論
2004 年 MALDI- TOF MS 基質液的改進，使得應用蛋白對細菌鑒定的方法可以真正的在臨床應用[10]，目前國內外使用 MALDI-TOF-MS 法進行細菌鑒定、耐藥檢測、細菌分型以及毒力檢測的研究受到關注，方法應用和改進層出不窮。然而較少的研究摸索 MALDI-TOF MS 對分枝桿菌進行臨床常規的鑒定方法[11-13]。
分枝桿菌的抗酸染色和分離鑒定是影響結核病診斷、治療的關鍵因素，分枝桿菌因其特殊的代謝方式，傳統的鑒定手段需要 4 周以上的時間，而目前臨床常用的利用 PNB 和 TCH 來鑒定分枝桿菌的方法也需要 2 周左右的時間[14-15]。分枝桿菌的鑒定分為區別 MTC 和 NTM 以及鑒定 NTM 到種水平的 2 個步驟，結核分枝桿菌抗原 MPT64 檢測金標方法和 PNB/TCH 方法均是區別 MTC 和 NTM 的方法；其中結核分枝桿菌抗原 MPT64 檢測金標方法特異度和靈敏度 100%，顯示出較好的應用前景[16-17]，PNB/TCH 方法是利用藥物對分枝桿菌生物毒性進行區分鑒定[18]，但結核分枝桿菌抗原 MPT64 檢測金標法和 PNB/TCH 方法均是表型分類方法之一，不能將 NTM 鑒定到種水平，并且其他非分枝桿菌屬的細菌生長，容易干擾鑒定結果，而不同的 NTM 菌株感染治方案存才差異[19]。MALDI-TOF MS 鑒定和 PCR-測序鑒定分枝桿菌既可區別 MTC 和 NTM 又可將 NTM 鑒定到種水平，然而 PCR-測序方法步驟復雜，操作要求高，測序比對時間較長；而 MALDI- TOF MS 鑒定時間短，僅需數小時，準確性高，無需復雜的操作，有廣闊的應用前景[20-21]，但質譜鑒定的原理是通過對蛋白分析得出細菌的蛋白指紋圖譜，再通過計算機算法與數據庫進行比較，得出一個與結果高相似度的歸類并以分值的形式體現，因此數據庫容量對 MALDI-TOF-MS 鑒定結果的正確性有很大影響[22]；本研究使用的 MALDI-TOF-MS，其分枝桿菌數據庫為 Bruker 公司委托法國馬賽 POLMIT 醫院的分枝桿菌參考實驗室建立的，包括 62 種 177 株參考菌，整個數據庫有 3 438 條目錄，Bruker 公司生產的質譜儀所使用的 MTC 數據庫是根據歐美地區 MTC 非北京株蛋白的指紋圖譜建立，而亞洲地區主要是以 MTC 北京株為主，在遺傳距離上存在差異，存在蛋白表達差異的可能[23]，在本研究中無論是 MTC 還是 NTM 鑒定中均有部分樣本被鑒定錯誤，并且數據庫中缺少胞內分枝桿菌蛋白指紋圖譜，可能就是由于數據不夠完善所致；德國 Bruker 公司生產的質譜儀提供自建庫功能，可按照標準方法進一步擴充完善數據庫儲備，但在自建分枝桿菌數據庫過程中，由于分枝桿菌在生長傳代過程中極易發生細胞壁缺失，發生 L 型變異，而結核的 L 型變異會導致蛋白的構成發生改變[24]，因此在擴充質譜自建庫的時候應當選用新鮮傳代的菌落來提取蛋白。
質譜鑒定分析要求必須能夠提取到足夠分析的待測細菌的生物蛋白，在進行分枝桿菌在分枝桿菌蛋白提取過程中，由于分枝桿菌的特殊生物結構，普通的方法無法破壞分枝桿菌的細胞壁結構，需要添加甲酸、乙腈以及 0.5 mm 的硅珠進行碾磨提取[25]。由于結核分枝桿菌具有很強的生物危害性，在滅活分枝桿菌的方法上，以往我們曾嘗試過 100 ℃ 以上高壓滅活的方法，但實驗結果結果很不理想，之后采用 95 ℃ 30 min 水浴的方法，質譜鑒定分值明顯提高。而在質譜樣本處理過程中，各步驟操作應當連續，盡量避免中途樣本長時間擱置；在本研究中，使用的滅活方法是直接對分枝桿菌液體培養指示管進行95 ℃水浴加熱的方法，在水浴后應當盡早離心去掉上清液，避免溫度降低后析出其他雜質對結果產生影響；在加入無水乙醇后，樣本不宜靜置過長時間，否則在后續處理過程中會影響最終結果。
本研究結果表明質譜對 MTC 的鑒定、NTM 鑒定與傳統 PNB/TCH 鑒定方法結果存在一致性，相較傳統的分枝桿菌鑒定方法需要數周時間，MALDI-TOF MS 法對分枝桿菌的鑒定僅需要數小時便能得到結果，且 MALDI-TOF 鑒定分枝桿菌成本低廉，因此有望成為新的鑒定分枝桿菌的方法，在臨床微生物實驗室常規使用。
