引用本文： 孫佳俊, 嵇振嶺, 胡婉君, 張志剛, 張天柱. 新型西羅莫司藥物涂層疝補片的制備及動物實驗研究. 華西醫學, 2019, 34(6): 659-664. doi: 10.7507/1002-0179.201901197 復制
腹壁薄弱或缺損所致的腹外疝是外科臨床常見病和多發病。據估測，中國腹外疝每年發病人數可能超過 200 萬[1]。無張力疝修補術是目前臨床治療腹外疝的金標準[2]。常用的疝修補材料基本上是以聚丙烯（polypropylene，PP）、聚酯、聚四氟乙烯等材質制備的網片。其中，PP 補片是目前最常用的腹壁缺損修補材料，這是由其特性決定的，因為 PP 補片可以允許組織長入，這為疝缺損提供了強度大且有韌性的持久修復。雖然 PP 補片具有一定的生物惰性，但是仍能引起機體的炎癥反應，導致纖維化和瘢痕形成。將 PP 補片放置在腹腔內，可能會引起腹腔粘連，給患者帶來諸多較嚴重的并發癥，如腸梗阻、腹腔/盆腔的慢性疼痛、女性不孕癥及增加再次手術的難度等[3-6]。
目前臨床尚無完全預防腹腔粘連形成的方法，研究補片粘連形成的病理生理機制對發現更好的預防粘連措施具有重要意義。據相關研究，在無植入物的情況下，術后 7 d 腹腔粘連形成達到最高水平，1 個月后無明顯變化[7]。PP 補片屬于不可吸收材料，被植入動物體內后，機體會發生一系列反應，包括血液-材料的相互作用、急性炎癥、慢性炎癥、異物反應和纖維包裹等[8]。簡而言之，當 PP 補片被植入動物體內后，材料會立即被表面蛋白所覆蓋，同時，中性粒細胞被補片吸引，產生急性炎癥反應。由于中性粒細胞無法吞噬材料，導致了所謂的“吞噬受阻”現象，在補片所在位置釋放炎癥介質，誘導其他炎性細胞，如單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等進入該區域，伴隨新血管形成和結締組織增生，形成慢性炎癥反應。隨后發生異物反應，即異物巨細胞、巨噬細胞集聚，富含新生血管和結締組織的肉芽組織生成，最終對補片進行纖維包覆[9-10]。研究人員普遍認為減輕異物反應是研究生物相容性好的疝修補材料的非常重要的內容，通過對補片表面進行修飾，可減少炎癥反應的嚴重程度，減輕組織纖維化及腹腔粘連，達到提高疝補片的生物相容性的目的[11]。
將疝補片進行表面羧基化或羥基化處理，通過化學接枝獲得表面修飾的 PP 補片具有明顯的抗粘連特性[12]。西羅莫司是一種新型大環內酯類免疫抑制劑，西羅莫司在進入細胞質后，與 FK 結合蛋白結合，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號傳導通路，具有免疫抑制、抗炎、抗纖維化、抗增殖和抗血管生成作用[13]，廣泛應用于腎移植、肺移植、自身免疫性疾病等的治療[14-16]。本實驗旨在研究將西羅莫司通過化學反應嫁接到 PP 補片表面，達到預防腹腔粘連形成的目的。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選擇健康雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠［生產許可證號 SCXK（滬）2018-0006，使用許可證號 SYXK（蘇）2016-0014］18 只，8～10 周齡，體重 270～320 g，采用隨機數字表法將大鼠隨機分為 PP 補片組（PP 組）、聚乙二醇修飾的聚丙烯（polyethylene glycol modified polypropylene，PEG-PP）補片組（PEG-PP 組）和西羅莫司藥物涂層聚丙烯（sirolimus drug-coated polypropylene，SRL-PP）補片組（SRL-PP 組），每組 6 只。PP 組作為對照組。術前將大鼠分籠在無特定病原體級實驗動物房飼養 1 周，溫度控制在 18～26℃，相對濕度 40%～70%，所有動物試驗均經東南大學動物實驗倫理委員會批準（20181111004）。
1.2 方法
1.2.1 西羅莫司藥物涂層補片制備
西羅莫司藥物涂層補片制備所用所有試劑均購自阿拉丁試劑（中國上海）有限公司，將 PP 補片［美國巴德（Bard）公司］裁剪成大小為 1.5 cm×1.5 cm 的方塊，共 18 張，用二氯甲烷浸泡 24 h，取出放入烘箱，設定溫度 60℃，烘干補片。將其中 12 張 PP 補片放入氧等離子清洗機，設定參數為 100 W，處理時間 2 min，取出 PP 補片放入雙口燒瓶內，加入聚乙二醇二羧酸溶液 20 mL，氯化亞錫 0.071 4 g，放入磁力攪拌針，將恒溫油浴鍋溫度設定到 110℃，待溫度達到預定值后將燒瓶放于鍋內，確保燒瓶球體 2/3 以上在液面以下，調整磁力攪拌針轉速至 120 r/min。加熱 3 h。冷卻至室溫，取出 PP 補片，用二氯甲烷沖洗補片后，將其中 6 張補片置入放入烘箱，設定溫度 60℃，烘干補片，另外 6 張補片置入雙口燒瓶中，加入二氯甲烷 15 mL，西羅莫司 4.6 mg，碳二亞胺 0.048 2 g，二甲氨基吡啶 0.030 7 g。將油浴鍋溫度設定到 37℃，待溫度達到預定值后將燒瓶放于鍋內，確保燒瓶球體 2/3 以上在液面以下，調整磁力攪拌針轉速至 120 r/min。加熱 4 h。取出補片，用二氯甲烷沖洗后，將補片置于烘箱中，設定溫度 60℃，烘干補片。
1.2.2 疝補片表征
使用傅里葉紅外光譜儀［美國賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）］，儀器型號 NICOLET 5700 測量疝補片表面的官能團變化，檢驗藥物是否成功上載到補片表面［傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（Attenuated totalinternal reflectance fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）］。使用視頻光學接觸角測量儀（德國 Dataphysics OCA 15 plus）測量補片表面親水性的變化。
1.2.3 疝補片的應力-應變試驗
使用拉力試驗機（南京樂尼 LN-1T）測量疝補片斷裂力學性能。樣本是正方形的（長 1.5 cm、寬 1.5 cm、厚 0.5 mm），拉伸速度為 100 mm/min，將測量結果制作成應力-應變曲線，評估疝補片的抗張力性能，為臨床應用提供力學保障。
1.2.4 手術過程
將 SD 大鼠禁食 12 h，術前稱重，用 7% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，仰臥固定，剃毛，皮膚消毒，選取腹部正中切口，切口長 2.5 cm，逐層進腹，切除大鼠右腹腹膜及肌層，直徑約 1 cm。將預先裁剪的 1.5 cm×1.5 cm 正方形網片完全覆蓋腹壁缺損，5-0 Vicryl 四角縫合固定，3-0 縫線逐層關腹。術中注意給予大鼠保暖，大鼠術后禁食 12 h、禁水 6 h。密切觀察大鼠的一般情況，包括精神狀態、飲食、排便、切口愈合情況等。
1.2.5 腹腔粘連評價及組織病理學檢查
從 2 個方面評估復合疝補片的防粘連效果，一方面是從解剖大鼠直觀觀察腹腔粘連情況，另一方面是做組織蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及免疫組織化學（免疫組化）染色，觀察炎癥反應情況。本研究采用補片植入術后第 15 天，處死 SD 大鼠，觀察腹腔疝補片粘連形成情況，采用改良的美國生育協會的粘連評分標準對粘連程度進行評分[17]，該標準對粘連特征主要從 2 個方面進行描述，即粘連類型及粘連范圍，總評分范圍為 0～6 分。
距補片邊緣 0.5 cm 切取大鼠補片覆蓋區域，包括腹壁除皮膚外的全層組織，用于 HE 染色及免疫組化染色。HE 染色觀察補片周圍的炎癥浸潤情況及新生血管形成情況。免疫組化染色觀察炎性細胞因子水平，如轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等，研究表明 TGF-β 是許多器官和組織纖維化的強誘導劑，能啟動和促進整個纖維化過程[18]，因此用其評價 TGF 與組織纖維化的關系。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用頻數和百分比表示。采用完全隨機設計資料的方差分析對實驗所得數據進行統計分析，用 Dunnett-t 檢驗判斷腹腔粘連評分組間差異。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 紅外光譜圖
采用 ATR-FTIR 測量補片的紅外光譜，比照官能團譜圖后發現（圖 1），對比 PP 補片，經聚乙二醇二羧酸接枝后，紅外光譜圖出現幾個新的吸收峰 1 732 cm–1（酯鍵）、1 259 cm–1（羧酸）、1 087 cm–1（羧酸），提示聚乙二醇二羧酸通過化學反應成功上載到 PP 補片表面。西羅莫司嫁接到 PP 補片后，ATR-FTIR 光譜出現新的變化，吸收峰 1 643 cm–1（酰胺基）的出現提示西羅莫司成功上載到補片表面。
圖1
PP 補片、PEG-PP 補片和 SRL-PP 補片的 ATR-FTIR 譜圖比較
2.2 補片接觸角
用接觸角測量儀檢測疝補片接觸角，SRL-PP 補片接觸角接近于 0°，潤濕性能優良，較其他兩組補片潤濕性能明顯改善。見圖 2。
圖2
補片接觸角測量結果圖
紅色箭頭和角度為人工測量接觸角的標尺和結果。a. 用接觸角測量儀測量 PP 補片接觸角為 124.735°，提示補片濕潤性能較差；b. 聚乙二醇接枝到 PP 表面后測得 PEG-PP 補片接觸角為 68.919°，提示補片部分潤濕或潤濕；c. 將西羅莫司嫁接到 PP 表面后液滴完全潤濕補片，接觸角接近于0°，提示 SRL-PP 補片潤濕性能優良
2.3 補片斷裂力學性能
用拉力試驗機檢測補片拉伸性能，應力-應變曲線顯示，疝補片斷裂屬于韌性斷裂，PP、PEG-PP、SRL-PP 補片抗張強度分別為 18.19、16.90、16.16 MPa。見圖 3。
圖3
補片斷裂力學性能測試曲線圖
a. PP 補片拉伸應力-應變曲線，PP 補片所能承受的最大拉力及相應的變形為 136.45 N、6.66 mm；b. PEG-PP 補片拉伸應力-應變曲線，PEG-PP 補片所能承受的最大拉力及相應的變形為 126.73 N、5.37 mm；c. SRL-PP 補片拉伸應力-應變曲線，SRL-PP 補片所能承受的最大拉力及相應的變形為 121.21 N、5.22 mm
2.4 大鼠腹腔粘連及炎癥評估
大鼠腹腔補片植入術后 15 d，解剖大鼠觀察腹腔粘連情況（圖 4）并計算粘連得分。其中，PP 組（5.17±0.69）分，PEG-PP 組（4.00±0.58）分，SRL-PP 組（1.00±0.58）分，3 組間粘連評分比較差異有統計學意義（F=60.79，P<0.01）；但 PEG-PP 組與 PP 組（t=0.77，P>0.05）、SRL-PP 組與 PEG-PP 組（t=1.99，P>0.05）比較，差異均無統計學意義；SRL-PP 組與 PP 組比較，差異有統計學意義（t=2.76，P<0.05）。
圖4
補片植入 SD 大鼠腹腔術后 15 d 腹腔粘連情況
a. PP 組大鼠腹腔粘連強度均達到中度及以上，粘連組織需要銳性分離； b. PEG-PP 組大鼠腹腔粘連強度均達到中度，粘連需要牽拉分離或銳性分離；c. SRL-PP 組大鼠腹腔粘連強度為無粘連或輕度粘連，粘連可自動分離或牽拉分離
SRL-PP 組大鼠組織的炎性細胞數量較 PP 組和 PEG-PP 組顯著減少（圖 5）。SRL-PP 組炎性細胞因子表達水平較 PP 組和 PEG-PP 組顯著降低（圖 6），與 HE 染色結果相符。
圖5
大鼠腹腔粘連組織 HE 染色結果（HE ?×100）
a. PP 組可見有大量淋巴細胞、中性粒細胞、漿細胞、單核細胞等炎性細胞彌漫分布，同時數量較多的新生血管；b. PEG-PP 組炎性細胞簇狀分布，可見少量新生血管；c. SRL-PP 組可見散在炎性細胞，新生血管數量極少；▲：代表補片位置
圖6
大鼠腹腔粘連組織免疫組化染色結果（免疫組化染色 ?×100）
PP 組顯示棕黑色或棕黃色，提示強陽性或中度陽性；PEG-PP 組顯示棕黃色提示中度陽性；SRL-PP 組顯示淡黃色，提示弱陽性；▲：代表補片位置
3 討論
腹外疝是腹部外科最常見的疾病之一，目前臨床上多采用無張力疝修補術治療，腹外疝修補的最理想方法是在腹腔內面腹壁缺損區覆蓋足夠大的補片。既往修補材料在臨床應用后多引起較嚴重的粘連，術后粘連極大地降低了患者的生活質量，嚴重者危及患者生命，防治粘連是每一個外科醫生都必須重視的問題。
幾乎所有合成材料都會引發異物反應[19]，在補片表面涂覆防粘連物質是臨床減輕補片粘連的主要措施之一，臨床上應用的復合補片多是以不可降解的 PP、聚酯或膨體聚四氟乙烯為骨架網，再在其表面添加可吸收的組織相容性好的高分子材料或藥物[20-22]。這種復合補片的涂層大多是采用凝膠物理凝固的方法涂覆到補片表面，因此涂層具有較大的脆性，容易斷裂，無法達到最佳抗粘連效果。要使藥物有效上載到補片表面，同時優化涂層的物理性能，最好的方法是采用化學催化法對材料進行表面改性。我們研究小組成功將聚乳酸化學嫁接到補片表面，使得通過化學反應的方法構建新型西羅莫司藥物洗脫涂層腹壁修補材料成為可能[12]。利用西羅莫司的抗炎、抗增殖、抗纖維化等作用，可達到強化預防補片粘連形成的目的。
本實驗研究了 SRL-PP 補片的制備工藝及其抗粘連特性，結果顯示可通過化學反應的方法將西羅莫司上載到了補片表面，且相比于其他兩組補片，SRL-PP 組補片接觸角接近于 0°，表明西羅莫司的上載改善了補片的親水性，為間皮細胞的生長提供了良好的條件。3 組補片抗張強度差別不大，提示 SRL-PP 補片具有良好的力學性能，表面修飾對其抗張力性能無明顯影響，為臨床應用提供了力學保障。將 3 組補片分別植入大鼠腹腔，SRL-PP 組大鼠腹腔粘連程度和炎癥評估均較其他兩組低，表明西羅莫司藥物涂層 PP 補片可減輕粘連形成，這為下一步的臨床試驗奠定了理論基礎和安全保證。
值得指出的是，臨床可應用的預防粘連藥物種類很多，如防纖維蛋白沉積藥奧曲肽、細胞因子抑制劑吡非尼酮、中成藥鉤藤堿等[23-24]。本實驗的成功預示著其他防粘連藥物均可能通過適當的中間物化學嫁接到材料表面，因此不排除存在更優異的藥物涂層補片。本研究中 PP 補片涂層所用材料均為可吸收物質，但未觀察其長期防粘連效果，同時因未檢測血藥濃度實驗設備，未能檢測西羅莫司藥物代謝過程及安全劑量范圍，因此需進一步進行相關研究。
腹壁薄弱或缺損所致的腹外疝是外科臨床常見病和多發病。據估測，中國腹外疝每年發病人數可能超過 200 萬[1]。無張力疝修補術是目前臨床治療腹外疝的金標準[2]。常用的疝修補材料基本上是以聚丙烯（polypropylene，PP）、聚酯、聚四氟乙烯等材質制備的網片。其中，PP 補片是目前最常用的腹壁缺損修補材料，這是由其特性決定的，因為 PP 補片可以允許組織長入，這為疝缺損提供了強度大且有韌性的持久修復。雖然 PP 補片具有一定的生物惰性，但是仍能引起機體的炎癥反應，導致纖維化和瘢痕形成。將 PP 補片放置在腹腔內，可能會引起腹腔粘連，給患者帶來諸多較嚴重的并發癥，如腸梗阻、腹腔/盆腔的慢性疼痛、女性不孕癥及增加再次手術的難度等[3-6]。
目前臨床尚無完全預防腹腔粘連形成的方法，研究補片粘連形成的病理生理機制對發現更好的預防粘連措施具有重要意義。據相關研究，在無植入物的情況下，術后 7 d 腹腔粘連形成達到最高水平，1 個月后無明顯變化[7]。PP 補片屬于不可吸收材料，被植入動物體內后，機體會發生一系列反應，包括血液-材料的相互作用、急性炎癥、慢性炎癥、異物反應和纖維包裹等[8]。簡而言之，當 PP 補片被植入動物體內后，材料會立即被表面蛋白所覆蓋，同時，中性粒細胞被補片吸引，產生急性炎癥反應。由于中性粒細胞無法吞噬材料，導致了所謂的“吞噬受阻”現象，在補片所在位置釋放炎癥介質，誘導其他炎性細胞，如單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等進入該區域，伴隨新血管形成和結締組織增生，形成慢性炎癥反應。隨后發生異物反應，即異物巨細胞、巨噬細胞集聚，富含新生血管和結締組織的肉芽組織生成，最終對補片進行纖維包覆[9-10]。研究人員普遍認為減輕異物反應是研究生物相容性好的疝修補材料的非常重要的內容，通過對補片表面進行修飾，可減少炎癥反應的嚴重程度，減輕組織纖維化及腹腔粘連，達到提高疝補片的生物相容性的目的[11]。
將疝補片進行表面羧基化或羥基化處理，通過化學接枝獲得表面修飾的 PP 補片具有明顯的抗粘連特性[12]。西羅莫司是一種新型大環內酯類免疫抑制劑，西羅莫司在進入細胞質后，與 FK 結合蛋白結合，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號傳導通路，具有免疫抑制、抗炎、抗纖維化、抗增殖和抗血管生成作用[13]，廣泛應用于腎移植、肺移植、自身免疫性疾病等的治療[14-16]。本實驗旨在研究將西羅莫司通過化學反應嫁接到 PP 補片表面，達到預防腹腔粘連形成的目的。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選擇健康雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠［生產許可證號 SCXK（滬）2018-0006，使用許可證號 SYXK（蘇）2016-0014］18 只，8～10 周齡，體重 270～320 g，采用隨機數字表法將大鼠隨機分為 PP 補片組（PP 組）、聚乙二醇修飾的聚丙烯（polyethylene glycol modified polypropylene，PEG-PP）補片組（PEG-PP 組）和西羅莫司藥物涂層聚丙烯（sirolimus drug-coated polypropylene，SRL-PP）補片組（SRL-PP 組），每組 6 只。PP 組作為對照組。術前將大鼠分籠在無特定病原體級實驗動物房飼養 1 周，溫度控制在 18～26℃，相對濕度 40%～70%，所有動物試驗均經東南大學動物實驗倫理委員會批準（20181111004）。
1.2 方法
1.2.1 西羅莫司藥物涂層補片制備
西羅莫司藥物涂層補片制備所用所有試劑均購自阿拉丁試劑（中國上海）有限公司，將 PP 補片［美國巴德（Bard）公司］裁剪成大小為 1.5 cm×1.5 cm 的方塊，共 18 張，用二氯甲烷浸泡 24 h，取出放入烘箱，設定溫度 60℃，烘干補片。將其中 12 張 PP 補片放入氧等離子清洗機，設定參數為 100 W，處理時間 2 min，取出 PP 補片放入雙口燒瓶內，加入聚乙二醇二羧酸溶液 20 mL，氯化亞錫 0.071 4 g，放入磁力攪拌針，將恒溫油浴鍋溫度設定到 110℃，待溫度達到預定值后將燒瓶放于鍋內，確保燒瓶球體 2/3 以上在液面以下，調整磁力攪拌針轉速至 120 r/min。加熱 3 h。冷卻至室溫，取出 PP 補片，用二氯甲烷沖洗補片后，將其中 6 張補片置入放入烘箱，設定溫度 60℃，烘干補片，另外 6 張補片置入雙口燒瓶中，加入二氯甲烷 15 mL，西羅莫司 4.6 mg，碳二亞胺 0.048 2 g，二甲氨基吡啶 0.030 7 g。將油浴鍋溫度設定到 37℃，待溫度達到預定值后將燒瓶放于鍋內，確保燒瓶球體 2/3 以上在液面以下，調整磁力攪拌針轉速至 120 r/min。加熱 4 h。取出補片，用二氯甲烷沖洗后，將補片置于烘箱中，設定溫度 60℃，烘干補片。
1.2.2 疝補片表征
使用傅里葉紅外光譜儀［美國賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）］，儀器型號 NICOLET 5700 測量疝補片表面的官能團變化，檢驗藥物是否成功上載到補片表面［傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（Attenuated totalinternal reflectance fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）］。使用視頻光學接觸角測量儀（德國 Dataphysics OCA 15 plus）測量補片表面親水性的變化。
1.2.3 疝補片的應力-應變試驗
使用拉力試驗機（南京樂尼 LN-1T）測量疝補片斷裂力學性能。樣本是正方形的（長 1.5 cm、寬 1.5 cm、厚 0.5 mm），拉伸速度為 100 mm/min，將測量結果制作成應力-應變曲線，評估疝補片的抗張力性能，為臨床應用提供力學保障。
1.2.4 手術過程
將 SD 大鼠禁食 12 h，術前稱重，用 7% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，仰臥固定，剃毛，皮膚消毒，選取腹部正中切口，切口長 2.5 cm，逐層進腹，切除大鼠右腹腹膜及肌層，直徑約 1 cm。將預先裁剪的 1.5 cm×1.5 cm 正方形網片完全覆蓋腹壁缺損，5-0 Vicryl 四角縫合固定，3-0 縫線逐層關腹。術中注意給予大鼠保暖，大鼠術后禁食 12 h、禁水 6 h。密切觀察大鼠的一般情況，包括精神狀態、飲食、排便、切口愈合情況等。
1.2.5 腹腔粘連評價及組織病理學檢查
從 2 個方面評估復合疝補片的防粘連效果，一方面是從解剖大鼠直觀觀察腹腔粘連情況，另一方面是做組織蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及免疫組織化學（免疫組化）染色，觀察炎癥反應情況。本研究采用補片植入術后第 15 天，處死 SD 大鼠，觀察腹腔疝補片粘連形成情況，采用改良的美國生育協會的粘連評分標準對粘連程度進行評分[17]，該標準對粘連特征主要從 2 個方面進行描述，即粘連類型及粘連范圍，總評分范圍為 0～6 分。
距補片邊緣 0.5 cm 切取大鼠補片覆蓋區域，包括腹壁除皮膚外的全層組織，用于 HE 染色及免疫組化染色。HE 染色觀察補片周圍的炎癥浸潤情況及新生血管形成情況。免疫組化染色觀察炎性細胞因子水平，如轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等，研究表明 TGF-β 是許多器官和組織纖維化的強誘導劑，能啟動和促進整個纖維化過程[18]，因此用其評價 TGF 與組織纖維化的關系。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用頻數和百分比表示。采用完全隨機設計資料的方差分析對實驗所得數據進行統計分析，用 Dunnett-t 檢驗判斷腹腔粘連評分組間差異。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 紅外光譜圖
采用 ATR-FTIR 測量補片的紅外光譜，比照官能團譜圖后發現（圖 1），對比 PP 補片，經聚乙二醇二羧酸接枝后，紅外光譜圖出現幾個新的吸收峰 1 732 cm–1（酯鍵）、1 259 cm–1（羧酸）、1 087 cm–1（羧酸），提示聚乙二醇二羧酸通過化學反應成功上載到 PP 補片表面。西羅莫司嫁接到 PP 補片后，ATR-FTIR 光譜出現新的變化，吸收峰 1 643 cm–1（酰胺基）的出現提示西羅莫司成功上載到補片表面。
圖1
PP 補片、PEG-PP 補片和 SRL-PP 補片的 ATR-FTIR 譜圖比較
2.2 補片接觸角
用接觸角測量儀檢測疝補片接觸角，SRL-PP 補片接觸角接近于 0°，潤濕性能優良，較其他兩組補片潤濕性能明顯改善。見圖 2。
圖2
補片接觸角測量結果圖
紅色箭頭和角度為人工測量接觸角的標尺和結果。a. 用接觸角測量儀測量 PP 補片接觸角為 124.735°，提示補片濕潤性能較差；b. 聚乙二醇接枝到 PP 表面后測得 PEG-PP 補片接觸角為 68.919°，提示補片部分潤濕或潤濕；c. 將西羅莫司嫁接到 PP 表面后液滴完全潤濕補片，接觸角接近于0°，提示 SRL-PP 補片潤濕性能優良
2.3 補片斷裂力學性能
用拉力試驗機檢測補片拉伸性能，應力-應變曲線顯示，疝補片斷裂屬于韌性斷裂，PP、PEG-PP、SRL-PP 補片抗張強度分別為 18.19、16.90、16.16 MPa。見圖 3。
圖3
補片斷裂力學性能測試曲線圖
a. PP 補片拉伸應力-應變曲線，PP 補片所能承受的最大拉力及相應的變形為 136.45 N、6.66 mm；b. PEG-PP 補片拉伸應力-應變曲線，PEG-PP 補片所能承受的最大拉力及相應的變形為 126.73 N、5.37 mm；c. SRL-PP 補片拉伸應力-應變曲線，SRL-PP 補片所能承受的最大拉力及相應的變形為 121.21 N、5.22 mm
2.4 大鼠腹腔粘連及炎癥評估
大鼠腹腔補片植入術后 15 d，解剖大鼠觀察腹腔粘連情況（圖 4）并計算粘連得分。其中，PP 組（5.17±0.69）分，PEG-PP 組（4.00±0.58）分，SRL-PP 組（1.00±0.58）分，3 組間粘連評分比較差異有統計學意義（F=60.79，P<0.01）；但 PEG-PP 組與 PP 組（t=0.77，P>0.05）、SRL-PP 組與 PEG-PP 組（t=1.99，P>0.05）比較，差異均無統計學意義；SRL-PP 組與 PP 組比較，差異有統計學意義（t=2.76，P<0.05）。
圖4
補片植入 SD 大鼠腹腔術后 15 d 腹腔粘連情況
a. PP 組大鼠腹腔粘連強度均達到中度及以上，粘連組織需要銳性分離； b. PEG-PP 組大鼠腹腔粘連強度均達到中度，粘連需要牽拉分離或銳性分離；c. SRL-PP 組大鼠腹腔粘連強度為無粘連或輕度粘連，粘連可自動分離或牽拉分離
SRL-PP 組大鼠組織的炎性細胞數量較 PP 組和 PEG-PP 組顯著減少（圖 5）。SRL-PP 組炎性細胞因子表達水平較 PP 組和 PEG-PP 組顯著降低（圖 6），與 HE 染色結果相符。
圖5
大鼠腹腔粘連組織 HE 染色結果（HE ?×100）
a. PP 組可見有大量淋巴細胞、中性粒細胞、漿細胞、單核細胞等炎性細胞彌漫分布，同時數量較多的新生血管；b. PEG-PP 組炎性細胞簇狀分布，可見少量新生血管；c. SRL-PP 組可見散在炎性細胞，新生血管數量極少；▲：代表補片位置
圖6
大鼠腹腔粘連組織免疫組化染色結果（免疫組化染色 ?×100）
PP 組顯示棕黑色或棕黃色，提示強陽性或中度陽性；PEG-PP 組顯示棕黃色提示中度陽性；SRL-PP 組顯示淡黃色，提示弱陽性；▲：代表補片位置
3 討論
腹外疝是腹部外科最常見的疾病之一，目前臨床上多采用無張力疝修補術治療，腹外疝修補的最理想方法是在腹腔內面腹壁缺損區覆蓋足夠大的補片。既往修補材料在臨床應用后多引起較嚴重的粘連，術后粘連極大地降低了患者的生活質量，嚴重者危及患者生命，防治粘連是每一個外科醫生都必須重視的問題。
幾乎所有合成材料都會引發異物反應[19]，在補片表面涂覆防粘連物質是臨床減輕補片粘連的主要措施之一，臨床上應用的復合補片多是以不可降解的 PP、聚酯或膨體聚四氟乙烯為骨架網，再在其表面添加可吸收的組織相容性好的高分子材料或藥物[20-22]。這種復合補片的涂層大多是采用凝膠物理凝固的方法涂覆到補片表面，因此涂層具有較大的脆性，容易斷裂，無法達到最佳抗粘連效果。要使藥物有效上載到補片表面，同時優化涂層的物理性能，最好的方法是采用化學催化法對材料進行表面改性。我們研究小組成功將聚乳酸化學嫁接到補片表面，使得通過化學反應的方法構建新型西羅莫司藥物洗脫涂層腹壁修補材料成為可能[12]。利用西羅莫司的抗炎、抗增殖、抗纖維化等作用，可達到強化預防補片粘連形成的目的。
本實驗研究了 SRL-PP 補片的制備工藝及其抗粘連特性，結果顯示可通過化學反應的方法將西羅莫司上載到了補片表面，且相比于其他兩組補片，SRL-PP 組補片接觸角接近于 0°，表明西羅莫司的上載改善了補片的親水性，為間皮細胞的生長提供了良好的條件。3 組補片抗張強度差別不大，提示 SRL-PP 補片具有良好的力學性能，表面修飾對其抗張力性能無明顯影響，為臨床應用提供了力學保障。將 3 組補片分別植入大鼠腹腔，SRL-PP 組大鼠腹腔粘連程度和炎癥評估均較其他兩組低，表明西羅莫司藥物涂層 PP 補片可減輕粘連形成，這為下一步的臨床試驗奠定了理論基礎和安全保證。
值得指出的是，臨床可應用的預防粘連藥物種類很多，如防纖維蛋白沉積藥奧曲肽、細胞因子抑制劑吡非尼酮、中成藥鉤藤堿等[23-24]。本實驗的成功預示著其他防粘連藥物均可能通過適當的中間物化學嫁接到材料表面，因此不排除存在更優異的藥物涂層補片。本研究中 PP 補片涂層所用材料均為可吸收物質，但未觀察其長期防粘連效果，同時因未檢測血藥濃度實驗設備，未能檢測西羅莫司藥物代謝過程及安全劑量范圍，因此需進一步進行相關研究。
