環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是一類新型的非編碼 RNA，以共價鍵形成閉合環形結構，較線性 RNA 更穩定。CircRNA 作為在真核生物中的高豐度 RNA，參與調控靶基因表達，與多種疾病有著密切聯系，有作為臨床診斷及預后標志物的潛在應用價值。該文概述了 circRNA 分子的分類、生物學功能（包括作為微 RNA 分子海綿、調控基因轉錄、調節 RNA 結合蛋白以及其潛在的翻譯功能），并就近年來 circRNA 在類風濕關節炎中的最新研究進展作一綜述。
引用本文： 陳一丹, 林桑, 劉歡, 尹耕. 環狀 RNA 在類風濕關節炎中的研究進展. 華西醫學, 2019, 34(6): 693-697. doi: 10.7507/1002-0179.201904058 復制
環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是由前體 RNA 可變剪接產生的一類不具有游離的 5’ 端帽子和 3’ 端 poly（A）尾巴、以共價鍵形成環形結構的非編碼 RNA 分子，且不易被核酸外切酶 RNaseR 降解[1]。1976 年人們在仙臺病毒（Sendai virus）中首次發現 circRNA[2]。早期研究認為 circRNA 是一類剪接副產物或因錯誤剪接而形成的低豐度 RNA 分子[3]，未引起關注。隨著測序技術及生物信息學的發展和廣泛應用，大量的 circRNA 被發現，如 Jeck 等[4]在人類成纖維細胞中檢測出超過 25 000 種 circRNA；Salzman 等[5]發現了大量與人類基因表達密切相關的 circRNA。研究表明 circRNA 具有存在廣泛、高度穩定、時序及疾病特異性等生物學特征，對于基因表達也起到調控作用[5-7]。
類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，其發病受多因素影響，最終可能出現不同程度關節軟骨和骨質破壞[8-9]。現今越來越多的報道揭示了 circRNA 與多種人類疾病有關，如血管動脈粥樣硬化性疾病、癌癥和自身免疫性疾病等[10-14]，預示著 circRNA 可能成為新一代的生物標志物或治療靶點。而到目前為止，還很少有研究探討 circRNA 與 RA 之間的關系，因此本文就 circRNA 在 RA 中的最新研究進展作一綜述。
1 CircRNA 的分類
目前，根據形成方式的不同，內源性 circRNA 主要分為 3 種：外顯子 circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）、內含子 circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）以及外顯子-內含子 circRNA（exonic-intronic circRNA，EI ciRNA）[15]。這些 circRNA 分子間存在競爭性平衡關系，可影響 mRNA 的表達。
1.1 ecircRNA
ecircRNA 為由外顯子序列構成的 circRNA，主要存在于細胞質中[4]，也是目前研究得最多的 circRNA。CircRNA 的外顯子環化包括套索驅動環化和內含子配對驅動環化兩種模式。前者是由前體 mRNA 在剪接過程中發生部分折疊而拉近非相鄰的外顯子，發生外顯子跳躍的經典剪接。被跳過外顯子的上、下游結合形成套索前體，隨后內部剪接去除內含子，形成 ecircRNA[16]。后者是兩側內含子的反向互補序列堿基配對，誘導二者間下游剪接供體與上游剪接受體結合，而環化的外顯子被釋放成為了 circRNA 分子[17]。
1.2 ciRNA
內含子序列占人類基因組的 20% 以上，但人們普遍認為大多數內含子或內含子片段是不穩定的[18]。Zhang 等[19]提出了內含子來源的非編碼 circRNA。該研究也提示了非編碼內含子轉錄子在其親本編碼基因上的順式調控作用。機體內置于細胞核中的 ciRNA 是由內含子獨立環化形成，并主要源于內含子的自我剪接。ciRNA 的形成有賴于含有 3’ 剪接位點附近的 11 nt C 富集區域和鄰近 5’ 端的 7 nt GU 富集元件，具有少量的微 RNA（microRNA，miRNA）靶點[20]。上述特殊結構使內含子在剪接過程中避免被脫支酶消化而形成 ciRNA[6]。
1.3 EI ciRNA
EI ciRNA 主要定位于細胞核。在 circRNA 結構中環化的外顯子中間保留了內含子序列，我們稱之為外顯子-內含子環狀結構或 EI ciRNA[21]，但具體發生機制尚不明確。Li 等[18]研究發現 EI ciRNA 可通過 U1 核小 RNA 和 EI ciRNA 之間的特定的 RNA-RNA 相互作用進行轉錄控制的調控策略，增強親本基因的表達。上述研究揭示了基因表達在轉錄及轉錄后水平的多樣性和復雜性。
2 CircRNA 的生物學功能
2.1 MiRNA 分子海綿
CircRNA 富含與 miRNA 的結合位點，可抑制 mRNA 與靶基因相結合，從而發揮 miRNA“海綿”效應，這是目前 circRNA 被報道最多的功能。Hansen 等[22]研究發現，小腦變性相關蛋白 1 反義轉錄物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as）是小腦變性相關蛋白 1（cerebellar degeneration related protein 1，CDR1）基因的環狀天然反義轉錄物，也被稱為 miRNA-7（miR-7）的 circRNA 海綿（ciRS-7），對 miR-7 起到負調控作用[23]，上調其靶基因的表達水平，提示 circRNA 可通過參與到競爭的內源 RNA 網絡，從而在轉錄水平上對靶基因進行調控來發揮生物學作用[24]。在胚胎中超高表達 CDR1as 或沉默 miR-7 可導致斑馬魚中腦縮小[25]，暗示了 CDR1as 可作為 miR-7 分子海綿的作用。Bai 等[26]研究發現 circDLGAP4 可作為內源性 miRNA-143（miR-143）海綿來抑制其活性，解除 miR-143 對 HECTD1 基因表達的抑制作用，可見，circRNA 可提高靶基因的表達水平[27]，當 miRNA 被 circRNA 吸附時，mRNA 翻譯合成蛋白質[28]。雖然當前，circRNA 起 miRNA 的海綿作用還在腫瘤[29]、卵泡發育[30]及骨肉瘤的生長[31]等研究中也有體現，但 circRNA 是否普遍具有 miRNA 海綿作用還有待進一步驗證。
2.2 CircRNA 調控基因轉錄
與傳統線性 RNA 不同，circRNA 在真核轉錄組中大量存在。一些內含子來源的 circRNA 存在于細胞核中，可與 RNA 聚合酶Ⅱ轉錄復合體結合，以順式作用方式對親本基因的轉錄進行調控[11]，進而影響靶基因表達。如 ci-ankrd52 是來源于錨蛋白重復結構域 52（ankyrin repeat domain 52，ANKRD52）基因第 2 個內含子的 circRNA，研究表明，它可參與 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸機制，起正向調控基因的轉錄活性作用，而敲除 ci-ankrd52 后，ankrd52 mRNA 表達顯著減少，circ-sirt7 也具有與 ci-ankrd52 相同的特征[19]，表明細胞核內的 circRNA 可能參與基因的轉錄調控。此外，還有一些定位在細胞核中的外顯子與內含子共同來源的 EI ciRNA（如 circ-EIF3J 和 circ-PAIP2），可與小核糖體 U1 snRNP 或 RNA 聚合酶Ⅱ相互作用促進親本基因的轉錄[18]，也暗示了 circRNA 的種類及功能具有多樣性。
2.3 CircRNA 調節 RNA 結合蛋白
此前已有研究報道線性 RNA 可吸附蛋白因子[32]，現研究發現 circRNA 也能與有關蛋白［主要是 RNA 結合蛋白（RNA-binding protein，RBP）］結合形成復合體，進而發揮生物學功能[17]。例如，circRNA（如 CDR1as 和 Sry）可以與 Argonaute（AGO）蛋白結合，調控 AGO mRNA 的翻譯過程[33]。Ashwal-Fluss 等[16]發現作為 RBP 的剪接因子肌盲蛋白（muscle blind-like，MBL）可結合其親本基因的外顯子并促進其環化形成 circMBL，二者相互作用可降低 MBL 有效濃度，減少 circMBL 生成。
2.4 CircRNA 具有潛在翻譯功能
一般情況下，很少有 circRNA 被翻譯成蛋白質。但 Chen 等[34]報道了 circRNA 可啟動并編碼蛋白。之后 Perriman 等[35]研究出包含一個簡單綠色熒光蛋白開放閱讀框的 circRNA，它可以在大腸桿菌中指導綠色熒光蛋白的表達。Abe 等[36]驗證了在無細胞大腸桿菌翻譯系統和人類細胞中，circRNA 可通過滾動循環擴增途徑有效地被翻譯，并產生豐富的蛋白質產物，也表明這些在人類細胞中大量存在的 ecircRNA 所具有較大的翻譯潛能。依賴 N6-甲基腺甲基化修飾[37]和依賴內部核糖體嵌入位點[38]是目前報道最多的 circRNA 兩種可能的翻譯機制。但 circRNA 在翻譯控制中的作用仍然值得進一步研究，且目前為止尚無真核生物細胞自然產生此類具有翻譯功能 circRNA 的證據。
3 CircRNA 與 RA
近些年測序結果表明 circRNA 在 RA 患者及健康人外周血單核細胞中存在表達異常，表 1 總結了與 RA 有關的 circRNA[39-45]。
表1
與 RA 有關的 circRNA
3.1 高表達 circRNA
Ouyang 等[40]通過微陣列芯片技術篩選出差異表達的 circRNA 后使用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗證了 30 例 RA 患者及 25 例健康人的外周血單核細胞，發現與健康對照組相比，RA 患者中的 circRNA_092516、circRNA_003524、circRNA_103047、circRNA_104871 及 circRNA_101873 表達顯著上調，其中受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析提示 circRNA_104871 對于 RA 有較高的診斷價值［ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）=0.833，95% 置信區間（0.721，0.944），P<0.001］。進一步研究發現這些 RA 患者外周血單核細胞中具有顯著差異性表達的 circRNA 與 28 處關節疾病活動度評分（Disease Activity Score 28，DAS28）、C 反應蛋白、紅細胞沉降率、健康評估問卷（Health Assessment Questionnaire，HAQ）均無相關性，表明這些 circRNA 可能不是疾病活動度或者全身炎癥反應的相關生物標志物。Zheng 等[41]通過微陣列芯片檢測 10 例 RA 患者及 10 例健康對照者外周血單核細胞中的 cricRNA 表達情況，發現有 255 個 circRNA 表達顯著上調，329 種 cricRNA 顯著下調，并采用 qRT-PCR 驗證了 hsa_circ_0092285、hsa_circ_ 0058794 表達顯著上調。而 hsa_circ_0092285 可能通過與 PNKP 基因作用參與到 RA 的氧化應激與炎癥反應中。hsa_circ_0058794 由 AGAP1 基因拼接而來，進一步研究發現它能促進滑膜細胞侵襲軟骨組織[46]，有可能成為 RA 患者預后評估的生物標志物。Tang 等[42]報道 ciRS-7 在 RA 患者外周血中顯著高表達，并發現 RA 患者 ciRS-7 的相對表達量與血漿抗環瓜氨酸多肽抗體水平呈正相關（r=0.564 0，P=0.014 8）；該研究進一步揭示哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）mRNA 在 RA 患者外周血中的表達顯著高于健康對照組，并與 ciRS-7 表達呈正相關，與 miR-7 表達呈負相關，推測在 RA 患者中 ciRS-7 可能作為 miR-7 的“海綿”并“吸收”一定量的 miR-7 進而上調 mTOR 的表達。這些結果表明 ciRS-7 可能是 RA 潛在的生物標志物（AUC=0.766），為 RA 的診斷和靶向治療提供了新的思路。
3.2 低表達 circRNA
有研究發現源自于類固醇脫氫酶樣蛋白 2（hydroxysteroid dehydrogenase like 2，HSDL2）基因的 hsa_circ_0088088 表達水平在 RA 患者外周血中明顯下調[41]，并可能增加 RA 患者心血管事件的風險[47]。就機制而言，HSDL2 參與了脂肪酸和膽固醇的代謝和穩態的定位[48]，其下調可能影響脂質分解并增加游離脂肪酸水平[49]，從而增加 RA 患者動脈粥樣硬化的風險[50]。與健康人相比，在 RA 患者外周血中顯著下調的 hsa_circ_0038644 于 PRKCB 中編碼[41]，而 PRKCB 是脂多糖免疫應答相關的候選基因，涉及 B 細胞活性和抗原應答。機制上，PRKCB 參與 B 細胞受體介導的核因子 κB 信號通路的激活[51]。楊旋等[43]利用高通量測序檢測了 4 例 RA 患者及 3 例健康對照組的外周血單個核細胞，發現顯著性差異改變［log2（FC）≥1.0 或 log2（FC）≤?1.0，且錯誤發現率≤0.05］的 circRNA 中有 41 種 circRNA 表達上調，30 種表達下調，利用 qRT-PCR 發現 hsa_circ_0000396 和 hsa_circ_0130438 在 RA 患者外周血中表達量顯著下調（P<0.05），并通過 KEGG pathway 等生物信息學分析發現其可能與炎癥相關的通路如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、核因子 κB 信號通路等有關，且進一步發現 hsa_circ_0000396 可能是 RA 的潛在生物標志物（AUC=0.809）。宋新強等[44]發現 hsa_circ_0005397 表達水平在 RA 患者外周血中明顯低于健康對照組（P<0.016），并可能通過影響或競爭性結合 hsa_miR_125a_3p 來調節靶基因，進而參與炎癥過程。
3.3 其他 circRNA
Li 等[39]研究發現，hsa_circ_0001859 可以通過直接抑制 miR-204/211 活性而上調激活轉錄因子 2（activating transcription factor 2，ATF2），促進 RA 的炎癥過程。就機制而言，hsa_circ_0001859 通過隱藏 miR-204/211 與其靶基因 ATF2 的 3’-非翻譯區（untranslated regions，UTR）結合位點，與 ATF2 競爭性結合 miR-204/211，進而上調 ATF2 的表達。該研究在 RA 滑膜細胞中進一步證實，沉默 hsa_circ_ 0001859 能使 ATF2 甚至白細胞介素（interleukin，IL）-6、TNF 和 IL-1β 表達明顯下調，抑制炎癥反應，ATF2 是環磷腺苷應答元件結合蛋白家族的一員，其與絲裂原活化蛋白激酶、Toll 樣受體等炎癥信號通路密切相關，而 IL-6、TNF 和 IL-1β 是信號通路的下游分子，與炎癥活性有關。這表明 hsa_circ_0001859 在滑膜組織中可能參與了慢性炎癥的過程。
CircRNA 在人外周血中存在差異表達具有區分 RA 患者與健康人的潛能[43]，可見 circRNA 可能成為診斷 RA 的新型生物標志物，并為 RA 的診斷和治療提供新的依據。
4 總結與展望
目前已有大量的 circRNA 被發現，circRNA 的功能及機制多樣化，與人類疾病發生密切相關，具有作為癌癥等疾病監測的新型靶標分子的潛能[52]，已初步展現了其潛在的應用價值。但與 RNA 家族其他成員比，circRNA 的研究仍不夠深入，circRNA 具體的生成機制還不清楚，有待進一步探索。而隨著高通量測序和生物信息學的發展，人們對 circRNA 的研究將更加透徹、深入，很可能為 RA 及其他自身免疫病的發病機制、疾病發展等相關研究提供重要線索，豐富 RA 的研究內容，幫助我們建立基于 circRNA 的 RA 臨床治療和診斷策略。
環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是由前體 RNA 可變剪接產生的一類不具有游離的 5’ 端帽子和 3’ 端 poly（A）尾巴、以共價鍵形成環形結構的非編碼 RNA 分子，且不易被核酸外切酶 RNaseR 降解[1]。1976 年人們在仙臺病毒（Sendai virus）中首次發現 circRNA[2]。早期研究認為 circRNA 是一類剪接副產物或因錯誤剪接而形成的低豐度 RNA 分子[3]，未引起關注。隨著測序技術及生物信息學的發展和廣泛應用，大量的 circRNA 被發現，如 Jeck 等[4]在人類成纖維細胞中檢測出超過 25 000 種 circRNA；Salzman 等[5]發現了大量與人類基因表達密切相關的 circRNA。研究表明 circRNA 具有存在廣泛、高度穩定、時序及疾病特異性等生物學特征，對于基因表達也起到調控作用[5-7]。
類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，其發病受多因素影響，最終可能出現不同程度關節軟骨和骨質破壞[8-9]。現今越來越多的報道揭示了 circRNA 與多種人類疾病有關，如血管動脈粥樣硬化性疾病、癌癥和自身免疫性疾病等[10-14]，預示著 circRNA 可能成為新一代的生物標志物或治療靶點。而到目前為止，還很少有研究探討 circRNA 與 RA 之間的關系，因此本文就 circRNA 在 RA 中的最新研究進展作一綜述。
1 CircRNA 的分類
目前，根據形成方式的不同，內源性 circRNA 主要分為 3 種：外顯子 circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）、內含子 circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）以及外顯子-內含子 circRNA（exonic-intronic circRNA，EI ciRNA）[15]。這些 circRNA 分子間存在競爭性平衡關系，可影響 mRNA 的表達。
1.1 ecircRNA
ecircRNA 為由外顯子序列構成的 circRNA，主要存在于細胞質中[4]，也是目前研究得最多的 circRNA。CircRNA 的外顯子環化包括套索驅動環化和內含子配對驅動環化兩種模式。前者是由前體 mRNA 在剪接過程中發生部分折疊而拉近非相鄰的外顯子，發生外顯子跳躍的經典剪接。被跳過外顯子的上、下游結合形成套索前體，隨后內部剪接去除內含子，形成 ecircRNA[16]。后者是兩側內含子的反向互補序列堿基配對，誘導二者間下游剪接供體與上游剪接受體結合，而環化的外顯子被釋放成為了 circRNA 分子[17]。
1.2 ciRNA
內含子序列占人類基因組的 20% 以上，但人們普遍認為大多數內含子或內含子片段是不穩定的[18]。Zhang 等[19]提出了內含子來源的非編碼 circRNA。該研究也提示了非編碼內含子轉錄子在其親本編碼基因上的順式調控作用。機體內置于細胞核中的 ciRNA 是由內含子獨立環化形成，并主要源于內含子的自我剪接。ciRNA 的形成有賴于含有 3’ 剪接位點附近的 11 nt C 富集區域和鄰近 5’ 端的 7 nt GU 富集元件，具有少量的微 RNA（microRNA，miRNA）靶點[20]。上述特殊結構使內含子在剪接過程中避免被脫支酶消化而形成 ciRNA[6]。
1.3 EI ciRNA
EI ciRNA 主要定位于細胞核。在 circRNA 結構中環化的外顯子中間保留了內含子序列，我們稱之為外顯子-內含子環狀結構或 EI ciRNA[21]，但具體發生機制尚不明確。Li 等[18]研究發現 EI ciRNA 可通過 U1 核小 RNA 和 EI ciRNA 之間的特定的 RNA-RNA 相互作用進行轉錄控制的調控策略，增強親本基因的表達。上述研究揭示了基因表達在轉錄及轉錄后水平的多樣性和復雜性。
2 CircRNA 的生物學功能
2.1 MiRNA 分子海綿
CircRNA 富含與 miRNA 的結合位點，可抑制 mRNA 與靶基因相結合，從而發揮 miRNA“海綿”效應，這是目前 circRNA 被報道最多的功能。Hansen 等[22]研究發現，小腦變性相關蛋白 1 反義轉錄物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as）是小腦變性相關蛋白 1（cerebellar degeneration related protein 1，CDR1）基因的環狀天然反義轉錄物，也被稱為 miRNA-7（miR-7）的 circRNA 海綿（ciRS-7），對 miR-7 起到負調控作用[23]，上調其靶基因的表達水平，提示 circRNA 可通過參與到競爭的內源 RNA 網絡，從而在轉錄水平上對靶基因進行調控來發揮生物學作用[24]。在胚胎中超高表達 CDR1as 或沉默 miR-7 可導致斑馬魚中腦縮小[25]，暗示了 CDR1as 可作為 miR-7 分子海綿的作用。Bai 等[26]研究發現 circDLGAP4 可作為內源性 miRNA-143（miR-143）海綿來抑制其活性，解除 miR-143 對 HECTD1 基因表達的抑制作用，可見，circRNA 可提高靶基因的表達水平[27]，當 miRNA 被 circRNA 吸附時，mRNA 翻譯合成蛋白質[28]。雖然當前，circRNA 起 miRNA 的海綿作用還在腫瘤[29]、卵泡發育[30]及骨肉瘤的生長[31]等研究中也有體現，但 circRNA 是否普遍具有 miRNA 海綿作用還有待進一步驗證。
2.2 CircRNA 調控基因轉錄
與傳統線性 RNA 不同，circRNA 在真核轉錄組中大量存在。一些內含子來源的 circRNA 存在于細胞核中，可與 RNA 聚合酶Ⅱ轉錄復合體結合，以順式作用方式對親本基因的轉錄進行調控[11]，進而影響靶基因表達。如 ci-ankrd52 是來源于錨蛋白重復結構域 52（ankyrin repeat domain 52，ANKRD52）基因第 2 個內含子的 circRNA，研究表明，它可參與 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸機制，起正向調控基因的轉錄活性作用，而敲除 ci-ankrd52 后，ankrd52 mRNA 表達顯著減少，circ-sirt7 也具有與 ci-ankrd52 相同的特征[19]，表明細胞核內的 circRNA 可能參與基因的轉錄調控。此外，還有一些定位在細胞核中的外顯子與內含子共同來源的 EI ciRNA（如 circ-EIF3J 和 circ-PAIP2），可與小核糖體 U1 snRNP 或 RNA 聚合酶Ⅱ相互作用促進親本基因的轉錄[18]，也暗示了 circRNA 的種類及功能具有多樣性。
2.3 CircRNA 調節 RNA 結合蛋白
此前已有研究報道線性 RNA 可吸附蛋白因子[32]，現研究發現 circRNA 也能與有關蛋白［主要是 RNA 結合蛋白（RNA-binding protein，RBP）］結合形成復合體，進而發揮生物學功能[17]。例如，circRNA（如 CDR1as 和 Sry）可以與 Argonaute（AGO）蛋白結合，調控 AGO mRNA 的翻譯過程[33]。Ashwal-Fluss 等[16]發現作為 RBP 的剪接因子肌盲蛋白（muscle blind-like，MBL）可結合其親本基因的外顯子并促進其環化形成 circMBL，二者相互作用可降低 MBL 有效濃度，減少 circMBL 生成。
2.4 CircRNA 具有潛在翻譯功能
一般情況下，很少有 circRNA 被翻譯成蛋白質。但 Chen 等[34]報道了 circRNA 可啟動并編碼蛋白。之后 Perriman 等[35]研究出包含一個簡單綠色熒光蛋白開放閱讀框的 circRNA，它可以在大腸桿菌中指導綠色熒光蛋白的表達。Abe 等[36]驗證了在無細胞大腸桿菌翻譯系統和人類細胞中，circRNA 可通過滾動循環擴增途徑有效地被翻譯，并產生豐富的蛋白質產物，也表明這些在人類細胞中大量存在的 ecircRNA 所具有較大的翻譯潛能。依賴 N6-甲基腺甲基化修飾[37]和依賴內部核糖體嵌入位點[38]是目前報道最多的 circRNA 兩種可能的翻譯機制。但 circRNA 在翻譯控制中的作用仍然值得進一步研究，且目前為止尚無真核生物細胞自然產生此類具有翻譯功能 circRNA 的證據。
3 CircRNA 與 RA
近些年測序結果表明 circRNA 在 RA 患者及健康人外周血單核細胞中存在表達異常，表 1 總結了與 RA 有關的 circRNA[39-45]。
表1
與 RA 有關的 circRNA
3.1 高表達 circRNA
Ouyang 等[40]通過微陣列芯片技術篩選出差異表達的 circRNA 后使用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗證了 30 例 RA 患者及 25 例健康人的外周血單核細胞，發現與健康對照組相比，RA 患者中的 circRNA_092516、circRNA_003524、circRNA_103047、circRNA_104871 及 circRNA_101873 表達顯著上調，其中受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析提示 circRNA_104871 對于 RA 有較高的診斷價值［ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）=0.833，95% 置信區間（0.721，0.944），P<0.001］。進一步研究發現這些 RA 患者外周血單核細胞中具有顯著差異性表達的 circRNA 與 28 處關節疾病活動度評分（Disease Activity Score 28，DAS28）、C 反應蛋白、紅細胞沉降率、健康評估問卷（Health Assessment Questionnaire，HAQ）均無相關性，表明這些 circRNA 可能不是疾病活動度或者全身炎癥反應的相關生物標志物。Zheng 等[41]通過微陣列芯片檢測 10 例 RA 患者及 10 例健康對照者外周血單核細胞中的 cricRNA 表達情況，發現有 255 個 circRNA 表達顯著上調，329 種 cricRNA 顯著下調，并采用 qRT-PCR 驗證了 hsa_circ_0092285、hsa_circ_ 0058794 表達顯著上調。而 hsa_circ_0092285 可能通過與 PNKP 基因作用參與到 RA 的氧化應激與炎癥反應中。hsa_circ_0058794 由 AGAP1 基因拼接而來，進一步研究發現它能促進滑膜細胞侵襲軟骨組織[46]，有可能成為 RA 患者預后評估的生物標志物。Tang 等[42]報道 ciRS-7 在 RA 患者外周血中顯著高表達，并發現 RA 患者 ciRS-7 的相對表達量與血漿抗環瓜氨酸多肽抗體水平呈正相關（r=0.564 0，P=0.014 8）；該研究進一步揭示哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）mRNA 在 RA 患者外周血中的表達顯著高于健康對照組，并與 ciRS-7 表達呈正相關，與 miR-7 表達呈負相關，推測在 RA 患者中 ciRS-7 可能作為 miR-7 的“海綿”并“吸收”一定量的 miR-7 進而上調 mTOR 的表達。這些結果表明 ciRS-7 可能是 RA 潛在的生物標志物（AUC=0.766），為 RA 的診斷和靶向治療提供了新的思路。
3.2 低表達 circRNA
有研究發現源自于類固醇脫氫酶樣蛋白 2（hydroxysteroid dehydrogenase like 2，HSDL2）基因的 hsa_circ_0088088 表達水平在 RA 患者外周血中明顯下調[41]，并可能增加 RA 患者心血管事件的風險[47]。就機制而言，HSDL2 參與了脂肪酸和膽固醇的代謝和穩態的定位[48]，其下調可能影響脂質分解并增加游離脂肪酸水平[49]，從而增加 RA 患者動脈粥樣硬化的風險[50]。與健康人相比，在 RA 患者外周血中顯著下調的 hsa_circ_0038644 于 PRKCB 中編碼[41]，而 PRKCB 是脂多糖免疫應答相關的候選基因，涉及 B 細胞活性和抗原應答。機制上，PRKCB 參與 B 細胞受體介導的核因子 κB 信號通路的激活[51]。楊旋等[43]利用高通量測序檢測了 4 例 RA 患者及 3 例健康對照組的外周血單個核細胞，發現顯著性差異改變［log2（FC）≥1.0 或 log2（FC）≤?1.0，且錯誤發現率≤0.05］的 circRNA 中有 41 種 circRNA 表達上調，30 種表達下調，利用 qRT-PCR 發現 hsa_circ_0000396 和 hsa_circ_0130438 在 RA 患者外周血中表達量顯著下調（P<0.05），并通過 KEGG pathway 等生物信息學分析發現其可能與炎癥相關的通路如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、核因子 κB 信號通路等有關，且進一步發現 hsa_circ_0000396 可能是 RA 的潛在生物標志物（AUC=0.809）。宋新強等[44]發現 hsa_circ_0005397 表達水平在 RA 患者外周血中明顯低于健康對照組（P<0.016），并可能通過影響或競爭性結合 hsa_miR_125a_3p 來調節靶基因，進而參與炎癥過程。
3.3 其他 circRNA
Li 等[39]研究發現，hsa_circ_0001859 可以通過直接抑制 miR-204/211 活性而上調激活轉錄因子 2（activating transcription factor 2，ATF2），促進 RA 的炎癥過程。就機制而言，hsa_circ_0001859 通過隱藏 miR-204/211 與其靶基因 ATF2 的 3’-非翻譯區（untranslated regions，UTR）結合位點，與 ATF2 競爭性結合 miR-204/211，進而上調 ATF2 的表達。該研究在 RA 滑膜細胞中進一步證實，沉默 hsa_circ_ 0001859 能使 ATF2 甚至白細胞介素（interleukin，IL）-6、TNF 和 IL-1β 表達明顯下調，抑制炎癥反應，ATF2 是環磷腺苷應答元件結合蛋白家族的一員，其與絲裂原活化蛋白激酶、Toll 樣受體等炎癥信號通路密切相關，而 IL-6、TNF 和 IL-1β 是信號通路的下游分子，與炎癥活性有關。這表明 hsa_circ_0001859 在滑膜組織中可能參與了慢性炎癥的過程。
CircRNA 在人外周血中存在差異表達具有區分 RA 患者與健康人的潛能[43]，可見 circRNA 可能成為診斷 RA 的新型生物標志物，并為 RA 的診斷和治療提供新的依據。
4 總結與展望
目前已有大量的 circRNA 被發現，circRNA 的功能及機制多樣化，與人類疾病發生密切相關，具有作為癌癥等疾病監測的新型靶標分子的潛能[52]，已初步展現了其潛在的應用價值。但與 RNA 家族其他成員比，circRNA 的研究仍不夠深入，circRNA 具體的生成機制還不清楚，有待進一步探索。而隨著高通量測序和生物信息學的發展，人們對 circRNA 的研究將更加透徹、深入，很可能為 RA 及其他自身免疫病的發病機制、疾病發展等相關研究提供重要線索，豐富 RA 的研究內容，幫助我們建立基于 circRNA 的 RA 臨床治療和診斷策略。
