引用本文： 胡觀麗, 張蓓, 張晶波, 劉建維, 王晴, 董潔, 孟琳. 雌激素受體 α、β 對子宮內膜癌細胞增殖影響的研究. 華西醫學, 2019, 34(8): 921-927. doi: 10.7507/1002-0179.201901178 復制
子宮內膜癌是我國乃至全球最常見的女性癌癥之一[1-2]。雌激素水平作為子宮內膜癌發生發展的危險因素，通過與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合觸發多種癌基因或抑癌基因的異常轉錄表達，進而促進腫瘤的形成及進展惡化[3]。ER 包括核受體和膜性受體兩大類，ERα 和 ERβ 為研究較為廣泛的雌激素核受體的兩種亞型[4]。研究表明 ERα 和 ERβ 亞型在子宮內膜癌組織中可能具有不同的表達模式，提示 ERα 和 ERβ 在子宮內膜癌中可能具有不同的生物學功能[5]。CyclinD1 和 P21 為細胞周期調控蛋白，其異常表達與子宮內膜癌的發生發展密切相關，相關研究表明，CyclinD1 和 P21 可能作為 ER 在子宮內膜癌中發揮作用的下游靶基因[6]。二甲雙胍是一種常用于治療 2 型糖尿病的降血糖藥物，近年來研究發現二甲雙胍在許多癌癥（包括子宮內膜癌）中具有較好的抗癌作用[7]。本課題組前期研究也證實，二甲雙胍可抑制雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖，并可調節子宮內膜癌中 ERα 和 ERβ 基因的表達[8]。但目前仍不清楚二甲雙胍是否通過調節 ERα 和 ERβ 基因的表達，進而對子宮內膜癌具有抑癌的作用。本研究將通過構建 ERα 和 ERβ 干擾細胞模型，研究 ERα 和 ERβ 對雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖的作用，以及對下游細胞周期調控因子 CyclinD1 和 P21 表達的影響；進而加入二甲雙胍處理因素，研究二甲雙胍抑制子宮內膜癌細胞增殖的作用機制是否由 ERα 和 ERβ 介導。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
人子宮內膜癌細胞系 Ishikawa 細胞購于中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫，胎牛血清、RPMI-1640 細胞培養液購自美國 Gibco 公司，17β 雌二醇、二甲雙胍購自美國 Sigma 公司，Trizol 裂解液、PrimeScript? RT reagent Kit 逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本 Takara 公司，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白測定試劑盒、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑、RNA 酶、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液均購自中國碧云天公司，ERα、ERβ、cyclinD1、P21 及 β-actin 蛋白抗體均購于英國 Abcam 公司。熒光定量用 CFX Connect 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統、蛋白電泳儀、蛋白轉膜儀均購自美國 Bio-Rad 公司。本研究經徐州醫科大學倫理委員會審批通過。
1.2 細胞培養及處理
配制胎牛血清濃度為 10% 的 RPMI-1640 細胞培養液用于培養 Ishikawa 細胞。細胞培養環境為 37℃、5% 二氧化碳。
雌激素處理：配制終濃度為 1×10–6 mol/L 的 17β 雌二醇培養液處理細胞 48 h。
二甲雙胍處理：配制終濃度為 5 mmol/L 的二甲雙胍培養液處理細胞 48 h。
雌二醇聯合短發卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）-ERα 干擾處理，分為 4 組：正常培養液對照+shRNA-NC 處理、雌二醇處理+shRNA-NC 處理、正常培養液對照+shRNA-ERα 干擾處理、雌二醇處理+shRNA-ERα 干擾處理。
雌二醇聯合 shRNA-ERβ 干擾處理，分為 4 組：正常培養液對照+shRNA-NC 處理、雌二醇處理+shRNA-NC 處理、正常培養液對照+shRNA-ERβ 干擾處理、雌二醇處理+shRNA-ERβ 干擾處理。
二甲雙胍聯合 shRNA-ERα 干擾處理，分為 4 組：正常培養液對照+shRNA-NC 處理、二甲雙胍處理+shRNA-NC 處理、正常培養液對照+shRNA-ERα 干擾處理、二甲雙胍處理+shRNA-ERα 干擾處理。
二甲雙胍聯合 shRNA-ERβ 干擾處理，分為 4 組：正常培養液對照+shRNA-NC 處理、二甲雙胍處理+shRNA-NC 處理、正常培養液對照+shRNA-ERβ 干擾處理、二甲雙胍處理+shRNA-ERβ 干擾處理。
1.3 ERα、ERβ 干擾慢病毒載體的構建及轉染
為了獲得干擾 ERα 和 ERβ 的 Ishikawa 細胞，針對 ERα 和 ERβ 基因 mRNA 設計合成干擾序列，并將干擾序列構建到慢病毒載體中形成 shRNA-ERα 慢病毒載體和 shRNA-ERβ 慢病毒載體。干擾序列的合成及慢病毒載體的構建由上海吉瑪公司完成。同時在上海吉瑪公司購買陰性對照 shRNA-NC 慢病毒載體作為實驗對照。對 Ishikawa 細胞分別侵染 shRNA-ERα 慢病毒、shRNA-ERβ 慢病毒或 shRNA-NC 慢病毒。72 h 后驗證 Ishikawa 細胞中 ERα 和 ERβ 的干擾效率。
1.4 總 RNA 提取及實時定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測
利用傳統 Trizol 法提取 Ishikawa 細胞總 RNA，采用紫外分光光度計檢測提取后總 RNA 的濃度和純度后，進行逆轉錄 PCR 合成互補 DNA。逆轉錄 PCR 采用 PrimeScript? RT reagent Kit 逆轉錄試劑盒進行。合成后的互補 DNA 用于后續熒光定量 PCR 檢測。按照 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書進行擴增，記錄相應的 Ct 值，采用 2–△△Ct 分析法分析基因的相對表達量。ERα 和 ERβ 基因引物如下：ERα 上游引物，5′-AGTGCCTTGTTGGATGCTG-3′，ERα 下游引物，5′-TGCCAGGTTGGTCAGTAAGC-3′；ERβ 上游引物，5′-AGTCCCTGGTGTGAAGCAAG-3′，ERβ 下游引物，5′-TGAGCATCCCTCTTTGAACC-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為本實驗中的內參，引物序列如下：GAPDH 上游引物，5′-CAGTCAGCCGCATCTTCTTTT-3′，GAPDH 下游引物，5′-GTGACCAGGCGCCCAATAC-3′。
1.5 蛋白質印跡法
利用放射免疫沉淀裂解液裂解 Ishikawa 細胞總蛋白，并采用 BCA 蛋白測定試劑盒測定各組蛋白濃度。Ishikawa 細胞總蛋白經過高溫變性后，用于后續的蛋白電泳及轉膜，各組蛋白上樣量為 60 μg，采用 10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠進行電泳。蛋白轉印到聚偏二氟乙烯膜后，采用 5% 脫脂奶粉封閉 1 h，隨后在 4℃ 環境中進行一抗抗體過夜孵育。ERα、ERβ、cyclinD1 及 P21 蛋白抗體進行 1∶1 000 稀釋，內參 β-actin 抗體進行 1∶10 000 稀釋。一抗孵育后進行洗膜并在室溫中孵育二抗 1 h，洗膜后進行曝光檢測。
1.6 MTT 法檢測細胞增殖
取對數生長期 Ishikawa 細胞，按每孔 1×104個細胞接種于 96 孔板，每孔 200 μL，5% 二氧化碳、37℃ 培養箱培養約 24 h 至細胞貼壁。培養 48 h 后，每孔加入濃度為 5 mg/mL 的 MTT 20 μL 繼續培養 4 h，吸棄上清液，每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，平板搖床搖勻 10 min，置酶標儀于 490 nm 波長處檢測每孔的吸光度值（A490 nm），根據各組細胞吸光度值反映細胞增殖狀況。實驗重復 3 次，每組 6 個復孔。
1.7 流式細胞儀檢測細胞周期
將不同組細胞用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化 1～3 min，收集細胞后用磷酸鹽緩沖液清洗細胞 2 遍。加入 1 mL –20℃ 預冷的乙醇，輕輕吹散細胞后 4℃ 過夜。磷酸鹽緩沖液清洗后加入 100 μL RNA 酶 37℃ 水浴孵育 30 min。隨后加入 500 μL PI 染液 4℃ 避光孵育 30 min。最后利用流式細胞儀檢測各組細胞中 G1、S、G2 期細胞比例，觀察各組細胞周期的變化。實驗重復 3 次，每組 3 個復孔。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件進行統計分析。計量資料組間比較采用方差分析，隨后采用 LSD 法進行兩兩比較。檢驗水準 α=0.05。采用 Graphpad Prism 軟件繪制統計圖。
2 結果
2.1 Ishikawa 細胞中 ERα、ERβ 干擾慢病毒載體的構建及鑒定
將 ERα、ERβ 干擾慢病毒載體分別感染 Ishikawa 細胞，感染 72 h 后，提取 Ishikawa 細胞總 RNA 及總蛋白檢測 ERα、ERβ 基因 mRNA 及蛋白表達水平的變化。qRT-PCR 結果顯示，Ishikawa 細胞感染 ERα 干擾慢病毒載體后，ERα 基因 mRNA 表達水平與對照組相比下調 76%，差異有統計學意義（P<0.05）；Ishikawa 細胞感染 ERβ 干擾慢病毒載體后，ERβ 基因 mRNA 表達水平與對照組相比下調 67%，差異也有統計學意義（P<0.05）。此外，蛋白質印跡法結果顯示，在 Ishikawa 細胞感染 ERα、ERβ 干擾慢病毒載體后，ERα 和 ERβ 蛋白表達水平均受到明顯下調。以上 qRT-PCR 及蛋白質印跡法結果提示，ERα、ERβ 干擾慢病毒載體在 Ishikawa 細胞中均具有較好的干擾效果。見圖 1。
圖1
ERα、ERβ 慢病毒干擾載體在 Ishikawa 細胞中干擾效果驗證
shRNA-NC 表示陰性對照 shRNA，shRNA-ERα 表示針對 ERα 的 shRNA，shRNA-ERβ 表示針對 ERβ 的 shRNA；**表示
2.2 ERα 干擾對雌二醇誘導的 Ishikawa 細胞增殖和周期的影響
利用 MTT 法檢測雌二醇聯合 shRNA-ERα 干擾處理對 Ishikawa 細胞增殖能力的影響。3 d 內的生存曲線顯示，單獨雌二醇處理可以促進 Ishikawa 細胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；單獨干擾 ERα 抑制 Ishikawa 細胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；干擾 ERα 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERα 能抵消雌二醇促增殖的作用（P>0.05）。見圖 2a。
圖2
ERα 干擾對 Ishikawa 細胞增殖和周期的影響
shRNA-NC 表示陰性對照 shRNA，shRNA-ERα 表示針對 ERα 的 shRNA，E2 表示雌二醇處理；*表示
利用流式細胞儀檢測以上 4 組處理中的細胞周期，結果發現，單獨雌二醇處理導致 Ishikawa 細胞 G1 期細胞比例減少，S 期細胞比例增多（P<0.05），說明細胞周期加快；單獨干擾 ERα 基因后，G1 期細胞比例增多，S 期細胞比例減少（P<0.05），說明細胞周期阻滯；干擾 ERα 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERα 能抵消雌二醇對細胞周期的促進作用（P>0.05）。見圖 2b。
此外，我們還檢測了雌二醇聯合 shRNA-ERα 干擾處理對 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影響。結果顯示，單獨雌二醇處理可以促進 Ishikawa 細胞 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表達，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表達（P<0.05）；單獨干擾 ERα 抑制 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表達，促進 P21 基因 mRNA 和蛋白的表達（P<0.05）；干擾 ERα 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERα 能抵消雌二醇對 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影響（P>0.05）。見圖 2c、2d。
2.3 ERβ 干擾對雌二醇誘導的 Ishikawa 細胞增殖和周期的影響
利用 MTT 法檢測雌二醇聯合 shRNA-ERβ 干擾處理對 Ishikawa 細胞增殖能力的影響。3 d 內的生存曲線顯示，單獨雌二醇處理可以促進 Ishikawa 細胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；單獨干擾 ERβ 也促進 Ishikawa 細胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；干擾 ERβ 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERβ 能增強雌二醇促增殖的作用（P<0.05）。見圖 3a。
圖3
ERβ 干擾對 Ishikawa 細胞增殖和周期的影響
shRNA-NC 表示陰性對照 shRNA，shRNA-ERβ 表示針對 ERβ 的 shRNA，E2 表示雌二醇處理；*表示
利用流式細胞儀檢測以上 4 組處理中的細胞周期，結果發現，單獨雌二醇處理導致 Ishikawa 細胞 G1 期細胞比例減少，S 期細胞比例增多（P<0.05），說明細胞周期加快；單獨干擾 ERβ 基因后，也出現 G1 期細胞比例減少，S 期細胞比例增多（P<0.05），說明細胞周期同樣得到促進；干擾 ERβ 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERβ 能增強雌二醇對細胞周期的促進作用（P<0.05）。見圖 3b。
此外，我們還檢測了雌二醇聯合 shRNA-ERβ 干擾處理對 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影響。結果顯示，單獨雌二醇處理可以促進 Ishikawa 細胞 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表達，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表達（P<0.05）；單獨干擾 ERβ 促進 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表達，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表達（P<0.05）；干擾 ERβ 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERβ 能增強雌二醇對 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影響（P<0.05）。見圖 3c、3d。
2.4 ERα 干擾對二甲雙胍抑制 Ishikawa 細胞增殖的影響
在相同雌激素處理的條件下，分別在二甲雙胍處理 0 h 和 48 h 兩個時相點，利用 MTT 法檢測二甲雙胍聯合 shRNA-ERα 干擾處理條件下 Ishikawa 細胞的增殖情況。結果發現，二甲雙胍處理 0 h 各組 Ishikawa 細胞增殖情況一致，說明在二甲雙胍處理前各組細胞處于同一增殖水平。二甲雙胍處理 48 h 后，在陰性對照 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍抑制了雌激素誘導的 Ishikawa 細胞增殖（P<0.05）；而在干擾 ERα 基因的 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍對 Ishikawa 細胞增殖的抑制作用消失（P>0.05）。見圖 4a。
圖4
ERα、ERβ干擾對二甲雙胍抑制雌激素誘導的 Ishikawa 細胞增殖的影響
4 組細胞均在相同的雌激素處理條件下進行；shRNA-NC 表示陰性對照 shRNA，shRNA-ERα 表示針對 ERα 的 shRNA，shRNA-ERβ 表示針對 ERβ 的 shRNA，control 表示空白藥物對照，Met 表示二甲雙胍藥物處理；*表示
2.5 ERβ 對二甲雙胍抑制 Ishikawa 細胞增殖的影響
分別在二甲雙胍處理 0 h 和 48 h 兩個時相點，利用 MTT 法檢測二甲雙胍聯合 shRNA-ERβ 干擾處理條件下 Ishikawa 細胞的增殖情況。結果發現，在相同雌激素處理情況下，二甲雙胍處理 0 h 各組 Ishikawa 細胞增殖處于同一基線水平。二甲雙胍處理 48 h 后，在陰性對照 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍抑制了 Ishikawa 細胞的增殖（P<0.05）；而在干擾 ERβ 基因的 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍對 Ishikawa 細胞增殖的抑制作用消失（P>0.05）。見圖 4b。
3 討論
子宮內膜癌是雌激素依賴性的婦科惡性腫瘤，雌激素水平與子宮內膜癌的發生發展密切相關[9]。雌二醇是生物學效應最強、體內含量最豐富的雌激素；ER 是核受體超家族的成員之一，雌二醇與 ER 的配體結合域結合后，激活 ER 入核，并作用于靶基因上游啟動子區域的雌激素反應元件，誘導下游基因轉錄[10]。ER 具有 2 種亞型（ERα 和 ERβ），分別由不同的基因編碼，盡管 ERα 和 ERβ 具有相似的蛋白結構，但最近的研究發現，ERα 和 ERβ 具有不同的信號轉導途徑，發揮不同甚至相反的生物學活性[11]。在細胞功能上，ERα 和 ERβ 也可能介導不同的生物學效應，ERα 主要介導上皮細胞的分化和增殖，ERβ 則主要介導細胞的凋亡反應[12]。在表達模式上，在 ERα 和 ERβ 共存的乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜腫瘤發展惡化過程中，ERβ 表達逐漸降低而 ERα 表達則增加[13-14]。由此可見，ERα 和 ERβ 兩種亞型表達失衡可能是激素依賴性腫瘤如子宮內膜癌發生的一個關鍵步驟，提示 ERα 和 ERβ 可能在子宮內膜癌發生發展過程中具有不同的生物學功能，因此有必要深入研究 ERα 和 ERβ 在雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖中的作用。
本研究利用慢病毒載體分別構建了 ERα 干擾 Ishikawa 細胞模型和 ERβ 干擾 Ishikawa 細胞模型。在無雌激素刺激的情況下，通過 MTT 實驗發現干擾 ERα 的表達可以抑制 Ishikawa 細胞的增殖，與之相反干擾 ERβ 的表達則可以促進 Ishikawa 細胞的增殖。此外，通過流式細胞術檢測發現，干擾 ERα 的表達可以阻滯 Ishikawa 細胞周期，干擾 ERβ 的表達則可以促進 Ishikawa 細胞周期從 G1 期進入 S 期。CyclinD1 為目前公認的癌基因，可以驅動細胞由 G1 期進入 S 期進而促進細胞增殖[15]。P21 蛋白功能與之相反，通過抑制 cyclinD1-CDK4 和 cyclinE-CDK2 的活性，使細胞周期停滯在 G1 期，從而抑制腫瘤的發生發展[16]。我們針對性地研究了 cyclinD1 和 P21 的表達變化，發現兩種蛋白 mRNA 和蛋白水平的變化趨勢與細胞增殖、周期結果一致。我們的研究結果也證實了 ERα 和 ERβ 可能通過調控細胞周期調節相關的蛋白 cyclinD1 和 P21 的表達，進而在子宮內膜癌細胞的增殖過程中發揮著不同的調節作用。
已有的研究表明，雌激素可以誘導子宮內膜癌細胞的增殖，因此我們利用雌二醇對子宮內膜癌細胞株進行刺激，觀察在雌激素刺激的條件下 ERα 和 ERβ 對子宮內膜癌細胞增殖的影響。通過 MTT 和流式細胞術檢測發現，單獨雌激素處理可以顯著促進 Ishikawa 細胞的增殖；在 ERα 干擾的 Ishikawa 細胞中，雌激素的促增殖作用消失；在 ERβ 干擾的 Ishikawa 細胞中，雌激素的促增殖作用則得到一定程度的增強。以上結果說明，在子宮內膜癌細胞的增殖過程中，ERα 和雌二醇可能具有協同促進的作用，而 ERβ 和雌二醇則可能具有一定的拮抗作用。此外，細胞周期調節相關的蛋白 cyclinD1 和 P21 的表達變化也與細胞周期結果一致。
二甲雙胍為 2 型糖尿病的首選治療藥物[17]。近期流行病學與臨床觀察顯示，二甲雙胍可降低多種腫瘤的發病率，有望成為新的腫瘤治療藥物或輔助抗腫瘤藥物[18]。相關機制研究表明，二甲雙胍一方面可以調節腫瘤細胞的葡萄糖代謝和胰島素敏感性，通過磷脂酰肌醇-3-羥激酶相關信號通路對腫瘤產生抑制作用，另一方面二甲雙胍也可以進入腫瘤細胞內，直接活化腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）信號通路，抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡[19]。此外，二甲雙胍也可能作用于免疫系統進行腫瘤抑制[20]。在子宮內膜癌中，二甲雙胍可以抑制子宮內膜癌細胞的增殖并誘導其凋亡[21]。本課題組前期初步研究也發現，二甲雙胍可以顯著下調子宮內膜癌細胞 ERα 的表達而上調 ERβ 的表達，并且可能與 AMPK 信號通路的激活以及雷帕霉素受體蛋白信號通路的抑制有關[8]。然而，目前仍不清楚二甲雙胍對子宮內膜癌細胞增殖的抑制作用是否與 ERα 和 ERβ 直接相關。因此在本研究中，我們進一步研究了二甲雙胍與 ER 兩種因素對子宮內膜癌細胞增殖的綜合影響。我們分別針對 ERα 干擾 Ishikawa 細胞模型和 ERβ 干擾 Ishikawa 細胞模型進行二甲雙胍處理，結果發現單獨二甲雙胍處理可以顯著抑制 Ishikawa 細胞的增殖能力；在 ERα 干擾的 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍抑制增殖的作用消失；在 ERβ 干擾的 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍抑制增殖的作用也消失。以上結果說明，二甲雙胍對子宮內膜癌細胞的抑制作用可能通過 ERα 和 ERβ 介導。
綜上，本研究結果顯示 ERα 和 ERβ 在子宮內膜癌增殖過程中具有不同的生物學功能。ERα 可能促進雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖，ERβ 則可能抑制雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖，因此 ERα 和 ERβ 在子宮內膜癌中表達的比例可能對雌激素誘導細胞增殖具有重要的作用。此外，ERα 和 ERβ 可能通過調節細胞周期調控因子 cyclinD1 和 P21 的表達發揮生物學功能，并且可能介導了二甲雙胍對子宮內膜癌細胞的抑制作用，為二甲雙胍治療子宮內膜癌的臨床應用研究提供了新的理論依據。
子宮內膜癌是我國乃至全球最常見的女性癌癥之一[1-2]。雌激素水平作為子宮內膜癌發生發展的危險因素，通過與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合觸發多種癌基因或抑癌基因的異常轉錄表達，進而促進腫瘤的形成及進展惡化[3]。ER 包括核受體和膜性受體兩大類，ERα 和 ERβ 為研究較為廣泛的雌激素核受體的兩種亞型[4]。研究表明 ERα 和 ERβ 亞型在子宮內膜癌組織中可能具有不同的表達模式，提示 ERα 和 ERβ 在子宮內膜癌中可能具有不同的生物學功能[5]。CyclinD1 和 P21 為細胞周期調控蛋白，其異常表達與子宮內膜癌的發生發展密切相關，相關研究表明，CyclinD1 和 P21 可能作為 ER 在子宮內膜癌中發揮作用的下游靶基因[6]。二甲雙胍是一種常用于治療 2 型糖尿病的降血糖藥物，近年來研究發現二甲雙胍在許多癌癥（包括子宮內膜癌）中具有較好的抗癌作用[7]。本課題組前期研究也證實，二甲雙胍可抑制雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖，并可調節子宮內膜癌中 ERα 和 ERβ 基因的表達[8]。但目前仍不清楚二甲雙胍是否通過調節 ERα 和 ERβ 基因的表達，進而對子宮內膜癌具有抑癌的作用。本研究將通過構建 ERα 和 ERβ 干擾細胞模型，研究 ERα 和 ERβ 對雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖的作用，以及對下游細胞周期調控因子 CyclinD1 和 P21 表達的影響；進而加入二甲雙胍處理因素，研究二甲雙胍抑制子宮內膜癌細胞增殖的作用機制是否由 ERα 和 ERβ 介導。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
人子宮內膜癌細胞系 Ishikawa 細胞購于中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫，胎牛血清、RPMI-1640 細胞培養液購自美國 Gibco 公司，17β 雌二醇、二甲雙胍購自美國 Sigma 公司，Trizol 裂解液、PrimeScript? RT reagent Kit 逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本 Takara 公司，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白測定試劑盒、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑、RNA 酶、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液均購自中國碧云天公司，ERα、ERβ、cyclinD1、P21 及 β-actin 蛋白抗體均購于英國 Abcam 公司。熒光定量用 CFX Connect 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統、蛋白電泳儀、蛋白轉膜儀均購自美國 Bio-Rad 公司。本研究經徐州醫科大學倫理委員會審批通過。
1.2 細胞培養及處理
配制胎牛血清濃度為 10% 的 RPMI-1640 細胞培養液用于培養 Ishikawa 細胞。細胞培養環境為 37℃、5% 二氧化碳。
雌激素處理：配制終濃度為 1×10–6 mol/L 的 17β 雌二醇培養液處理細胞 48 h。
二甲雙胍處理：配制終濃度為 5 mmol/L 的二甲雙胍培養液處理細胞 48 h。
雌二醇聯合短發卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）-ERα 干擾處理，分為 4 組：正常培養液對照+shRNA-NC 處理、雌二醇處理+shRNA-NC 處理、正常培養液對照+shRNA-ERα 干擾處理、雌二醇處理+shRNA-ERα 干擾處理。
雌二醇聯合 shRNA-ERβ 干擾處理，分為 4 組：正常培養液對照+shRNA-NC 處理、雌二醇處理+shRNA-NC 處理、正常培養液對照+shRNA-ERβ 干擾處理、雌二醇處理+shRNA-ERβ 干擾處理。
二甲雙胍聯合 shRNA-ERα 干擾處理，分為 4 組：正常培養液對照+shRNA-NC 處理、二甲雙胍處理+shRNA-NC 處理、正常培養液對照+shRNA-ERα 干擾處理、二甲雙胍處理+shRNA-ERα 干擾處理。
二甲雙胍聯合 shRNA-ERβ 干擾處理，分為 4 組：正常培養液對照+shRNA-NC 處理、二甲雙胍處理+shRNA-NC 處理、正常培養液對照+shRNA-ERβ 干擾處理、二甲雙胍處理+shRNA-ERβ 干擾處理。
1.3 ERα、ERβ 干擾慢病毒載體的構建及轉染
為了獲得干擾 ERα 和 ERβ 的 Ishikawa 細胞，針對 ERα 和 ERβ 基因 mRNA 設計合成干擾序列，并將干擾序列構建到慢病毒載體中形成 shRNA-ERα 慢病毒載體和 shRNA-ERβ 慢病毒載體。干擾序列的合成及慢病毒載體的構建由上海吉瑪公司完成。同時在上海吉瑪公司購買陰性對照 shRNA-NC 慢病毒載體作為實驗對照。對 Ishikawa 細胞分別侵染 shRNA-ERα 慢病毒、shRNA-ERβ 慢病毒或 shRNA-NC 慢病毒。72 h 后驗證 Ishikawa 細胞中 ERα 和 ERβ 的干擾效率。
1.4 總 RNA 提取及實時定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測
利用傳統 Trizol 法提取 Ishikawa 細胞總 RNA，采用紫外分光光度計檢測提取后總 RNA 的濃度和純度后，進行逆轉錄 PCR 合成互補 DNA。逆轉錄 PCR 采用 PrimeScript? RT reagent Kit 逆轉錄試劑盒進行。合成后的互補 DNA 用于后續熒光定量 PCR 檢測。按照 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書進行擴增，記錄相應的 Ct 值，采用 2–△△Ct 分析法分析基因的相對表達量。ERα 和 ERβ 基因引物如下：ERα 上游引物，5′-AGTGCCTTGTTGGATGCTG-3′，ERα 下游引物，5′-TGCCAGGTTGGTCAGTAAGC-3′；ERβ 上游引物，5′-AGTCCCTGGTGTGAAGCAAG-3′，ERβ 下游引物，5′-TGAGCATCCCTCTTTGAACC-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為本實驗中的內參，引物序列如下：GAPDH 上游引物，5′-CAGTCAGCCGCATCTTCTTTT-3′，GAPDH 下游引物，5′-GTGACCAGGCGCCCAATAC-3′。
1.5 蛋白質印跡法
利用放射免疫沉淀裂解液裂解 Ishikawa 細胞總蛋白，并采用 BCA 蛋白測定試劑盒測定各組蛋白濃度。Ishikawa 細胞總蛋白經過高溫變性后，用于后續的蛋白電泳及轉膜，各組蛋白上樣量為 60 μg，采用 10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠進行電泳。蛋白轉印到聚偏二氟乙烯膜后，采用 5% 脫脂奶粉封閉 1 h，隨后在 4℃ 環境中進行一抗抗體過夜孵育。ERα、ERβ、cyclinD1 及 P21 蛋白抗體進行 1∶1 000 稀釋，內參 β-actin 抗體進行 1∶10 000 稀釋。一抗孵育后進行洗膜并在室溫中孵育二抗 1 h，洗膜后進行曝光檢測。
1.6 MTT 法檢測細胞增殖
取對數生長期 Ishikawa 細胞，按每孔 1×104個細胞接種于 96 孔板，每孔 200 μL，5% 二氧化碳、37℃ 培養箱培養約 24 h 至細胞貼壁。培養 48 h 后，每孔加入濃度為 5 mg/mL 的 MTT 20 μL 繼續培養 4 h，吸棄上清液，每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，平板搖床搖勻 10 min，置酶標儀于 490 nm 波長處檢測每孔的吸光度值（A490 nm），根據各組細胞吸光度值反映細胞增殖狀況。實驗重復 3 次，每組 6 個復孔。
1.7 流式細胞儀檢測細胞周期
將不同組細胞用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化 1～3 min，收集細胞后用磷酸鹽緩沖液清洗細胞 2 遍。加入 1 mL –20℃ 預冷的乙醇，輕輕吹散細胞后 4℃ 過夜。磷酸鹽緩沖液清洗后加入 100 μL RNA 酶 37℃ 水浴孵育 30 min。隨后加入 500 μL PI 染液 4℃ 避光孵育 30 min。最后利用流式細胞儀檢測各組細胞中 G1、S、G2 期細胞比例，觀察各組細胞周期的變化。實驗重復 3 次，每組 3 個復孔。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件進行統計分析。計量資料組間比較采用方差分析，隨后采用 LSD 法進行兩兩比較。檢驗水準 α=0.05。采用 Graphpad Prism 軟件繪制統計圖。
2 結果
2.1 Ishikawa 細胞中 ERα、ERβ 干擾慢病毒載體的構建及鑒定
將 ERα、ERβ 干擾慢病毒載體分別感染 Ishikawa 細胞，感染 72 h 后，提取 Ishikawa 細胞總 RNA 及總蛋白檢測 ERα、ERβ 基因 mRNA 及蛋白表達水平的變化。qRT-PCR 結果顯示，Ishikawa 細胞感染 ERα 干擾慢病毒載體后，ERα 基因 mRNA 表達水平與對照組相比下調 76%，差異有統計學意義（P<0.05）；Ishikawa 細胞感染 ERβ 干擾慢病毒載體后，ERβ 基因 mRNA 表達水平與對照組相比下調 67%，差異也有統計學意義（P<0.05）。此外，蛋白質印跡法結果顯示，在 Ishikawa 細胞感染 ERα、ERβ 干擾慢病毒載體后，ERα 和 ERβ 蛋白表達水平均受到明顯下調。以上 qRT-PCR 及蛋白質印跡法結果提示，ERα、ERβ 干擾慢病毒載體在 Ishikawa 細胞中均具有較好的干擾效果。見圖 1。
圖1
ERα、ERβ 慢病毒干擾載體在 Ishikawa 細胞中干擾效果驗證
shRNA-NC 表示陰性對照 shRNA，shRNA-ERα 表示針對 ERα 的 shRNA，shRNA-ERβ 表示針對 ERβ 的 shRNA；**表示
2.2 ERα 干擾對雌二醇誘導的 Ishikawa 細胞增殖和周期的影響
利用 MTT 法檢測雌二醇聯合 shRNA-ERα 干擾處理對 Ishikawa 細胞增殖能力的影響。3 d 內的生存曲線顯示，單獨雌二醇處理可以促進 Ishikawa 細胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；單獨干擾 ERα 抑制 Ishikawa 細胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；干擾 ERα 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERα 能抵消雌二醇促增殖的作用（P>0.05）。見圖 2a。
圖2
ERα 干擾對 Ishikawa 細胞增殖和周期的影響
shRNA-NC 表示陰性對照 shRNA，shRNA-ERα 表示針對 ERα 的 shRNA，E2 表示雌二醇處理；*表示
利用流式細胞儀檢測以上 4 組處理中的細胞周期，結果發現，單獨雌二醇處理導致 Ishikawa 細胞 G1 期細胞比例減少，S 期細胞比例增多（P<0.05），說明細胞周期加快；單獨干擾 ERα 基因后，G1 期細胞比例增多，S 期細胞比例減少（P<0.05），說明細胞周期阻滯；干擾 ERα 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERα 能抵消雌二醇對細胞周期的促進作用（P>0.05）。見圖 2b。
此外，我們還檢測了雌二醇聯合 shRNA-ERα 干擾處理對 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影響。結果顯示，單獨雌二醇處理可以促進 Ishikawa 細胞 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表達，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表達（P<0.05）；單獨干擾 ERα 抑制 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表達，促進 P21 基因 mRNA 和蛋白的表達（P<0.05）；干擾 ERα 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERα 能抵消雌二醇對 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影響（P>0.05）。見圖 2c、2d。
2.3 ERβ 干擾對雌二醇誘導的 Ishikawa 細胞增殖和周期的影響
利用 MTT 法檢測雌二醇聯合 shRNA-ERβ 干擾處理對 Ishikawa 細胞增殖能力的影響。3 d 內的生存曲線顯示，單獨雌二醇處理可以促進 Ishikawa 細胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；單獨干擾 ERβ 也促進 Ishikawa 細胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；干擾 ERβ 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERβ 能增強雌二醇促增殖的作用（P<0.05）。見圖 3a。
圖3
ERβ 干擾對 Ishikawa 細胞增殖和周期的影響
shRNA-NC 表示陰性對照 shRNA，shRNA-ERβ 表示針對 ERβ 的 shRNA，E2 表示雌二醇處理；*表示
利用流式細胞儀檢測以上 4 組處理中的細胞周期，結果發現，單獨雌二醇處理導致 Ishikawa 細胞 G1 期細胞比例減少，S 期細胞比例增多（P<0.05），說明細胞周期加快；單獨干擾 ERβ 基因后，也出現 G1 期細胞比例減少，S 期細胞比例增多（P<0.05），說明細胞周期同樣得到促進；干擾 ERβ 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERβ 能增強雌二醇對細胞周期的促進作用（P<0.05）。見圖 3b。
此外，我們還檢測了雌二醇聯合 shRNA-ERβ 干擾處理對 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影響。結果顯示，單獨雌二醇處理可以促進 Ishikawa 細胞 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表達，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表達（P<0.05）；單獨干擾 ERβ 促進 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表達，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表達（P<0.05）；干擾 ERβ 的同時進行雌二醇處理發現，干擾 ERβ 能增強雌二醇對 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影響（P<0.05）。見圖 3c、3d。
2.4 ERα 干擾對二甲雙胍抑制 Ishikawa 細胞增殖的影響
在相同雌激素處理的條件下，分別在二甲雙胍處理 0 h 和 48 h 兩個時相點，利用 MTT 法檢測二甲雙胍聯合 shRNA-ERα 干擾處理條件下 Ishikawa 細胞的增殖情況。結果發現，二甲雙胍處理 0 h 各組 Ishikawa 細胞增殖情況一致，說明在二甲雙胍處理前各組細胞處于同一增殖水平。二甲雙胍處理 48 h 后，在陰性對照 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍抑制了雌激素誘導的 Ishikawa 細胞增殖（P<0.05）；而在干擾 ERα 基因的 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍對 Ishikawa 細胞增殖的抑制作用消失（P>0.05）。見圖 4a。
圖4
ERα、ERβ干擾對二甲雙胍抑制雌激素誘導的 Ishikawa 細胞增殖的影響
4 組細胞均在相同的雌激素處理條件下進行；shRNA-NC 表示陰性對照 shRNA，shRNA-ERα 表示針對 ERα 的 shRNA，shRNA-ERβ 表示針對 ERβ 的 shRNA，control 表示空白藥物對照，Met 表示二甲雙胍藥物處理；*表示
2.5 ERβ 對二甲雙胍抑制 Ishikawa 細胞增殖的影響
分別在二甲雙胍處理 0 h 和 48 h 兩個時相點，利用 MTT 法檢測二甲雙胍聯合 shRNA-ERβ 干擾處理條件下 Ishikawa 細胞的增殖情況。結果發現，在相同雌激素處理情況下，二甲雙胍處理 0 h 各組 Ishikawa 細胞增殖處于同一基線水平。二甲雙胍處理 48 h 后，在陰性對照 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍抑制了 Ishikawa 細胞的增殖（P<0.05）；而在干擾 ERβ 基因的 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍對 Ishikawa 細胞增殖的抑制作用消失（P>0.05）。見圖 4b。
3 討論
子宮內膜癌是雌激素依賴性的婦科惡性腫瘤，雌激素水平與子宮內膜癌的發生發展密切相關[9]。雌二醇是生物學效應最強、體內含量最豐富的雌激素；ER 是核受體超家族的成員之一，雌二醇與 ER 的配體結合域結合后，激活 ER 入核，并作用于靶基因上游啟動子區域的雌激素反應元件，誘導下游基因轉錄[10]。ER 具有 2 種亞型（ERα 和 ERβ），分別由不同的基因編碼，盡管 ERα 和 ERβ 具有相似的蛋白結構，但最近的研究發現，ERα 和 ERβ 具有不同的信號轉導途徑，發揮不同甚至相反的生物學活性[11]。在細胞功能上，ERα 和 ERβ 也可能介導不同的生物學效應，ERα 主要介導上皮細胞的分化和增殖，ERβ 則主要介導細胞的凋亡反應[12]。在表達模式上，在 ERα 和 ERβ 共存的乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜腫瘤發展惡化過程中，ERβ 表達逐漸降低而 ERα 表達則增加[13-14]。由此可見，ERα 和 ERβ 兩種亞型表達失衡可能是激素依賴性腫瘤如子宮內膜癌發生的一個關鍵步驟，提示 ERα 和 ERβ 可能在子宮內膜癌發生發展過程中具有不同的生物學功能，因此有必要深入研究 ERα 和 ERβ 在雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖中的作用。
本研究利用慢病毒載體分別構建了 ERα 干擾 Ishikawa 細胞模型和 ERβ 干擾 Ishikawa 細胞模型。在無雌激素刺激的情況下，通過 MTT 實驗發現干擾 ERα 的表達可以抑制 Ishikawa 細胞的增殖，與之相反干擾 ERβ 的表達則可以促進 Ishikawa 細胞的增殖。此外，通過流式細胞術檢測發現，干擾 ERα 的表達可以阻滯 Ishikawa 細胞周期，干擾 ERβ 的表達則可以促進 Ishikawa 細胞周期從 G1 期進入 S 期。CyclinD1 為目前公認的癌基因，可以驅動細胞由 G1 期進入 S 期進而促進細胞增殖[15]。P21 蛋白功能與之相反，通過抑制 cyclinD1-CDK4 和 cyclinE-CDK2 的活性，使細胞周期停滯在 G1 期，從而抑制腫瘤的發生發展[16]。我們針對性地研究了 cyclinD1 和 P21 的表達變化，發現兩種蛋白 mRNA 和蛋白水平的變化趨勢與細胞增殖、周期結果一致。我們的研究結果也證實了 ERα 和 ERβ 可能通過調控細胞周期調節相關的蛋白 cyclinD1 和 P21 的表達，進而在子宮內膜癌細胞的增殖過程中發揮著不同的調節作用。
已有的研究表明，雌激素可以誘導子宮內膜癌細胞的增殖，因此我們利用雌二醇對子宮內膜癌細胞株進行刺激，觀察在雌激素刺激的條件下 ERα 和 ERβ 對子宮內膜癌細胞增殖的影響。通過 MTT 和流式細胞術檢測發現，單獨雌激素處理可以顯著促進 Ishikawa 細胞的增殖；在 ERα 干擾的 Ishikawa 細胞中，雌激素的促增殖作用消失；在 ERβ 干擾的 Ishikawa 細胞中，雌激素的促增殖作用則得到一定程度的增強。以上結果說明，在子宮內膜癌細胞的增殖過程中，ERα 和雌二醇可能具有協同促進的作用，而 ERβ 和雌二醇則可能具有一定的拮抗作用。此外，細胞周期調節相關的蛋白 cyclinD1 和 P21 的表達變化也與細胞周期結果一致。
二甲雙胍為 2 型糖尿病的首選治療藥物[17]。近期流行病學與臨床觀察顯示，二甲雙胍可降低多種腫瘤的發病率，有望成為新的腫瘤治療藥物或輔助抗腫瘤藥物[18]。相關機制研究表明，二甲雙胍一方面可以調節腫瘤細胞的葡萄糖代謝和胰島素敏感性，通過磷脂酰肌醇-3-羥激酶相關信號通路對腫瘤產生抑制作用，另一方面二甲雙胍也可以進入腫瘤細胞內，直接活化腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）信號通路，抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡[19]。此外，二甲雙胍也可能作用于免疫系統進行腫瘤抑制[20]。在子宮內膜癌中，二甲雙胍可以抑制子宮內膜癌細胞的增殖并誘導其凋亡[21]。本課題組前期初步研究也發現，二甲雙胍可以顯著下調子宮內膜癌細胞 ERα 的表達而上調 ERβ 的表達，并且可能與 AMPK 信號通路的激活以及雷帕霉素受體蛋白信號通路的抑制有關[8]。然而，目前仍不清楚二甲雙胍對子宮內膜癌細胞增殖的抑制作用是否與 ERα 和 ERβ 直接相關。因此在本研究中，我們進一步研究了二甲雙胍與 ER 兩種因素對子宮內膜癌細胞增殖的綜合影響。我們分別針對 ERα 干擾 Ishikawa 細胞模型和 ERβ 干擾 Ishikawa 細胞模型進行二甲雙胍處理，結果發現單獨二甲雙胍處理可以顯著抑制 Ishikawa 細胞的增殖能力；在 ERα 干擾的 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍抑制增殖的作用消失；在 ERβ 干擾的 Ishikawa 細胞中，二甲雙胍抑制增殖的作用也消失。以上結果說明，二甲雙胍對子宮內膜癌細胞的抑制作用可能通過 ERα 和 ERβ 介導。
綜上，本研究結果顯示 ERα 和 ERβ 在子宮內膜癌增殖過程中具有不同的生物學功能。ERα 可能促進雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖，ERβ 則可能抑制雌激素誘導的子宮內膜癌細胞增殖，因此 ERα 和 ERβ 在子宮內膜癌中表達的比例可能對雌激素誘導細胞增殖具有重要的作用。此外，ERα 和 ERβ 可能通過調節細胞周期調控因子 cyclinD1 和 P21 的表達發揮生物學功能，并且可能介導了二甲雙胍對子宮內膜癌細胞的抑制作用，為二甲雙胍治療子宮內膜癌的臨床應用研究提供了新的理論依據。
