結核病診斷延遲及耐藥性結核病是對全球結核病疾病控制的巨大威脅，早期發現活動性結核，特別是耐藥結核分枝桿菌的檢出非常必要。該文著重闡述了分子診斷技術在結核分枝桿菌、耐藥結核分枝桿菌的快速檢測中的應用現狀，并結合結核分枝桿菌的臨床檢測疑難問題，探討了現有分子診斷技術的表現能力，以期為未來結核病的診斷提供理論思考。
引用本文： 焦琳, 李靖, 應斌武. 結核分枝桿菌的分子診斷進展. 華西醫學, 2019, 34(8): 839-843. doi: 10.7507/1002-0179.201907093 復制
由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的結核病是全世界十大死因之一，也是最大的單一感染性病原體引發致死的疾病。2018 年，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）統計報告顯示，全球新發結核病患者 1 000 萬例，多集中在非洲國家、印度、印度尼西亞和中國等中等發達國家和欠發達國家[1]。在這些高負擔國家，每 10 萬人口中新增結核病病例為 150～400 人[1]。更嚴峻的是，在結核病患者中，還有 55.8 萬人對利福平（rifampin，RIF）耐藥，其中 82% 為多重耐藥結核病例[1]。活動性結核的早期診斷，特別是對多耐藥和泛耐藥 MTB 的檢測是實施有效治療及公共衛生干預措施的必要前提。目前，實驗室診斷主要依賴涂片染色鏡檢法和 MTB 培養等傳統實驗室檢驗方法。涂片染色鏡檢法存在陽性率低、操作復雜、技術要求高等缺點，MTB 培養亦存在污染率高、檢測時間長等不足，致使全球近一半的結核病例不能通過實驗室確認，診斷延遲。隨著分子生物學的不斷發展，快速分子診斷技術在結核病早期診斷方面的應用不斷增加，許多國家正在逐步降低對傳統痰涂片染色顯微鏡檢驗的依賴。本文將圍繞 MTB 分子診斷方法的應用現狀和前景進行評述。
1 MTB的實驗室檢查現狀
MTB 的常規實驗室檢查方法為涂片染色鏡檢、分枝桿菌培養和核酸擴增試驗。分枝桿菌涂片染色鏡檢有 2 種，即 Ziehl-Neelsen 抗酸染色法和熒光染色法。抗酸染色法簡單經濟、特異性高，但其檢測限為每毫升未滅活痰涂片 5 000～10 000 個桿菌[2]，其靈敏度為 20%～80%[3-4]，尤其是對于兒童肺結核、肺外結核、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共感染等少菌性結核病例的靈敏度低[5]。熒光染色法使 MTB 在顯微鏡下呈現亮黃色而易于分辨，操作簡單且具有檢出迅速、陽性率高的優點，在少菌性結核標本中更能夠體現出優越性；但該法必須在暗室或遠離窗口的位置操作，且維修成本較高昂，限制了其在實驗室診斷中的廣泛使用。MTB 培養是結核病實驗室診斷的金標準。但是 MTB 對營養的要求高，需要使用特定的培養基。基于液體培養的快速培養系統有 BACTEC 460 系統、BACTEC MGIT 960 系統、MB Redox 系統等，分離率高于固體培養 L?wenstein-Jensen 法，報告時間大大縮短，對肺外標本如腦脊液等有明顯優勢。但 MTB 培養法仍有一些缺點阻礙了其作為結核病實驗室診斷的常規檢測，例如存在假陽性，需要專門的基礎設施、設備和人員，需要維持適當的生物安全等級，需要不間斷供電，等等。核酸擴增的引入促進了 MTB 診斷的巨大進步。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增特異性區域堿基序列被認為是鑒定分枝桿菌的金標準，16S 核糖體 RNA（ribosomal RNA，rRNA）是最常見的靶標。第一批商品化 PCR 方法的 MTB 鑒定試劑盒包括 COBAS Amplicor MTB 試劑盒、LCx MTB 試劑盒、BD ProbeTec 能量轉移系統等。然而，這些方法不能同時兼具使用方便性和經濟實惠性，因此無法完全滿足結核病實驗室診斷的臨床需求。
2 MTB分子診斷技術現狀
2.1 分子線性探針技術（molecular line probe assay，LPA）
LPA 是近年來興起的一種 PCR 技術，用生物素化的引物進行 PCR 擴增，與固定在膜上的特異性 DNA 探針雜交后進行酶聯免疫比色檢測，可用于 MTB 培養物、痰涂片標本及藥物耐藥突變檢測。
2.1.1 INNO-LiPA
INNO-LiPA 法是最早應用于臨床的 LPA，于 1995 年由比利時 Innogenetics 公司提出，可用于 MTB DNA 和 RIF 耐藥檢測。該技術基于對 16S 和 23S rRNA 片段的擴增，可以識別 MTB 和 16 種非結核分枝桿菌，從采集樣本到出結果需要 24～48 h。2008 年，WHO 批準將 INNO-LiPA 作為痰涂片陽性的多耐藥結核病患者的快速篩選。INNO-LiPA 檢測 RIF 耐藥可預測 85%～90% 的多耐藥結核[6]，靈敏度和特異度分別為 95% 和 100%[7]。盡管表現如此優異，手動操作、出報告周期長也限制了其在臨床的應用。
2.1.2 GenoType
GenoType 是由德國 Hain Lifescience 公司研制的檢測 MTB DNA 和一線、二線藥物耐藥突變的方法。2004 年推出的 GenoType MTBDR 產品（簡稱 MTBDR），存在 2 個主要不足：一是與表型藥敏試驗相比，雖然 MTBDR 對 RIF 耐藥檢測靈敏度較高，但對異煙肼（isoniazid，INH）耐藥的靈敏度偏低，靈敏度分別為 99% 和 88.4%[8]。二是 MTBDR 與 INNO-LiPA 是基于同樣的原理，同樣存在出報告周期長（24～48 h）的問題。GenoType 系列第二類產品 GenoType MTBDRplus 于 2007 年推出。MTBDRplus 除可以檢測 MTB DNA 及 RIF 耐藥外，還可檢測低水平 INH 耐藥，增加了耐多藥結核病的檢出率[9]。有研究統計，MTBDRplus 2.0 對 RIF 耐藥檢測的靈敏度和特異度分別為 98.1% 和 98.7%，而對 INH 耐藥的靈敏度會根據標本類型發生變化，波動范圍在 57%～100%[7]。MTBDRplus2.0 在 1.0 基礎上作了更新，擴增試劑例如 Taq 聚合酶和引物已經事先混合好，不再需要單獨配制，且可直接檢測痰涂片陰性標本。但兩者在出報告周期上是一樣的。GenoType 系列第三類產品 MTBDRsl 的原理與前兩類相同，但主要是針對二線藥物耐藥基因的檢測。與 MTBDRsl 1.0 相比，MTBDRsl 2.0 的靈敏度和特異度都有上升，對喹諾酮類藥物、氨基糖苷類藥物和卡那霉素藥物的靈敏度分別為 93%～100%、83.0%～91.3% 和 89.2%～96.0%，特異度分別為 98.4%、91.7%～100.0% 和 92.2%～98.5%[10-12]。WHO 于 2016 年批準 MTBDRsl 可用于檢測 MTB 培養物和痰標本，且不區分是來自痰涂片陰性或者陽性、來自肺或肺外組織的患者。然而，由于對痰涂片陰性病例的檢測不確定率高、對氟喹諾酮類和二線氨基糖苷類藥物檢測的準確性不同等原因，MTBDRsl 整體準確性降低。
2.2 Xpert MTB/RIF技術
2009 年一種由美國 Cepheid 公司開發的新型分子生物檢測方法 GeneXpert-MTB/RIF（簡稱 Xpert）開始應用于結核病診斷和藥物耐藥性檢測[13]。Xpert 檢測方法依靠全自動 GeneXpert 平臺，以巢式實時定量熒光 PCR 為基礎，以 rpoB 基因為靶基因，自動提取 DNA 并擴增，實現對 MTB DNA 及 RIF 耐藥性的檢測。Xpert 系統無需生物安全實驗室，結果由系統自動生成，不需要工作人員的處理，報告周期僅為 2 h[14-16]。Xpert 可以直接應用于未滅活或滅活了的呼吸道樣品、腦脊液、淋巴結組織、胸膜液、尿液等[17]。2013 年，Xpert 獲得美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于結核病的診斷和 RIF 耐藥檢測，對肺外結核和兒童結核也適用。Cocharane 提供 Xpert 診斷結核的靈敏度和特異度分別為 89% 和 99%，且對 HIV 共感染患者的靈敏度為 79%，低于非共感染患者的 86%[18]。Xpert 診斷肺外結核的靈敏度和特異度分別為 43.7%～84.9% 和 92.5%～99.9%[19]。盡管 Xpert 表現優異，復雜的臨床情況也對 Xpert 提出更高要求：在混合樣本中提高對 RIF 耐藥的檢測能力；降低對少菌型樣本的假陽性。
Xpert MTB/RIF Ultra（簡稱 Xpert Ultra）的出現是在 Xpert 的基礎上作的進一步改進，兩者采用相同的操作和試劑，可以在同一部儀器中運行，而 Xpert Ultra 只需要額外更新一個軟件。Xpert Ultra 與 Xpert 相比，假陰性率降低。以培養法為金標準，Xpert Ultra 的靈敏度（87.7%）高于 Xpert（82.9%），特異度（94.8%）低于 Xpert（98%）[20]。Xpert Ultra 還提高了對少菌型樣本的靈敏度，研究顯示，Xpert Ultra 對少菌型結核的靈敏度（87.8%）較 Xpert 升高（82.9%），但特異度降低（94.8% vs. 98%）[20-21]。不僅如此，Xpert Ultra 還對混合樣本中 RIF 耐藥的檢出率進行了提升，引物對突變的覆蓋度也作了修改[22]。對 RIF 耐藥突變的檢測，Xpert Ultra 和 Xpert 的準確度相似[22-23]。2017 年 WHO 推薦 Xpert Ultra 可取代 Xpert 用于結核病診斷和 RIF 耐藥檢測。值得注意的是，Xpert Ultra 在兒童結核中并不能取代 MTB 培養作為主要診斷方法[24]。
3 新興結核分子診斷技術
3.1 恒溫擴增檢測技術
由日本 Eiken Chemical 公司開發的 Loopamp MTB 檢測試劑盒，使用環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），僅需要 1～2 h 即可完成對多種分枝桿菌的鑒定。該技術簡單快速、攜帶方便、試劑成本經濟實惠、對生物安全等級和基礎設施的要求低。但 LAMP 的缺點也明顯，如高溫、高濕度、試劑體積不足和樣品間交叉污染會導致假陽性率升高[25]。LAMP 法有多個擴增位點，對 IS6110 位點的靈敏度和特異度尤其突出，因此，LAMP 法可對未經處理的痰涂片標本進行 IS6110 和 gyrB 基因的檢測[26]。2016 年，WHO 推薦將 LAMP 方法作為除了痰涂片染色鏡檢以外的可選方法，LAMP 法也將成為資源較差地區對肺結核診斷的主要方法。
3.2 FluoroType MTBDR
FluoroType MTBDR 是由德國 Hain Lifescience 公司開發的一種半自動的，對呼吸道和非呼吸道標本進行 MTB 快速診斷和對 RIF、INH 耐藥突變檢測的方法。該方法將不對稱 PCR 擴增與使用光學調控開關技術的特定探針組合在一起[27]，通過一臺 FluoroCycler96 儀器就可以完成對 96 個樣本的擴增和檢測，檢測周期只需要 3～4 h。由于全過程在密閉的空間中進行，該方法減少了實驗員的操作誤差。研究者發現，與表型藥敏試驗相比，FluoroType MTBDR 對 RIF 和 INH 的靈敏度分別為 91.7% 和 98.9%，特異度均為 100%[28]。
3.3 RealTime MTB RIF/INH耐藥性測定
RealTime MTB RIF/INH 耐藥性測定是美國 Abbott 公司開發的用于檢測呼吸道樣本 RIF 和 INH 耐藥位點的方法。RealTime MTB RIF/INH 與 RealTime MTB 是相互獨立的，但都依賴高通量 m2000 全自動系統。RealTime MTB 單次最多檢測 96 個樣本，待檢測出 MTB 陽性樣本后，RealTime MTB RIF/INH 可繼續檢測耐藥位點，單次最多檢測 24 個樣本。其在痰涂片陽性和陰性的呼吸道樣品中均顯示出對 RIF 耐藥突變檢測較高的靈敏度（87.5%～96.3%）和特異度（100%），這與 Xpert 的表現一致，但對 INH 耐藥相關突變檢測的靈敏度和特異度稍低，分別為 78.8%～87.5% 和 94.4%～100%[29-30]。RealTime MTB RIF/INH 耐藥性測定在 HIV 共感染患者中也表現優異，靈敏度達到 70%，特異度為 90% 以上[31]。
3.4 COBAS TaqMan MTB 和RIF/INH耐藥性測定
COBAS TaqMan MTB 是由瑞士 Roche 公司開發的第一個基于 TaqMan 的結核診斷檢測方法。COBAS TaqMan MTB 的診斷準確性非常適用于呼吸道樣本，總體靈敏度和特異度分別為 80.8% 和 99.4%[32]。未來 COBAS TaqMan MTB 和 COBAS TaqMan MTB-RIF/INH 兩種方法都將匹配上 COBAS 6800 系統和 COBAS 8800 系統，使用通用的樣本準備流程，一次性完成 384 或者 960 個樣本的高通量檢測[32]。
3.5 全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）
WGS 技術被認為是 MTB DNA 和耐藥檢測的終極分子診斷法。目前 WGS 技術日益成熟，多種自動化生物信息學平臺可以實現臨床上對結核耐藥的常規快速精準診斷模式，從樣本采集到接受治療僅需要 1～3 d 的時間[33-35]。WGS 技術對 RIF 和 INH 耐藥相關突變表現出好的靈敏度和特異度，然而，對其余的一線和二線藥物，WGS 準確度存在顯著差異[36-37]。WGS 技術在結核病分子診斷領域的發展還面臨著挑戰：① 對痰液樣本進行 WGS 分析缺乏標準化步驟，包括去除非分枝桿菌 DNA 和富集 MTB DNA 的具體步驟；② 缺少共識指南以驗證 WGS 用于結核病實驗室診斷的價值；③ 將 WGS 納入結核病診斷和耐藥結核治療對高負擔國家的臨床和經濟影響。
4 分子診斷在MTB檢測應用中的不足
MTB 的分子診斷檢測在發展階段采用了一系列新方法，這些技術能夠提供準確的結果，并具有快速、可擴展、可重復、靈敏度高、高通量等優點。但是這些技術仍然存在局限性：① 技術難題，例如擴增抑制、交叉污染、便攜性差；② 需要昂貴的試劑和較大的勞動力成本；③ 不能對多個藥物耐藥的相關位點進行檢測；④ 相對較長的周期，特別是 DNA 提取；⑤ 對技術人員技能的要求高；⑥ 對專業設施的要求高。
5 分子診斷在結核病診斷中的發展展望
雖然分子診斷在 MTB 檢測中取得了重大進展，但仍面臨著巨大挑戰：① 菌株的突變模式依地理位置不同而變化。宿主與細菌群體遺傳和耐藥相關突變的變異性也成為單獨應用分子技術檢測耐藥性的主要缺點，因此未來結核病的診斷和耐藥檢測仍然需要結合實驗室方法，特別是針對可疑的耐藥病例；② 結核病的分子診斷技術基于特定基因突變與某些藥物的抗性表型之間的關聯，并快速診斷是否存在耐藥性。然而，結核病的臨床耐藥性是耐藥性細菌群體與藥物敏感性細菌群體的平衡。未來的分子診斷需要結合實驗室證據，以評估和量化群體中耐藥細菌的數量，因為單一突變檢測雖然能預測耐藥的概率，但不能預測臨床耐藥性的暴發。除此之外還應結合患者自身情況和治療相關因素，例如合并癥、副作用、營養狀態，以此實現對耐藥性結核治療的監管。
由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的結核病是全世界十大死因之一，也是最大的單一感染性病原體引發致死的疾病。2018 年，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）統計報告顯示，全球新發結核病患者 1 000 萬例，多集中在非洲國家、印度、印度尼西亞和中國等中等發達國家和欠發達國家[1]。在這些高負擔國家，每 10 萬人口中新增結核病病例為 150～400 人[1]。更嚴峻的是，在結核病患者中，還有 55.8 萬人對利福平（rifampin，RIF）耐藥，其中 82% 為多重耐藥結核病例[1]。活動性結核的早期診斷，特別是對多耐藥和泛耐藥 MTB 的檢測是實施有效治療及公共衛生干預措施的必要前提。目前，實驗室診斷主要依賴涂片染色鏡檢法和 MTB 培養等傳統實驗室檢驗方法。涂片染色鏡檢法存在陽性率低、操作復雜、技術要求高等缺點，MTB 培養亦存在污染率高、檢測時間長等不足，致使全球近一半的結核病例不能通過實驗室確認，診斷延遲。隨著分子生物學的不斷發展，快速分子診斷技術在結核病早期診斷方面的應用不斷增加，許多國家正在逐步降低對傳統痰涂片染色顯微鏡檢驗的依賴。本文將圍繞 MTB 分子診斷方法的應用現狀和前景進行評述。
1 MTB的實驗室檢查現狀
MTB 的常規實驗室檢查方法為涂片染色鏡檢、分枝桿菌培養和核酸擴增試驗。分枝桿菌涂片染色鏡檢有 2 種，即 Ziehl-Neelsen 抗酸染色法和熒光染色法。抗酸染色法簡單經濟、特異性高，但其檢測限為每毫升未滅活痰涂片 5 000～10 000 個桿菌[2]，其靈敏度為 20%～80%[3-4]，尤其是對于兒童肺結核、肺外結核、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共感染等少菌性結核病例的靈敏度低[5]。熒光染色法使 MTB 在顯微鏡下呈現亮黃色而易于分辨，操作簡單且具有檢出迅速、陽性率高的優點，在少菌性結核標本中更能夠體現出優越性；但該法必須在暗室或遠離窗口的位置操作，且維修成本較高昂，限制了其在實驗室診斷中的廣泛使用。MTB 培養是結核病實驗室診斷的金標準。但是 MTB 對營養的要求高，需要使用特定的培養基。基于液體培養的快速培養系統有 BACTEC 460 系統、BACTEC MGIT 960 系統、MB Redox 系統等，分離率高于固體培養 L?wenstein-Jensen 法，報告時間大大縮短，對肺外標本如腦脊液等有明顯優勢。但 MTB 培養法仍有一些缺點阻礙了其作為結核病實驗室診斷的常規檢測，例如存在假陽性，需要專門的基礎設施、設備和人員，需要維持適當的生物安全等級，需要不間斷供電，等等。核酸擴增的引入促進了 MTB 診斷的巨大進步。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增特異性區域堿基序列被認為是鑒定分枝桿菌的金標準，16S 核糖體 RNA（ribosomal RNA，rRNA）是最常見的靶標。第一批商品化 PCR 方法的 MTB 鑒定試劑盒包括 COBAS Amplicor MTB 試劑盒、LCx MTB 試劑盒、BD ProbeTec 能量轉移系統等。然而，這些方法不能同時兼具使用方便性和經濟實惠性，因此無法完全滿足結核病實驗室診斷的臨床需求。
2 MTB分子診斷技術現狀
2.1 分子線性探針技術（molecular line probe assay，LPA）
LPA 是近年來興起的一種 PCR 技術，用生物素化的引物進行 PCR 擴增，與固定在膜上的特異性 DNA 探針雜交后進行酶聯免疫比色檢測，可用于 MTB 培養物、痰涂片標本及藥物耐藥突變檢測。
2.1.1 INNO-LiPA
INNO-LiPA 法是最早應用于臨床的 LPA，于 1995 年由比利時 Innogenetics 公司提出，可用于 MTB DNA 和 RIF 耐藥檢測。該技術基于對 16S 和 23S rRNA 片段的擴增，可以識別 MTB 和 16 種非結核分枝桿菌，從采集樣本到出結果需要 24～48 h。2008 年，WHO 批準將 INNO-LiPA 作為痰涂片陽性的多耐藥結核病患者的快速篩選。INNO-LiPA 檢測 RIF 耐藥可預測 85%～90% 的多耐藥結核[6]，靈敏度和特異度分別為 95% 和 100%[7]。盡管表現如此優異，手動操作、出報告周期長也限制了其在臨床的應用。
2.1.2 GenoType
GenoType 是由德國 Hain Lifescience 公司研制的檢測 MTB DNA 和一線、二線藥物耐藥突變的方法。2004 年推出的 GenoType MTBDR 產品（簡稱 MTBDR），存在 2 個主要不足：一是與表型藥敏試驗相比，雖然 MTBDR 對 RIF 耐藥檢測靈敏度較高，但對異煙肼（isoniazid，INH）耐藥的靈敏度偏低，靈敏度分別為 99% 和 88.4%[8]。二是 MTBDR 與 INNO-LiPA 是基于同樣的原理，同樣存在出報告周期長（24～48 h）的問題。GenoType 系列第二類產品 GenoType MTBDRplus 于 2007 年推出。MTBDRplus 除可以檢測 MTB DNA 及 RIF 耐藥外，還可檢測低水平 INH 耐藥，增加了耐多藥結核病的檢出率[9]。有研究統計，MTBDRplus 2.0 對 RIF 耐藥檢測的靈敏度和特異度分別為 98.1% 和 98.7%，而對 INH 耐藥的靈敏度會根據標本類型發生變化，波動范圍在 57%～100%[7]。MTBDRplus2.0 在 1.0 基礎上作了更新，擴增試劑例如 Taq 聚合酶和引物已經事先混合好，不再需要單獨配制，且可直接檢測痰涂片陰性標本。但兩者在出報告周期上是一樣的。GenoType 系列第三類產品 MTBDRsl 的原理與前兩類相同，但主要是針對二線藥物耐藥基因的檢測。與 MTBDRsl 1.0 相比，MTBDRsl 2.0 的靈敏度和特異度都有上升，對喹諾酮類藥物、氨基糖苷類藥物和卡那霉素藥物的靈敏度分別為 93%～100%、83.0%～91.3% 和 89.2%～96.0%，特異度分別為 98.4%、91.7%～100.0% 和 92.2%～98.5%[10-12]。WHO 于 2016 年批準 MTBDRsl 可用于檢測 MTB 培養物和痰標本，且不區分是來自痰涂片陰性或者陽性、來自肺或肺外組織的患者。然而，由于對痰涂片陰性病例的檢測不確定率高、對氟喹諾酮類和二線氨基糖苷類藥物檢測的準確性不同等原因，MTBDRsl 整體準確性降低。
2.2 Xpert MTB/RIF技術
2009 年一種由美國 Cepheid 公司開發的新型分子生物檢測方法 GeneXpert-MTB/RIF（簡稱 Xpert）開始應用于結核病診斷和藥物耐藥性檢測[13]。Xpert 檢測方法依靠全自動 GeneXpert 平臺，以巢式實時定量熒光 PCR 為基礎，以 rpoB 基因為靶基因，自動提取 DNA 并擴增，實現對 MTB DNA 及 RIF 耐藥性的檢測。Xpert 系統無需生物安全實驗室，結果由系統自動生成，不需要工作人員的處理，報告周期僅為 2 h[14-16]。Xpert 可以直接應用于未滅活或滅活了的呼吸道樣品、腦脊液、淋巴結組織、胸膜液、尿液等[17]。2013 年，Xpert 獲得美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于結核病的診斷和 RIF 耐藥檢測，對肺外結核和兒童結核也適用。Cocharane 提供 Xpert 診斷結核的靈敏度和特異度分別為 89% 和 99%，且對 HIV 共感染患者的靈敏度為 79%，低于非共感染患者的 86%[18]。Xpert 診斷肺外結核的靈敏度和特異度分別為 43.7%～84.9% 和 92.5%～99.9%[19]。盡管 Xpert 表現優異，復雜的臨床情況也對 Xpert 提出更高要求：在混合樣本中提高對 RIF 耐藥的檢測能力；降低對少菌型樣本的假陽性。
Xpert MTB/RIF Ultra（簡稱 Xpert Ultra）的出現是在 Xpert 的基礎上作的進一步改進，兩者采用相同的操作和試劑，可以在同一部儀器中運行，而 Xpert Ultra 只需要額外更新一個軟件。Xpert Ultra 與 Xpert 相比，假陰性率降低。以培養法為金標準，Xpert Ultra 的靈敏度（87.7%）高于 Xpert（82.9%），特異度（94.8%）低于 Xpert（98%）[20]。Xpert Ultra 還提高了對少菌型樣本的靈敏度，研究顯示，Xpert Ultra 對少菌型結核的靈敏度（87.8%）較 Xpert 升高（82.9%），但特異度降低（94.8% vs. 98%）[20-21]。不僅如此，Xpert Ultra 還對混合樣本中 RIF 耐藥的檢出率進行了提升，引物對突變的覆蓋度也作了修改[22]。對 RIF 耐藥突變的檢測，Xpert Ultra 和 Xpert 的準確度相似[22-23]。2017 年 WHO 推薦 Xpert Ultra 可取代 Xpert 用于結核病診斷和 RIF 耐藥檢測。值得注意的是，Xpert Ultra 在兒童結核中并不能取代 MTB 培養作為主要診斷方法[24]。
3 新興結核分子診斷技術
3.1 恒溫擴增檢測技術
由日本 Eiken Chemical 公司開發的 Loopamp MTB 檢測試劑盒，使用環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），僅需要 1～2 h 即可完成對多種分枝桿菌的鑒定。該技術簡單快速、攜帶方便、試劑成本經濟實惠、對生物安全等級和基礎設施的要求低。但 LAMP 的缺點也明顯，如高溫、高濕度、試劑體積不足和樣品間交叉污染會導致假陽性率升高[25]。LAMP 法有多個擴增位點，對 IS6110 位點的靈敏度和特異度尤其突出，因此，LAMP 法可對未經處理的痰涂片標本進行 IS6110 和 gyrB 基因的檢測[26]。2016 年，WHO 推薦將 LAMP 方法作為除了痰涂片染色鏡檢以外的可選方法，LAMP 法也將成為資源較差地區對肺結核診斷的主要方法。
3.2 FluoroType MTBDR
FluoroType MTBDR 是由德國 Hain Lifescience 公司開發的一種半自動的，對呼吸道和非呼吸道標本進行 MTB 快速診斷和對 RIF、INH 耐藥突變檢測的方法。該方法將不對稱 PCR 擴增與使用光學調控開關技術的特定探針組合在一起[27]，通過一臺 FluoroCycler96 儀器就可以完成對 96 個樣本的擴增和檢測，檢測周期只需要 3～4 h。由于全過程在密閉的空間中進行，該方法減少了實驗員的操作誤差。研究者發現，與表型藥敏試驗相比，FluoroType MTBDR 對 RIF 和 INH 的靈敏度分別為 91.7% 和 98.9%，特異度均為 100%[28]。
3.3 RealTime MTB RIF/INH耐藥性測定
RealTime MTB RIF/INH 耐藥性測定是美國 Abbott 公司開發的用于檢測呼吸道樣本 RIF 和 INH 耐藥位點的方法。RealTime MTB RIF/INH 與 RealTime MTB 是相互獨立的，但都依賴高通量 m2000 全自動系統。RealTime MTB 單次最多檢測 96 個樣本，待檢測出 MTB 陽性樣本后，RealTime MTB RIF/INH 可繼續檢測耐藥位點，單次最多檢測 24 個樣本。其在痰涂片陽性和陰性的呼吸道樣品中均顯示出對 RIF 耐藥突變檢測較高的靈敏度（87.5%～96.3%）和特異度（100%），這與 Xpert 的表現一致，但對 INH 耐藥相關突變檢測的靈敏度和特異度稍低，分別為 78.8%～87.5% 和 94.4%～100%[29-30]。RealTime MTB RIF/INH 耐藥性測定在 HIV 共感染患者中也表現優異，靈敏度達到 70%，特異度為 90% 以上[31]。
3.4 COBAS TaqMan MTB 和RIF/INH耐藥性測定
COBAS TaqMan MTB 是由瑞士 Roche 公司開發的第一個基于 TaqMan 的結核診斷檢測方法。COBAS TaqMan MTB 的診斷準確性非常適用于呼吸道樣本，總體靈敏度和特異度分別為 80.8% 和 99.4%[32]。未來 COBAS TaqMan MTB 和 COBAS TaqMan MTB-RIF/INH 兩種方法都將匹配上 COBAS 6800 系統和 COBAS 8800 系統，使用通用的樣本準備流程，一次性完成 384 或者 960 個樣本的高通量檢測[32]。
3.5 全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）
WGS 技術被認為是 MTB DNA 和耐藥檢測的終極分子診斷法。目前 WGS 技術日益成熟，多種自動化生物信息學平臺可以實現臨床上對結核耐藥的常規快速精準診斷模式，從樣本采集到接受治療僅需要 1～3 d 的時間[33-35]。WGS 技術對 RIF 和 INH 耐藥相關突變表現出好的靈敏度和特異度，然而，對其余的一線和二線藥物，WGS 準確度存在顯著差異[36-37]。WGS 技術在結核病分子診斷領域的發展還面臨著挑戰：① 對痰液樣本進行 WGS 分析缺乏標準化步驟，包括去除非分枝桿菌 DNA 和富集 MTB DNA 的具體步驟；② 缺少共識指南以驗證 WGS 用于結核病實驗室診斷的價值；③ 將 WGS 納入結核病診斷和耐藥結核治療對高負擔國家的臨床和經濟影響。
4 分子診斷在MTB檢測應用中的不足
MTB 的分子診斷檢測在發展階段采用了一系列新方法，這些技術能夠提供準確的結果，并具有快速、可擴展、可重復、靈敏度高、高通量等優點。但是這些技術仍然存在局限性：① 技術難題，例如擴增抑制、交叉污染、便攜性差；② 需要昂貴的試劑和較大的勞動力成本；③ 不能對多個藥物耐藥的相關位點進行檢測；④ 相對較長的周期，特別是 DNA 提取；⑤ 對技術人員技能的要求高；⑥ 對專業設施的要求高。
5 分子診斷在結核病診斷中的發展展望
雖然分子診斷在 MTB 檢測中取得了重大進展，但仍面臨著巨大挑戰：① 菌株的突變模式依地理位置不同而變化。宿主與細菌群體遺傳和耐藥相關突變的變異性也成為單獨應用分子技術檢測耐藥性的主要缺點，因此未來結核病的診斷和耐藥檢測仍然需要結合實驗室方法，特別是針對可疑的耐藥病例；② 結核病的分子診斷技術基于特定基因突變與某些藥物的抗性表型之間的關聯，并快速診斷是否存在耐藥性。然而，結核病的臨床耐藥性是耐藥性細菌群體與藥物敏感性細菌群體的平衡。未來的分子診斷需要結合實驗室證據，以評估和量化群體中耐藥細菌的數量，因為單一突變檢測雖然能預測耐藥的概率，但不能預測臨床耐藥性的暴發。除此之外還應結合患者自身情況和治療相關因素，例如合并癥、副作用、營養狀態，以此實現對耐藥性結核治療的監管。