醫院感染暴發是患者安全的嚴重威脅，常常導致嚴重的后果。使用基因分型的方法明確暴發事件中的感染源和傳播途徑是控制感染暴發的重要因素。近年來，將病原體的全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）作為基因分型的工具，使得該項工作變得更加快速和精確。使用 WGS 技術能區分高度相關的病原體譜系，在確定暴發的同時追蹤感染源信息，同時能提供更多的目標干預信息以及幫助理解傳播動力學模型，避免了傳統的同源性鑒別方法分型不精細、速度慢等缺陷。該文綜述了 WGS 技術在醫院感染暴發調查和控制中的應用實踐，評價了其優勢和面臨的挑戰。
引用本文： 喬甫. 全基因組測序在追蹤醫院感染暴發中的應用. 華西醫學, 2019, 34(3): 334-337. doi: 10.7507/1002-0179.201903067 復制
醫院感染暴發是指在醫療機構或其科室的患者中，短時間內發生 3 例以上同種同源感染病例的現象。在日常醫療活動中，由于存在不規范的醫療行為或醫療差錯，無論是大型綜合性醫院還是專科小醫療機構，都會出現醫院感染暴發的情況，并導致嚴重的后果。比如 2008 年我國西安交通大學第二附屬醫院出現了因醫院感染導致 8 名新生兒死亡的事件；2017 年浙江省中醫院出現了醫務人員因違反診療常規導致 5 例患者感染人類免疫缺陷病毒的事件，其中 2 例為孕婦。當然，即使在發達國家此類情況也不能避免，如美國于 2013 年暴發了因內鏡消毒不合格，導致 39 例患者感染了耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌的醫院感染暴發事件[1]。甚至在 2012 年，美國還出現了因甲潑尼龍注射液被污染導致全美 22 個州的 749 人被感染，其中 64 人死亡的醫院感染事件[2]。因此，醫療機構或醫務人員，在發現疑似醫院感染暴發時，最重要的是在采取消毒、隔離等常規防控措施的同時，快速準確地確認暴發、追蹤到感染源、明確傳播途徑，及時采取針對性的防控措施，避免事態擴大和出現嚴重不良后果。
1 傳統的同源性分型方法
當出現疑似醫院感染暴發時，為了幫助醫院感染管理工作者確定是否真的為醫院感染暴發，追蹤到可能的傳染源和傳播途徑，已經有多種同源性鑒定的方法被用于臨床實踐，包括脈沖場凝膠電泳、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、多位點序列分型技術以及基于 PCR 技術的 DiversiLab 系統等方法，這些方法在使用的過程中各有優缺點[3]。然而，一直以來，脈沖場凝膠電泳都被認為是同源性鑒定的“金標準”[4]，并被廣泛用于識別和追蹤各類細菌、真菌引起的醫院感染暴發。該方法的主要缺點是使用不同的標準化方案或使用不同廠商的限制性內切酶而導致結果不一致，同時該方法還具有耗時較長、操作復雜、不同批次之間可比性較差等缺點，限制了其應用范圍。另外，所有這些方法只能幫助我們確定暴發是否真的存在以及可能的傳播是如何發生的，不能準確地分析出病原體在一次暴發事件中的傳播過程或進化過程，不能據此說明到底是“傳播者”還是“受害者”，因此使用這些方法時必須輔以詳細的流行病學調查和分析，才能得出比較可靠的結果。因此，我們迫切需要一種快速、準確的方法，在幫助確定暴發的同時，明確感染源和傳播途徑，并能幫助我們更好地理解病原體的傳播過程。
2 病原體全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）概述
基于 WGS 的病原體分型技術，可以提供前所未有的分辨率，可以區分高度相關的譜系[5]。該技術的核心思想是邊合成邊延伸邊測序，通過大規模序列擴增和實時檢測合成鏈末端的信號，再通過生物信息學分析來獲得完整的基因組序列信息[6]。對病原體的整個基因組進行測序，能快速提供有關病原體鑒定、流行病學分型、藥物敏感性等信息，這都是在傳統的暴發管理中需要通過多種途徑才能實現的。更為重要的是，通過 WGS 檢測的耐藥性或毒力基因可能不在體外表型測試條件下表達。對于如何將 WGS 運用于醫院感染暴發的調查實踐，Tang 等[3]提供了一個很好的思路。
3 WGS 在醫院感染暴發調查中的實踐
3.1 證實暴發
使用 WGS 方法，可以快速地幫助我們確定是否真的有醫院感染暴發存在，即使在沒有臨床流行病學關聯的情況下，也可以通過 WGS 確認大腸埃希菌、霍亂弧菌、肺炎克雷伯菌、結核分枝桿菌、假絲酵母菌等病原體引起的暴發[5, 7-10]。早在 2012 年發表在《新英格蘭醫學》上的研究顯示，使用 WGS 可以幫助感染防控工作者鑒別發生在新生兒重癥監護病房內的多例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染是否為醫院感染暴發[11]，該研究證實了在 MRSA 的暴發中使用 WGS 的有效性。另外，同年 Snitkin 等[12]發表的研究證實了 WGS 在耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌醫院感染暴發中的應用。在該研究中，來自 7 個病房的 18 例患者被 WGS 證實感染同種同源的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，由于本次暴發涉及的病房眾多，這些患者之間并沒有明顯的流行病學聯系，因此使用傳統的流行病學方法很難確定暴發真的存在。另外，在該研究中，通過基因組測序的結果，研究者還勾畫出了可能的傳播路徑，將所有感染的患者串聯起來。
3.2 排除暴發
在某些情況下，雖然短時間內發生了 3 例及以上的醫院感染，從流行病學的角度分析可能存在醫院感染暴發的情況，但是在實際的過程中也可能存在假暴發的情況。在一起懷疑醫務人員鼻腔定植 MRSA 是引起手術部位感染暴發調查過程中，研究人員通過 WGS 發現，考慮到 MRSA 的自身突變，在過去的 16 年間沒有引起手術部位感染的 MRSA 是同種同源的，并且從疑似醫務人員鼻腔分離到的 MRSA 與從患者身上分離到的 MRSA 之間并不具有遺傳學關聯，說明并不是該醫務人員引起了手術部位感染的暴發[13]。
3.3 解釋病原體傳播模型
在醫院感染暴發時，我們通過流行病學調查可以推斷出病原體在患者之間的傳播關系，然而，很少有研究顯示，在未出現暴發時，醫務人員或環境是如何把病原體傳給患者的。在英國某重癥監護病房和一個獨立病區內開展了 14 個月的研究，通過采集醫務人員鼻拭子、患者和環境標本，通過 WGS 分析 MRSA 在醫務人員、環境和患者之間傳播的關系；該研究發現了在日常情況下有 25 起傳播發生，包括 7 例醫務人員引起的傳播、2 例環境引起的傳播以及 16 例次患者之間的傳播[14]。從傳播機制來說，一項通過 WGS 分析耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌暴發的研究顯示，該菌可通過水平轉座（Tn4401a）、質粒擴散（pKpQIL-D2）以及克隆傳播（ST661）等方式擴散開來[15]。
3.4 明確感染源
明確感染源或環境儲源，對于控制醫院感染暴發來說至關重要。在部分的暴發案例中，僅使用傳統的流行病學方法就能夠幫助我們解決相關的問題，但是大部分的暴發都不能追蹤到明確的感染源。即使從環境中分離到了相同的病原體，使用傳統的同源性鑒定方法也僅能說明二者具有一定的相關性，并不能說明相互之間的因果關系。2013 年，Harris 等[16]通過 WGS 分析，不但證實了一起發生在特殊嬰兒護理單元的涉及 26 例患者的 MRSA 感染暴發，并且研究者還追蹤到 1 名攜帶 MRSA 的工作人員是導致本次暴發的原因，同時也是在采取徹底清潔消毒后暴發仍然持續發生的主要原因。在另一起發生在新生兒監護室的銅綠假單胞菌引起的醫院感染暴發中，由于從環境中分離到多個菌株，通過 PCR 的方法很難確定哪一個是“兇手”，最后通過 WGS 才發現 1 株分離自水池的銅綠假單胞菌是引起感染暴發的主要原因，這幫助感染控制人員重新聚焦了防控措施的范圍，從而快速、有效地控制了暴發[17]。其他通過 WGS 追蹤到感染源的研究還有很多，比如由內鏡污染耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌引起的經內鏡逆行性胰膽管造影患者的感染[18]、醫院水源污染軍團菌引起的醫院感染暴發[19]、由大面積環境污染導致耐萬古霉素腸球菌感染引起的暴發[20]等。
3.5 證實醫院感染暴發與醫療設備或器械相關
在醫院感染暴發發生時，除了常見的醫院內感染源外，外源性的污染源也可能會引起這類惡性事件。最典型的自 2006 年以來，由于人工心肺機熱交換水箱系統在出廠前被奇美拉分枝桿菌污染，引起了美國、加拿大、法國、英國、瑞士、荷蘭、德國、澳大利亞以及中國香港地區數百名患者在心臟術后發生的手術部位感染[21]。由于該菌生長速度較慢，引起感染的潛伏期較長，給調查帶來了困難。在多國感染控制人員的共同努力下，通過流行病學調查和 WGS 分析，以及對該廠商的生產場地進行采樣以及采樣分離菌的 WGS 分析，最終確定 Socket 3T 熱交換水箱系統（德國 LivaNova 公司）是引起暴發的元兇[22]，該熱交換水箱系統在生產過程中就被奇美拉分枝桿菌污染。在 Li 等[23]開展的一項暴發調查中，研究人員同時使用脈沖場凝膠電泳和 WGS 證實了食物、環境和感染患者病原體之間的同源性，并追蹤到引起暴發的感染源為販賣冰淇凌的機器，這也是為什么采取了清潔消毒措施后暴發持續的原因。同時該研究者還發現，引起本次感染的李斯特菌在 2 個冰淇凌機制造廠之間有相互傳播的現象。另有一次發生在瑞士的醫院感染暴發調查顯示，通過 WGS 發現，來自 22 名患者和 16 株從手套中分離到的洋蔥伯克霍爾德菌之間<19 個等位基因，與另外 13 個不相關的臨床菌株差異超過 1 500 個等位基因明顯不同[24]，證實了感染暴發的來源是商業化的手套。
4 WGS 用于醫院感染暴發的主要優缺點
與傳統的分子生物學方法相比，WGS 具有明顯的優勢，主要包括：① 比傳統方法更準確地確認暴發是否發生，同時提供更多的目標干預信息；② 提供信息，幫助理解傳播動力學；③ 準確定位傳染源。在一起由基利恩帚枝霉菌（Sarocladium kiliense）引起的 18 例患者血流感染的暴發案例中，雖然由于是少見病原體引起的感染，沒有與非暴發菌株進行比較，但是通過 WGS 分析最終確認了暴發源是被污染的藥物，而同時使用的多位點序列分型技術分析對暴發的調查沒有什么益處[25]。另有一起調查實體器官移植中耐利奈唑胺和萬古霉素的腸球菌引起的醫院感染暴發的研究顯示，我們常用的 VITEK2 系統在檢測利奈唑胺的耐藥性方面存在一定的缺陷，而使用 WGS 證實了在 23S 核糖體 RNA 中具有 G2376C 的突變[26]，該研究更加強化了 WGS 技術在感染控制和患者照護中的應用價值。
當然，該技術在實際應用過程中也面臨著一定的挑戰[3]。首先，實驗室需要配置可以使用基因組測序的設備及技術人員，包括數據分析軟件和硬件等，當然現在第三方獨立實驗室能夠部分幫助解決這個問題。其次，必須能將測序結果準確、快速地解釋并傳達給醫院感染管理人員或相關從業人員，這些人必須能整合生物信息學數據和流行病學數據，彌補基因組學和現實生活中感染控制的差距。
5 國內現狀及發展方向
國內已經有醫院使用 WGS 開展醫院感染暴發的調查，如中日友好醫院發生艱難梭菌醫院感染暴發時，通過流行病學調查和 WGS，在證實暴發的同時，理清了傳播的模式，并追蹤到污染的廁所、浴室和傳達室的設備是引起傳播的主要原因，為感染控制工作指明了方向[27]。將來，雖然前文中提到的挑戰仍然存在，但是隨著測序技術的不斷完善以及各種新的計算策略的制定，相信越來越多的醫療機構會使用 WGS 技術來開展醫院感染暴發的調查。從事醫院感染預防與控制的人員，也會逐漸熟悉該技術，了解其功效和界限，從而將其運用到日常的工作當中。
醫院感染暴發是指在醫療機構或其科室的患者中，短時間內發生 3 例以上同種同源感染病例的現象。在日常醫療活動中，由于存在不規范的醫療行為或醫療差錯，無論是大型綜合性醫院還是專科小醫療機構，都會出現醫院感染暴發的情況，并導致嚴重的后果。比如 2008 年我國西安交通大學第二附屬醫院出現了因醫院感染導致 8 名新生兒死亡的事件；2017 年浙江省中醫院出現了醫務人員因違反診療常規導致 5 例患者感染人類免疫缺陷病毒的事件，其中 2 例為孕婦。當然，即使在發達國家此類情況也不能避免，如美國于 2013 年暴發了因內鏡消毒不合格，導致 39 例患者感染了耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌的醫院感染暴發事件[1]。甚至在 2012 年，美國還出現了因甲潑尼龍注射液被污染導致全美 22 個州的 749 人被感染，其中 64 人死亡的醫院感染事件[2]。因此，醫療機構或醫務人員，在發現疑似醫院感染暴發時，最重要的是在采取消毒、隔離等常規防控措施的同時，快速準確地確認暴發、追蹤到感染源、明確傳播途徑，及時采取針對性的防控措施，避免事態擴大和出現嚴重不良后果。
1 傳統的同源性分型方法
當出現疑似醫院感染暴發時，為了幫助醫院感染管理工作者確定是否真的為醫院感染暴發，追蹤到可能的傳染源和傳播途徑，已經有多種同源性鑒定的方法被用于臨床實踐，包括脈沖場凝膠電泳、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、多位點序列分型技術以及基于 PCR 技術的 DiversiLab 系統等方法，這些方法在使用的過程中各有優缺點[3]。然而，一直以來，脈沖場凝膠電泳都被認為是同源性鑒定的“金標準”[4]，并被廣泛用于識別和追蹤各類細菌、真菌引起的醫院感染暴發。該方法的主要缺點是使用不同的標準化方案或使用不同廠商的限制性內切酶而導致結果不一致，同時該方法還具有耗時較長、操作復雜、不同批次之間可比性較差等缺點，限制了其應用范圍。另外，所有這些方法只能幫助我們確定暴發是否真的存在以及可能的傳播是如何發生的，不能準確地分析出病原體在一次暴發事件中的傳播過程或進化過程，不能據此說明到底是“傳播者”還是“受害者”，因此使用這些方法時必須輔以詳細的流行病學調查和分析，才能得出比較可靠的結果。因此，我們迫切需要一種快速、準確的方法，在幫助確定暴發的同時，明確感染源和傳播途徑，并能幫助我們更好地理解病原體的傳播過程。
2 病原體全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）概述
基于 WGS 的病原體分型技術，可以提供前所未有的分辨率，可以區分高度相關的譜系[5]。該技術的核心思想是邊合成邊延伸邊測序，通過大規模序列擴增和實時檢測合成鏈末端的信號，再通過生物信息學分析來獲得完整的基因組序列信息[6]。對病原體的整個基因組進行測序，能快速提供有關病原體鑒定、流行病學分型、藥物敏感性等信息，這都是在傳統的暴發管理中需要通過多種途徑才能實現的。更為重要的是，通過 WGS 檢測的耐藥性或毒力基因可能不在體外表型測試條件下表達。對于如何將 WGS 運用于醫院感染暴發的調查實踐，Tang 等[3]提供了一個很好的思路。
3 WGS 在醫院感染暴發調查中的實踐
3.1 證實暴發
使用 WGS 方法，可以快速地幫助我們確定是否真的有醫院感染暴發存在，即使在沒有臨床流行病學關聯的情況下，也可以通過 WGS 確認大腸埃希菌、霍亂弧菌、肺炎克雷伯菌、結核分枝桿菌、假絲酵母菌等病原體引起的暴發[5, 7-10]。早在 2012 年發表在《新英格蘭醫學》上的研究顯示，使用 WGS 可以幫助感染防控工作者鑒別發生在新生兒重癥監護病房內的多例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染是否為醫院感染暴發[11]，該研究證實了在 MRSA 的暴發中使用 WGS 的有效性。另外，同年 Snitkin 等[12]發表的研究證實了 WGS 在耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌醫院感染暴發中的應用。在該研究中，來自 7 個病房的 18 例患者被 WGS 證實感染同種同源的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，由于本次暴發涉及的病房眾多，這些患者之間并沒有明顯的流行病學聯系，因此使用傳統的流行病學方法很難確定暴發真的存在。另外，在該研究中，通過基因組測序的結果，研究者還勾畫出了可能的傳播路徑，將所有感染的患者串聯起來。
3.2 排除暴發
在某些情況下，雖然短時間內發生了 3 例及以上的醫院感染，從流行病學的角度分析可能存在醫院感染暴發的情況，但是在實際的過程中也可能存在假暴發的情況。在一起懷疑醫務人員鼻腔定植 MRSA 是引起手術部位感染暴發調查過程中，研究人員通過 WGS 發現，考慮到 MRSA 的自身突變，在過去的 16 年間沒有引起手術部位感染的 MRSA 是同種同源的，并且從疑似醫務人員鼻腔分離到的 MRSA 與從患者身上分離到的 MRSA 之間并不具有遺傳學關聯，說明并不是該醫務人員引起了手術部位感染的暴發[13]。
3.3 解釋病原體傳播模型
在醫院感染暴發時，我們通過流行病學調查可以推斷出病原體在患者之間的傳播關系，然而，很少有研究顯示，在未出現暴發時，醫務人員或環境是如何把病原體傳給患者的。在英國某重癥監護病房和一個獨立病區內開展了 14 個月的研究，通過采集醫務人員鼻拭子、患者和環境標本，通過 WGS 分析 MRSA 在醫務人員、環境和患者之間傳播的關系；該研究發現了在日常情況下有 25 起傳播發生，包括 7 例醫務人員引起的傳播、2 例環境引起的傳播以及 16 例次患者之間的傳播[14]。從傳播機制來說，一項通過 WGS 分析耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌暴發的研究顯示，該菌可通過水平轉座（Tn4401a）、質粒擴散（pKpQIL-D2）以及克隆傳播（ST661）等方式擴散開來[15]。
3.4 明確感染源
明確感染源或環境儲源，對于控制醫院感染暴發來說至關重要。在部分的暴發案例中，僅使用傳統的流行病學方法就能夠幫助我們解決相關的問題，但是大部分的暴發都不能追蹤到明確的感染源。即使從環境中分離到了相同的病原體，使用傳統的同源性鑒定方法也僅能說明二者具有一定的相關性，并不能說明相互之間的因果關系。2013 年，Harris 等[16]通過 WGS 分析，不但證實了一起發生在特殊嬰兒護理單元的涉及 26 例患者的 MRSA 感染暴發，并且研究者還追蹤到 1 名攜帶 MRSA 的工作人員是導致本次暴發的原因，同時也是在采取徹底清潔消毒后暴發仍然持續發生的主要原因。在另一起發生在新生兒監護室的銅綠假單胞菌引起的醫院感染暴發中，由于從環境中分離到多個菌株，通過 PCR 的方法很難確定哪一個是“兇手”，最后通過 WGS 才發現 1 株分離自水池的銅綠假單胞菌是引起感染暴發的主要原因，這幫助感染控制人員重新聚焦了防控措施的范圍，從而快速、有效地控制了暴發[17]。其他通過 WGS 追蹤到感染源的研究還有很多，比如由內鏡污染耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌引起的經內鏡逆行性胰膽管造影患者的感染[18]、醫院水源污染軍團菌引起的醫院感染暴發[19]、由大面積環境污染導致耐萬古霉素腸球菌感染引起的暴發[20]等。
3.5 證實醫院感染暴發與醫療設備或器械相關
在醫院感染暴發發生時，除了常見的醫院內感染源外，外源性的污染源也可能會引起這類惡性事件。最典型的自 2006 年以來，由于人工心肺機熱交換水箱系統在出廠前被奇美拉分枝桿菌污染，引起了美國、加拿大、法國、英國、瑞士、荷蘭、德國、澳大利亞以及中國香港地區數百名患者在心臟術后發生的手術部位感染[21]。由于該菌生長速度較慢，引起感染的潛伏期較長，給調查帶來了困難。在多國感染控制人員的共同努力下，通過流行病學調查和 WGS 分析，以及對該廠商的生產場地進行采樣以及采樣分離菌的 WGS 分析，最終確定 Socket 3T 熱交換水箱系統（德國 LivaNova 公司）是引起暴發的元兇[22]，該熱交換水箱系統在生產過程中就被奇美拉分枝桿菌污染。在 Li 等[23]開展的一項暴發調查中，研究人員同時使用脈沖場凝膠電泳和 WGS 證實了食物、環境和感染患者病原體之間的同源性，并追蹤到引起暴發的感染源為販賣冰淇凌的機器，這也是為什么采取了清潔消毒措施后暴發持續的原因。同時該研究者還發現，引起本次感染的李斯特菌在 2 個冰淇凌機制造廠之間有相互傳播的現象。另有一次發生在瑞士的醫院感染暴發調查顯示，通過 WGS 發現，來自 22 名患者和 16 株從手套中分離到的洋蔥伯克霍爾德菌之間<19 個等位基因，與另外 13 個不相關的臨床菌株差異超過 1 500 個等位基因明顯不同[24]，證實了感染暴發的來源是商業化的手套。
4 WGS 用于醫院感染暴發的主要優缺點
與傳統的分子生物學方法相比，WGS 具有明顯的優勢，主要包括：① 比傳統方法更準確地確認暴發是否發生，同時提供更多的目標干預信息；② 提供信息，幫助理解傳播動力學；③ 準確定位傳染源。在一起由基利恩帚枝霉菌（Sarocladium kiliense）引起的 18 例患者血流感染的暴發案例中，雖然由于是少見病原體引起的感染，沒有與非暴發菌株進行比較，但是通過 WGS 分析最終確認了暴發源是被污染的藥物，而同時使用的多位點序列分型技術分析對暴發的調查沒有什么益處[25]。另有一起調查實體器官移植中耐利奈唑胺和萬古霉素的腸球菌引起的醫院感染暴發的研究顯示，我們常用的 VITEK2 系統在檢測利奈唑胺的耐藥性方面存在一定的缺陷，而使用 WGS 證實了在 23S 核糖體 RNA 中具有 G2376C 的突變[26]，該研究更加強化了 WGS 技術在感染控制和患者照護中的應用價值。
當然，該技術在實際應用過程中也面臨著一定的挑戰[3]。首先，實驗室需要配置可以使用基因組測序的設備及技術人員，包括數據分析軟件和硬件等，當然現在第三方獨立實驗室能夠部分幫助解決這個問題。其次，必須能將測序結果準確、快速地解釋并傳達給醫院感染管理人員或相關從業人員，這些人必須能整合生物信息學數據和流行病學數據，彌補基因組學和現實生活中感染控制的差距。
5 國內現狀及發展方向
國內已經有醫院使用 WGS 開展醫院感染暴發的調查，如中日友好醫院發生艱難梭菌醫院感染暴發時，通過流行病學調查和 WGS，在證實暴發的同時，理清了傳播的模式，并追蹤到污染的廁所、浴室和傳達室的設備是引起傳播的主要原因，為感染控制工作指明了方向[27]。將來，雖然前文中提到的挑戰仍然存在，但是隨著測序技術的不斷完善以及各種新的計算策略的制定，相信越來越多的醫療機構會使用 WGS 技術來開展醫院感染暴發的調查。從事醫院感染預防與控制的人員，也會逐漸熟悉該技術，了解其功效和界限，從而將其運用到日常的工作當中。