引用本文： 錢新宇, 楊思遠, BilalMuhammad, 杜波, 耿德勤. 溶栓后中性粒細胞升高與缺血性腦卒中早期神經功能惡化相關性研究. 華西醫學, 2019, 34(6): 641-648. doi: 10.7507/1002-0179.201901147 復制
腦卒中是中國居民死亡或致殘的首要病因，其中缺血性腦卒中約占 80%。目前國內外均推薦在發病 4.5 h 內進行阿替普酶靜脈溶栓為治療急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）的首選方法[1-2]。即使嚴格遵循靜脈溶栓指南適應證及禁忌證，早期神經功能惡化（early neurological deterioration，END）、神經炎癥及中性粒細胞浸潤等溶栓并發癥的發生仍無法避免[3]，使阿替普酶靜脈溶栓的獲益率下降。
腦缺血發病機制復雜，從最初的腦血流中斷引起相應部位腦組織細胞死亡，到缺血后期腦組織的修復過程，均有炎癥應答參與。大量研究的方向則集中于白細胞積聚[4]、膠質細胞活化和 C 反應蛋白升高對神經炎癥或神經形成等方面的影響。但 AIS 患者白細胞分類計數與靜脈溶栓 END 的臨床研究較少。比如中性粒細胞對腦損傷有種特殊的免疫應答，并且參與神經生長、血管生成及神經重塑等過程，這些都潛在影響了腦卒中的預后[5]。因此本研究對中性粒細胞計數及相關炎性指標在靜脈溶栓治療 AIS 患者中的變化進行了回顧性分析，探討中性粒細胞在缺血性腦卒中靜脈溶栓的預后作用，可能會揭示一些新的見解，以提高阿替普酶靜脈溶栓的療效。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集 2017 年 1 月—2018 年 11 月在徐州醫科大學附屬醫院收治的發病 4.5 h 以內接受阿替普酶靜脈溶栓治療的 AIS 患者。納入標準：① 臨床診斷為缺血性腦卒中，且發病 4.5 h 內接受阿替普酶靜脈溶栓治療[2]；② 溶栓前經頭顱 CT 明確無出血，并了解溶栓治療，簽署知情同意書；③ 全程接受指南推薦的規范治療[2]。排除標準：① 符合《中國急性缺血性腦卒中指南診治指南 2014》靜脈溶栓排除標準[2]；② 住院前存在活動性感染或溶栓后存在感染證據、癌癥、慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病或激素治療；③ 既往有缺血性腦卒中且遺留嚴重后遺癥；④ 動脈溶栓或介入治療的患者。本研究經徐州醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會審批通過（XYFY2018-KL038-01）。
1.2 研究方法
1.2.1 END 診斷標準及分組
靜脈溶栓后 END 診斷方法：具體定義暫未統一，本文采用靜脈溶栓后 72 h 內美國國立衛生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評分較入院時增加≥4 分或死亡作為溶栓后 END 發生的定義[6]。根據患者是否出現 END，將其分為 END 組和非 END 組。
1.2.2 觀察指標
① 臨床資料：年齡、性別、既往史［高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）、既往卒中史、心房顫動（房顫）和吸煙史］，以及發病至用藥時間（onset to start of treatment，OTT）、入院至用藥時間（door to needle time，DNT）、基線血糖水平；入院時格拉斯哥昏迷評分，入院時（基線）NIHSS 評分，溶栓后 72 h 內病情變化最明顯時 NIHSS 評分。
② 實驗室及影像學結果。溶栓前急查：總蛋白、白蛋白、尿酸、白細胞、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、血紅蛋白、紅細胞比容、血小板分布寬度、紅細胞分布寬度、血小板計數、纖維蛋白原、國際標準化比值、纖維蛋白（原）降解產物等。溶栓后空腹采血：總蛋白、白蛋白、前白蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、胱抑素 C、尿酸、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、血紅蛋白、紅細胞比容、血小板分布寬度、紅細胞分布寬度、血小板計數、纖維蛋白原、國際標準化比值、纖維蛋白（原）降解產物、同型半胱氨酸、糖化血紅蛋白等。
溶栓后完成頭顱 MRI 檢查：記錄梗死部位；入院后 3 d 內完成頭頸部 CT 血管成像/磁共振血管成像檢查：記錄責任血管狹窄程度；早期完善心臟彩色多普勒超聲（彩超）、心電圖、胸部 CT、頸部血管彩超以及其他化驗檢查，分析病因判斷 TOAST 分型。
1.2.3 評價標準
溶栓后根據癥狀體征及輔助檢查，進一步明確以下方面：① TOAST 分型：大動脈粥樣硬化性卒中、心源性腦卒中、小動脈閉塞性卒中、其他病因或病因不明性卒中。② 梗死部位：前循環皮質梗死：主要位于大腦中動脈或大腦前動脈皮質支分布區，可表現為大腦中動脈主干或者皮質支閉塞，也可表現為大腦中動脈前、后交界區（即分水嶺）梗死或者單獨的大腦前動脈分布區梗死。基底節區梗死：病灶位于前循環穿支動脈分布區。放射冠梗死：位于大腦中動脈皮質支以及穿動脈分布區交界區，即內交界區的梗死，主要位于放射冠區。后循環梗死：指的是椎基底動脈分布區，包括枕葉皮質丘腦、腦干等區域。③ 頭頸部責任血管狹窄分級標準采用北美癥狀性頸動脈內膜切除術分級法標準[7]：輕度狹窄≤29%，中度狹窄為 30%～69%，重度狹窄≥70%，閉塞即狹窄處及其遠端不顯影。④ END 終點事件[8]。A. 癥狀性出血界定為由于腦出血占位效應引起 NIHSS 評分增加≥4 分。B. 惡性腦水腫界定為最初的缺血性腦卒中病灶在除外出血時出現明顯占位效應，導致 NIHSS 評分增加≥4 分。C. 早期復發缺血性腦卒中界定為最初的缺血性腦卒中病灶擴大或者新出現其他的缺血性腦卒中病灶導致的 NIHSS 評分增加≥4 分。D. 早期癇性發作：因血管重通再灌增加氧自由基數量觸發癲癇發生，且患者往往預后不良。癲癇發作只引起短暫病情加重，但也歸為 END 的終點事件之一；非抽搐性癲癇發作也可導致病情惡化。如果存在以上兩種原因導致 NIHSS 評分增加，選擇最可能導致癥狀加重的原因作為主要的 END 分型。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 20.0 統計學軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，非正態分布計量資料采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較采用 t 檢驗或非參數檢驗；計數資料采用例數和百分比表示，組間比較采用 χ2 檢驗或秩和檢驗。采用配對樣本 t 檢驗或 Wilcoxon 符號秩檢驗比較溶栓前及溶栓后中性粒細胞、淋巴細胞變化。多因素回歸分析以單因素分析中溶栓后相關指標 P<0.20[9]的變量為自變量，采取 logistic 向后逐步剔除 LR 法進行多因素分析，計算比值比（odds ratio，OR）和 95% 置信區間（confidence interval，CI）。使用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線比較中性粒細胞、中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）對靜脈溶栓后不良預后的預測價值，計算最佳界值及靈敏度、特異度。檢驗水準 a=0.05。
2 結果
2.1 兩組患者基線資料比較
共搜集 4.5 h 內阿替普酶靜脈溶栓患者 266 例。為避免相關混雜因素的影響，排除橋接血管內治療者 36 例，溶栓過程中停止者 9 例，既往改良 Rankin 量表（Modified Rankin Scale，MRS）評分≥3 分者 4 例，肝腎功能重度異常、重度感染惡性腫瘤及基礎情況差者 13 例，診斷不明確者 5 例，此外排除資料不完整者 12 例，最終納入研究患者 187 例。
納入患者溶栓后 72 h，發生 END 48 例，其中，出血轉化 13 例，早期復發性缺血性腦卒中 21 例，惡性腦水腫 11 例，早期癇性發作 3 例；非 END 139 例。END 組患者年齡、有房顫史者比例均高于非 END 組，差異有統計學意義（P<0.05）；而在性別、高血壓、糖尿病、冠心病、既往卒中病史及吸煙史等方面比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
兩組患者基線資料比較
2.2 兩組患者臨床資料比較
溶栓前，兩組患者除總蛋白（t=2.130，P=0.035）、白蛋白（t=2.777，P=0.007）外，其余指標比較差異均無統計學意義（P>0.05）。溶栓后，白細胞計數、中性粒細胞計數、NLR、纖維蛋白酶降解產物、基線和變化 NIHSS 評分、心源性腦卒中、責任血管狹窄程度及前循環皮質梗死部位，END 組均高于非 END 組（P<0.05）；而總蛋白、白蛋白、淋巴細胞計數、前白蛋白 END 組低于非 END 組（P<0.05）。見表 2～4。
表2
溶栓前兩組患者實驗室檢查比較
表3
溶栓后兩組患者實驗室檢查比較
表4
兩組入院情況/病因學分型/影像學檢查比較
此外，在溶栓前后，END 組中性粒細胞計數增加明顯（Z=?2.314，P=0.021），而非 END 組中性粒細胞增加不明顯（Z=?0.787，P=0.431）；END 組淋巴細胞計數下降明顯（Z=?2.109，P=0.035），而 非 END 組淋巴細胞計數變化不明顯（Z=?1.921，P=0.055）；END 組（Z=?1.767，P=0.077）及非 END 組（Z=?0.342，P=0.732）溶栓前后 NLR 變化無統計學意義。
2.3 多因素 logistic 回歸分析
以是否發生靜脈溶栓 END 為因變量（y：非 END 組=0，END 組=1），以單變量分析中 P<0.20 的因素為自變量，進行變量賦值后，納入模型 187 例患者進行回歸分析。二分類 logistic 回歸分析顯示，中性粒細胞計數［OR=1.288，95%CI（1.069，1.552）］，血清白蛋白水平［OR=0.851，95%CI（0.753，0.963）］、基線 NIHSS 評分［OR=1.126，95% CI（1.027，1.234）］、心源性腦卒中［OR=1.746，95%CI（1.036，2.944）］、責任血管狹窄程度［OR=2.137，95%CI（1.278，3.573）］為靜脈溶栓 END 的獨立影響因素。具體賦值及結果見表 5、6。
表5
變量賦值表
表6
多因素 logistic 回歸分析阿替普酶靜脈溶栓后發生 END 的影響因素
2.4 溶栓后中性粒細胞對患者的 END 預測價值
計算基線中性粒細胞計數、基線 NLR、溶栓后中性粒細胞計數、溶栓后 NLR 行 ROC 分析，溶栓后中性粒細胞預測 END 曲線下面積為 0.697［95%CI（0.607，0.787）］，最大約登指數為 0.344，最佳預測值為 6.02×109/L，此時預測的靈敏度為 62.5%，特異度為 71.9%。溶栓后 NLR、基線中性粒細胞計數、基線 NLR 曲線下面積分別為 0.708、0.610、0.589。靜脈溶栓后中性粒細胞計數預測 END 的特異度最高。見表 7、圖 1。
表7
各因素對 AIS 溶栓患者預測的 ROC 曲線下面積
圖1
各危險因素預測 AIS 溶栓患者預后的 ROC 曲線
3 討論
越來越多的研究和臨床證據表明，炎癥作為一種經典的分子機制[10-11]，在血管事件的發生和預后的惡化中起主要作用。中性粒細胞作為白細胞的主要成分和炎癥的主要決定因素，目前已成為預測血管疾病患者預后的焦點。有關 AIS 靜脈溶栓后發生 END，中性粒細胞計數的臨床預測作用在國內外報道不多，本研究通過回顧性研究證明了溶栓后中性粒細胞升高與 END 的發生有一定相關性。Kim 等[12]通過對 779 例首發的 AIS 患者回顧性研究得出，較高的白細胞總數及較高的中性粒細胞計數與發生嚴重 AIS 相關，而較低的淋巴細胞計數與較高的腦卒中嚴重性增長（入院 1 周內 NIHSS 評分與入院時 NIHSS 評分之差）及較差的功能預后（出院 3 個月 mRS >2 分）相關。還有研究通過探討外周血早期白細胞及其亞型與 AIS 發生、發展的關系得出：白細胞計數和中性粒細胞計數升高是 AIS 的獨立危險因素[13]。
我們發現入院時（發病后 4.5 h 內）中性粒細胞或淋巴細胞的計數與卒中結局無顯著相關性。然而，在靜脈溶栓后 24 h 內中性粒細胞計數顯著增加。中性粒細胞的動態增加有效地預測了 END 的發生，獨立于傳統的風險因素比如入院時 NIHSS 評分以及責任血管的狹窄程度等。根據本研究結果，監測阿替普酶溶栓后血液中的中性粒細胞計數可能有助于神經科醫師預測不良預后，因此可能為預防神經功能的進一步惡化以及改善預后而更積極的進行個性化治療。本研究還使用 ROC 曲線繪制曲線下面積，比較了基線與溶栓后早期中性粒細胞計數及 NLR 值對 END 的預測價值，溶栓后中性粒細胞及 NLR 曲線下面積大于基線，且特異性更高，說明溶栓后中性粒細胞及 NLR 可能對 END 的發生具有更高的預測價值。AIS 發生時腦缺血缺氧導致神經元細胞壞死及活性氧自由基產生，促使炎性細胞大量激活，炎癥介質釋放入血，觸發一系列炎癥級聯反應，但外周血免疫細胞開始向受損腦組織浸潤的時間卻存在爭議。Akopov 等[14]發現，在 AIS 發生后 3～6 h 可觀察到中性粒細胞開始浸潤，在發病后 12～24 h 達到高峰，且中性粒細胞被認為是第一個遷移到受損腦組織的外周免疫細胞。該研究還表明這種積累程度嚴重則對應腦組織損傷的嚴重和預后較差。而外周血淋巴細胞減低是 AIS 誘導的“免疫功能抑制綜合征”的表現之一，并與患者預后相關。本研究對比溶栓前后炎性細胞均數發現，溶栓后的白細胞、中性粒細胞均升高，淋巴細胞降低較溶栓前變化明顯，符合上述研究結論中性粒細胞在 12 h 后達高峰，且惡化組中性粒細胞計數積累程度越重，故而腦組織損傷嚴重，發生 END，且預后較差。其他文獻也對白細胞分類計數在時間點上的變化與卒中預后的關系上進行了探討。Shi 等[15]發現卒中后中性粒細胞的動態增加可顯著預測 AIS 患者接受阿替普酶治療 3 個月的死亡或致殘結局。
中性粒細胞計數與 AIS 靜脈溶栓預后的病理機制尚不明確。缺血性腦卒中后引發的炎癥反應特點是白細胞被激活，繼而遷移腦組織，病理表現為缺血性腦卒中患者外周血白細胞計數增高及浸潤局部腦組織，其中以中性粒細胞升高明顯。中性粒細胞可以釋放活性氧、細胞因子及趨化因子[16]，啟動隨后的炎癥/免疫細胞的遷移，這些有害分子可加重梗死生長并導致癥狀惡化。同時，中性粒細胞通過多種途徑促進血栓形成，包括釋放負責中性粒細胞胞外陷阱（neutrophilextracellular traps，NET）形成，以及與血小板的直接相互作用[17]。既往研究發現，急性 ST 段抬高性心肌梗死時，斑塊破裂處可釋放活化的組織因子并且多形核中性粒細胞誘導的 NET 釋放能夠與凝血酶活化的血小板相互作用，損傷血管內皮細胞導致血漿外滲，使內皮細胞損傷暴露于內皮下膜，觸發血小板的凝聚及凝血酶的進一步活化，導致血管內血栓形成。NET 生成過程中可釋放多種殺菌物質來清除病原微生物，其中一級顆粒包括中性粒細胞彈性蛋白酶等；二級顆粒包括抑菌肽 LL-37 等；三級顆粒包括均屬蛋白酶基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9 等，MMP 活性增加可短暫或持續性破壞血腦屏障處的緊密連接蛋白及基膜蛋白，血腦屏障滲透性增加甚至破壞，這將惡化缺血性腦卒中病情，導致顱內出血轉化的風險增加[18]。
除了中性粒細胞外，我們還檢測了淋巴細胞和 NLR，這也是廣泛研究的卒中預后預測指標。NLR 水平相對穩定，主要與機體炎癥反應相關。NLR 為中性粒細胞計數和淋巴細胞計數相比所得，故而整合了兩種白細胞亞型的預測信息，中性粒細胞計數升高或者淋巴細胞計數降低都可導致 NLR 的升高。Maestrini 等[3]研究表明，除了升高的中性粒細胞計數，NLR 能夠預測癥狀性顱內出血轉化和 3 個月時不良預后。Guo 等[19]探討腦卒中患者靜脈溶栓血漿 NLR 的時間分布及其與溶栓后顱內出血并發癥的關系后得出：NLR 是一個動態變量，其變化與急性卒中患者接受靜脈阿替普酶治療后顱內出血有關。且 NLR 的最佳識別值為治療后 12～18 h。本研究得出惡化組的 NLR 均高于非惡化組，差異有統計學意義，但隨時間變化不顯著，且獨立影響效應不明顯。溶栓后患者的淋巴細胞有下降的趨勢，這可能與淋巴細胞可分泌抗炎因子、減輕機體對缺血部位的免疫反應有關。病情的加重導致具有保護、抗炎作用的淋巴細胞數量減少更明顯。
目前國內外靜脈溶栓 END 的相關研究不多，且大都關注于基線 NIHSS 評分、心源性腦卒中、血糖、血壓等因素造成的影響。本研究在驗證以上影響因素的同時，著眼于臨床中最常見且最易獲得的實驗室檢查等因素，發現動態監測中性粒細胞計數同樣可預測靜脈溶栓后 END 的發生，中性粒細胞計數高的靜脈溶栓患者發生 END 可能性大。但本研究存在一定局限性。本研究為溶栓前和溶栓后 24 h 內的血液樣本，并未規定具體時間節點，而中性粒細胞和淋巴細胞計數在缺血性腦卒中后隨時間變化不一致，這也可能是本研究中 NLR 對不良預后預測價值與既往文獻結果不一致的原因。另外，中性粒細胞與淋巴細胞變化的原因為缺血缺氧后的應激反應還是隱匿感染在本研究中未闡明。同時，本文還需進一步驗證未進行靜脈溶栓患者發生 END 時中性粒細胞計數、淋巴細胞計數及 INR 的變化情況。本研究為單中心、小樣本回顧性研究，存在選擇偏倚，還需擴大樣本量進一步證實。
綜上，溶栓后中性粒細胞升高與 END 的發生有一定相關性。動態監測靜脈溶栓治療后的中性粒細胞可有助于預測 END 的發生，以早期診斷并采取積極治療改善預后。
腦卒中是中國居民死亡或致殘的首要病因，其中缺血性腦卒中約占 80%。目前國內外均推薦在發病 4.5 h 內進行阿替普酶靜脈溶栓為治療急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）的首選方法[1-2]。即使嚴格遵循靜脈溶栓指南適應證及禁忌證，早期神經功能惡化（early neurological deterioration，END）、神經炎癥及中性粒細胞浸潤等溶栓并發癥的發生仍無法避免[3]，使阿替普酶靜脈溶栓的獲益率下降。
腦缺血發病機制復雜，從最初的腦血流中斷引起相應部位腦組織細胞死亡，到缺血后期腦組織的修復過程，均有炎癥應答參與。大量研究的方向則集中于白細胞積聚[4]、膠質細胞活化和 C 反應蛋白升高對神經炎癥或神經形成等方面的影響。但 AIS 患者白細胞分類計數與靜脈溶栓 END 的臨床研究較少。比如中性粒細胞對腦損傷有種特殊的免疫應答，并且參與神經生長、血管生成及神經重塑等過程，這些都潛在影響了腦卒中的預后[5]。因此本研究對中性粒細胞計數及相關炎性指標在靜脈溶栓治療 AIS 患者中的變化進行了回顧性分析，探討中性粒細胞在缺血性腦卒中靜脈溶栓的預后作用，可能會揭示一些新的見解，以提高阿替普酶靜脈溶栓的療效。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集 2017 年 1 月—2018 年 11 月在徐州醫科大學附屬醫院收治的發病 4.5 h 以內接受阿替普酶靜脈溶栓治療的 AIS 患者。納入標準：① 臨床診斷為缺血性腦卒中，且發病 4.5 h 內接受阿替普酶靜脈溶栓治療[2]；② 溶栓前經頭顱 CT 明確無出血，并了解溶栓治療，簽署知情同意書；③ 全程接受指南推薦的規范治療[2]。排除標準：① 符合《中國急性缺血性腦卒中指南診治指南 2014》靜脈溶栓排除標準[2]；② 住院前存在活動性感染或溶栓后存在感染證據、癌癥、慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病或激素治療；③ 既往有缺血性腦卒中且遺留嚴重后遺癥；④ 動脈溶栓或介入治療的患者。本研究經徐州醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會審批通過（XYFY2018-KL038-01）。
1.2 研究方法
1.2.1 END 診斷標準及分組
靜脈溶栓后 END 診斷方法：具體定義暫未統一，本文采用靜脈溶栓后 72 h 內美國國立衛生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評分較入院時增加≥4 分或死亡作為溶栓后 END 發生的定義[6]。根據患者是否出現 END，將其分為 END 組和非 END 組。
1.2.2 觀察指標
① 臨床資料：年齡、性別、既往史［高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）、既往卒中史、心房顫動（房顫）和吸煙史］，以及發病至用藥時間（onset to start of treatment，OTT）、入院至用藥時間（door to needle time，DNT）、基線血糖水平；入院時格拉斯哥昏迷評分，入院時（基線）NIHSS 評分，溶栓后 72 h 內病情變化最明顯時 NIHSS 評分。
② 實驗室及影像學結果。溶栓前急查：總蛋白、白蛋白、尿酸、白細胞、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、血紅蛋白、紅細胞比容、血小板分布寬度、紅細胞分布寬度、血小板計數、纖維蛋白原、國際標準化比值、纖維蛋白（原）降解產物等。溶栓后空腹采血：總蛋白、白蛋白、前白蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、胱抑素 C、尿酸、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、血紅蛋白、紅細胞比容、血小板分布寬度、紅細胞分布寬度、血小板計數、纖維蛋白原、國際標準化比值、纖維蛋白（原）降解產物、同型半胱氨酸、糖化血紅蛋白等。
溶栓后完成頭顱 MRI 檢查：記錄梗死部位；入院后 3 d 內完成頭頸部 CT 血管成像/磁共振血管成像檢查：記錄責任血管狹窄程度；早期完善心臟彩色多普勒超聲（彩超）、心電圖、胸部 CT、頸部血管彩超以及其他化驗檢查，分析病因判斷 TOAST 分型。
1.2.3 評價標準
溶栓后根據癥狀體征及輔助檢查，進一步明確以下方面：① TOAST 分型：大動脈粥樣硬化性卒中、心源性腦卒中、小動脈閉塞性卒中、其他病因或病因不明性卒中。② 梗死部位：前循環皮質梗死：主要位于大腦中動脈或大腦前動脈皮質支分布區，可表現為大腦中動脈主干或者皮質支閉塞，也可表現為大腦中動脈前、后交界區（即分水嶺）梗死或者單獨的大腦前動脈分布區梗死。基底節區梗死：病灶位于前循環穿支動脈分布區。放射冠梗死：位于大腦中動脈皮質支以及穿動脈分布區交界區，即內交界區的梗死，主要位于放射冠區。后循環梗死：指的是椎基底動脈分布區，包括枕葉皮質丘腦、腦干等區域。③ 頭頸部責任血管狹窄分級標準采用北美癥狀性頸動脈內膜切除術分級法標準[7]：輕度狹窄≤29%，中度狹窄為 30%～69%，重度狹窄≥70%，閉塞即狹窄處及其遠端不顯影。④ END 終點事件[8]。A. 癥狀性出血界定為由于腦出血占位效應引起 NIHSS 評分增加≥4 分。B. 惡性腦水腫界定為最初的缺血性腦卒中病灶在除外出血時出現明顯占位效應，導致 NIHSS 評分增加≥4 分。C. 早期復發缺血性腦卒中界定為最初的缺血性腦卒中病灶擴大或者新出現其他的缺血性腦卒中病灶導致的 NIHSS 評分增加≥4 分。D. 早期癇性發作：因血管重通再灌增加氧自由基數量觸發癲癇發生，且患者往往預后不良。癲癇發作只引起短暫病情加重，但也歸為 END 的終點事件之一；非抽搐性癲癇發作也可導致病情惡化。如果存在以上兩種原因導致 NIHSS 評分增加，選擇最可能導致癥狀加重的原因作為主要的 END 分型。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 20.0 統計學軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，非正態分布計量資料采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較采用 t 檢驗或非參數檢驗；計數資料采用例數和百分比表示，組間比較采用 χ2 檢驗或秩和檢驗。采用配對樣本 t 檢驗或 Wilcoxon 符號秩檢驗比較溶栓前及溶栓后中性粒細胞、淋巴細胞變化。多因素回歸分析以單因素分析中溶栓后相關指標 P<0.20[9]的變量為自變量，采取 logistic 向后逐步剔除 LR 法進行多因素分析，計算比值比（odds ratio，OR）和 95% 置信區間（confidence interval，CI）。使用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線比較中性粒細胞、中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）對靜脈溶栓后不良預后的預測價值，計算最佳界值及靈敏度、特異度。檢驗水準 a=0.05。
2 結果
2.1 兩組患者基線資料比較
共搜集 4.5 h 內阿替普酶靜脈溶栓患者 266 例。為避免相關混雜因素的影響，排除橋接血管內治療者 36 例，溶栓過程中停止者 9 例，既往改良 Rankin 量表（Modified Rankin Scale，MRS）評分≥3 分者 4 例，肝腎功能重度異常、重度感染惡性腫瘤及基礎情況差者 13 例，診斷不明確者 5 例，此外排除資料不完整者 12 例，最終納入研究患者 187 例。
納入患者溶栓后 72 h，發生 END 48 例，其中，出血轉化 13 例，早期復發性缺血性腦卒中 21 例，惡性腦水腫 11 例，早期癇性發作 3 例；非 END 139 例。END 組患者年齡、有房顫史者比例均高于非 END 組，差異有統計學意義（P<0.05）；而在性別、高血壓、糖尿病、冠心病、既往卒中病史及吸煙史等方面比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
兩組患者基線資料比較
2.2 兩組患者臨床資料比較
溶栓前，兩組患者除總蛋白（t=2.130，P=0.035）、白蛋白（t=2.777，P=0.007）外，其余指標比較差異均無統計學意義（P>0.05）。溶栓后，白細胞計數、中性粒細胞計數、NLR、纖維蛋白酶降解產物、基線和變化 NIHSS 評分、心源性腦卒中、責任血管狹窄程度及前循環皮質梗死部位，END 組均高于非 END 組（P<0.05）；而總蛋白、白蛋白、淋巴細胞計數、前白蛋白 END 組低于非 END 組（P<0.05）。見表 2～4。
表2
溶栓前兩組患者實驗室檢查比較
表3
溶栓后兩組患者實驗室檢查比較
表4
兩組入院情況/病因學分型/影像學檢查比較
此外，在溶栓前后，END 組中性粒細胞計數增加明顯（Z=?2.314，P=0.021），而非 END 組中性粒細胞增加不明顯（Z=?0.787，P=0.431）；END 組淋巴細胞計數下降明顯（Z=?2.109，P=0.035），而 非 END 組淋巴細胞計數變化不明顯（Z=?1.921，P=0.055）；END 組（Z=?1.767，P=0.077）及非 END 組（Z=?0.342，P=0.732）溶栓前后 NLR 變化無統計學意義。
2.3 多因素 logistic 回歸分析
以是否發生靜脈溶栓 END 為因變量（y：非 END 組=0，END 組=1），以單變量分析中 P<0.20 的因素為自變量，進行變量賦值后，納入模型 187 例患者進行回歸分析。二分類 logistic 回歸分析顯示，中性粒細胞計數［OR=1.288，95%CI（1.069，1.552）］，血清白蛋白水平［OR=0.851，95%CI（0.753，0.963）］、基線 NIHSS 評分［OR=1.126，95% CI（1.027，1.234）］、心源性腦卒中［OR=1.746，95%CI（1.036，2.944）］、責任血管狹窄程度［OR=2.137，95%CI（1.278，3.573）］為靜脈溶栓 END 的獨立影響因素。具體賦值及結果見表 5、6。
表5
變量賦值表
表6
多因素 logistic 回歸分析阿替普酶靜脈溶栓后發生 END 的影響因素
2.4 溶栓后中性粒細胞對患者的 END 預測價值
計算基線中性粒細胞計數、基線 NLR、溶栓后中性粒細胞計數、溶栓后 NLR 行 ROC 分析，溶栓后中性粒細胞預測 END 曲線下面積為 0.697［95%CI（0.607，0.787）］，最大約登指數為 0.344，最佳預測值為 6.02×109/L，此時預測的靈敏度為 62.5%，特異度為 71.9%。溶栓后 NLR、基線中性粒細胞計數、基線 NLR 曲線下面積分別為 0.708、0.610、0.589。靜脈溶栓后中性粒細胞計數預測 END 的特異度最高。見表 7、圖 1。
表7
各因素對 AIS 溶栓患者預測的 ROC 曲線下面積
圖1
各危險因素預測 AIS 溶栓患者預后的 ROC 曲線
3 討論
越來越多的研究和臨床證據表明，炎癥作為一種經典的分子機制[10-11]，在血管事件的發生和預后的惡化中起主要作用。中性粒細胞作為白細胞的主要成分和炎癥的主要決定因素，目前已成為預測血管疾病患者預后的焦點。有關 AIS 靜脈溶栓后發生 END，中性粒細胞計數的臨床預測作用在國內外報道不多，本研究通過回顧性研究證明了溶栓后中性粒細胞升高與 END 的發生有一定相關性。Kim 等[12]通過對 779 例首發的 AIS 患者回顧性研究得出，較高的白細胞總數及較高的中性粒細胞計數與發生嚴重 AIS 相關，而較低的淋巴細胞計數與較高的腦卒中嚴重性增長（入院 1 周內 NIHSS 評分與入院時 NIHSS 評分之差）及較差的功能預后（出院 3 個月 mRS >2 分）相關。還有研究通過探討外周血早期白細胞及其亞型與 AIS 發生、發展的關系得出：白細胞計數和中性粒細胞計數升高是 AIS 的獨立危險因素[13]。
我們發現入院時（發病后 4.5 h 內）中性粒細胞或淋巴細胞的計數與卒中結局無顯著相關性。然而，在靜脈溶栓后 24 h 內中性粒細胞計數顯著增加。中性粒細胞的動態增加有效地預測了 END 的發生，獨立于傳統的風險因素比如入院時 NIHSS 評分以及責任血管的狹窄程度等。根據本研究結果，監測阿替普酶溶栓后血液中的中性粒細胞計數可能有助于神經科醫師預測不良預后，因此可能為預防神經功能的進一步惡化以及改善預后而更積極的進行個性化治療。本研究還使用 ROC 曲線繪制曲線下面積，比較了基線與溶栓后早期中性粒細胞計數及 NLR 值對 END 的預測價值，溶栓后中性粒細胞及 NLR 曲線下面積大于基線，且特異性更高，說明溶栓后中性粒細胞及 NLR 可能對 END 的發生具有更高的預測價值。AIS 發生時腦缺血缺氧導致神經元細胞壞死及活性氧自由基產生，促使炎性細胞大量激活，炎癥介質釋放入血，觸發一系列炎癥級聯反應，但外周血免疫細胞開始向受損腦組織浸潤的時間卻存在爭議。Akopov 等[14]發現，在 AIS 發生后 3～6 h 可觀察到中性粒細胞開始浸潤，在發病后 12～24 h 達到高峰，且中性粒細胞被認為是第一個遷移到受損腦組織的外周免疫細胞。該研究還表明這種積累程度嚴重則對應腦組織損傷的嚴重和預后較差。而外周血淋巴細胞減低是 AIS 誘導的“免疫功能抑制綜合征”的表現之一，并與患者預后相關。本研究對比溶栓前后炎性細胞均數發現，溶栓后的白細胞、中性粒細胞均升高，淋巴細胞降低較溶栓前變化明顯，符合上述研究結論中性粒細胞在 12 h 后達高峰，且惡化組中性粒細胞計數積累程度越重，故而腦組織損傷嚴重，發生 END，且預后較差。其他文獻也對白細胞分類計數在時間點上的變化與卒中預后的關系上進行了探討。Shi 等[15]發現卒中后中性粒細胞的動態增加可顯著預測 AIS 患者接受阿替普酶治療 3 個月的死亡或致殘結局。
中性粒細胞計數與 AIS 靜脈溶栓預后的病理機制尚不明確。缺血性腦卒中后引發的炎癥反應特點是白細胞被激活，繼而遷移腦組織，病理表現為缺血性腦卒中患者外周血白細胞計數增高及浸潤局部腦組織，其中以中性粒細胞升高明顯。中性粒細胞可以釋放活性氧、細胞因子及趨化因子[16]，啟動隨后的炎癥/免疫細胞的遷移，這些有害分子可加重梗死生長并導致癥狀惡化。同時，中性粒細胞通過多種途徑促進血栓形成，包括釋放負責中性粒細胞胞外陷阱（neutrophilextracellular traps，NET）形成，以及與血小板的直接相互作用[17]。既往研究發現，急性 ST 段抬高性心肌梗死時，斑塊破裂處可釋放活化的組織因子并且多形核中性粒細胞誘導的 NET 釋放能夠與凝血酶活化的血小板相互作用，損傷血管內皮細胞導致血漿外滲，使內皮細胞損傷暴露于內皮下膜，觸發血小板的凝聚及凝血酶的進一步活化，導致血管內血栓形成。NET 生成過程中可釋放多種殺菌物質來清除病原微生物，其中一級顆粒包括中性粒細胞彈性蛋白酶等；二級顆粒包括抑菌肽 LL-37 等；三級顆粒包括均屬蛋白酶基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9 等，MMP 活性增加可短暫或持續性破壞血腦屏障處的緊密連接蛋白及基膜蛋白，血腦屏障滲透性增加甚至破壞，這將惡化缺血性腦卒中病情，導致顱內出血轉化的風險增加[18]。
除了中性粒細胞外，我們還檢測了淋巴細胞和 NLR，這也是廣泛研究的卒中預后預測指標。NLR 水平相對穩定，主要與機體炎癥反應相關。NLR 為中性粒細胞計數和淋巴細胞計數相比所得，故而整合了兩種白細胞亞型的預測信息，中性粒細胞計數升高或者淋巴細胞計數降低都可導致 NLR 的升高。Maestrini 等[3]研究表明，除了升高的中性粒細胞計數，NLR 能夠預測癥狀性顱內出血轉化和 3 個月時不良預后。Guo 等[19]探討腦卒中患者靜脈溶栓血漿 NLR 的時間分布及其與溶栓后顱內出血并發癥的關系后得出：NLR 是一個動態變量，其變化與急性卒中患者接受靜脈阿替普酶治療后顱內出血有關。且 NLR 的最佳識別值為治療后 12～18 h。本研究得出惡化組的 NLR 均高于非惡化組，差異有統計學意義，但隨時間變化不顯著，且獨立影響效應不明顯。溶栓后患者的淋巴細胞有下降的趨勢，這可能與淋巴細胞可分泌抗炎因子、減輕機體對缺血部位的免疫反應有關。病情的加重導致具有保護、抗炎作用的淋巴細胞數量減少更明顯。
目前國內外靜脈溶栓 END 的相關研究不多，且大都關注于基線 NIHSS 評分、心源性腦卒中、血糖、血壓等因素造成的影響。本研究在驗證以上影響因素的同時，著眼于臨床中最常見且最易獲得的實驗室檢查等因素，發現動態監測中性粒細胞計數同樣可預測靜脈溶栓后 END 的發生，中性粒細胞計數高的靜脈溶栓患者發生 END 可能性大。但本研究存在一定局限性。本研究為溶栓前和溶栓后 24 h 內的血液樣本，并未規定具體時間節點，而中性粒細胞和淋巴細胞計數在缺血性腦卒中后隨時間變化不一致，這也可能是本研究中 NLR 對不良預后預測價值與既往文獻結果不一致的原因。另外，中性粒細胞與淋巴細胞變化的原因為缺血缺氧后的應激反應還是隱匿感染在本研究中未闡明。同時，本文還需進一步驗證未進行靜脈溶栓患者發生 END 時中性粒細胞計數、淋巴細胞計數及 INR 的變化情況。本研究為單中心、小樣本回顧性研究，存在選擇偏倚，還需擴大樣本量進一步證實。
綜上，溶栓后中性粒細胞升高與 END 的發生有一定相關性。動態監測靜脈溶栓治療后的中性粒細胞可有助于預測 END 的發生，以早期診斷并采取積極治療改善預后。
