引用本文： 楊楨, 蘇波, 鐘康穎, 李巖松, 張杰. 小鼠肺部微循環活體顯微成像. 華西醫學, 2019, 34(1): 43-49. doi: 10.7507/1002-0179.201810029 復制
近年隨著光學成像技術和熒光標記技術的發展，越來越多的研究者開始利用光學儀器開展活體顯微成像，觀察活體內特定組織中不同細胞的形態、運動、遷移和相互作用等[1-3]。這樣獲得的實驗結果因為避免了傳統實驗方法中各種物理、化學因素的干擾，更接近生理狀態下的真實情況。肺是一種獨特的器官：首先肺部的多種疾病，如肺癌、慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征等發病率或死亡率均居于前列[4-6]，因此許多實驗室都開展了肺部相關的研究；其次肺內微循環極其豐富，毛細血管網的面積總計約 35 m2，毛細血管的血容量約為肺總血容量的一半[7]，肺內每分鐘都發生著大量的物質交換，生命活動非常旺盛；同時，對于活體成像，肺部面臨更多的困難—自主呼吸和心臟搏動將嚴重影響觀察區的穩定，導致“對焦”困難，觀察視野也可能隨時間推移發生偏移，導致不同時間點間圖像可比性差；肺組織本身質地疏松薄弱，極易受損，而活體成像要盡可能好地維護組織的完整和功能的正常。
近幾年文獻報道的關于肺部的活體動物實驗多采用“雙光子顯微鏡”[8-9]，此類設備價格昂貴，對熒光標志物的穩定性和發射光譜的特異性要求較高[10]，因此對操作人員的技術水平也有較高要求，這大大限制了此類實驗的開展。鑒于此，我們設計了一套用普通共聚焦顯微鏡進行觀察的方法，該方法可在肺部維持正常通氣和血供的情況下，獲得穩定的肺組織圖像。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無特定病原體（specific pathogen free，SPF）的 tie2-cre&rosa26-tomato-EGFP 轉基因 black C57 雄性小鼠 5 只，普通 BALB/c 雄性小鼠 10 只，周齡均為 8～10 周，體重均在 20～24 g。10 只普通小鼠，依次編為 1、2、3、……、10 號，然后利用隨機數字表法將其分為 2 組（A 組和 B 組），每組 5 只。轉基因小鼠受贈于四川大學教育部移植工程與移植免疫重點實驗室石毓君教授，普通小鼠購買于成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證為［SCXK（川）2015-30］。飼養于四川大學華西醫院基因工程小鼠中心 SPF 級動物房，使用許可證為［SYXK（川）2013-119］。飼養溫度為 22～26℃，濕度為 40%～70%，晝夜節律為 12 h，飼料為小鼠專用輻照全價日糧，自由攝食飲水。所有動物實驗均獲得四川大學華西醫院動物實驗倫理委員會審查通過，倫理備案號：2015061A。
1.2 細胞、試劑和儀器
血小板：從 tie2-cre&rosa26-tomato-EGFP 轉基因 C57BL/6 小鼠血液中提取。熒光標志物：羅丹明 B（美國西格瑪奧德里奇），配制成 1 mg/mL；相對分子質量 7 萬的異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-葡聚糖（美國西格瑪奧德里奇公司），配制成 1 mg/mL。儀器：小動物活體觀察固定裝置（自制，專利申請中）；電刀（美國肯特科技）；小動物電熱毯（中國上海玉研科學儀器有限公司）；小動物呼吸機（美國肯特科技）；正置共聚焦顯微鏡（尼康 A1R，日本尼康公司），配有 NIS-Elements AR 4.50.00 64-bit 圖像采集和處理系統。手術器械：眼科剪、眼科鑷、24 G 靜脈留置針、4% 多聚甲醛。
1.3 方法
1.3.1 血小板提取
將轉基因小鼠麻醉后開胸，于心尖部取血 1 mL，與 0.1 mL 酸性枸櫞酸葡萄糖緩沖液混勻，靜置 30 min 后，以 100×g離心 10 min，吸取上層富血小板血漿，再以 740×g離心 10 min，棄上清液，管底沉積物以磷酸鹽緩沖液重懸，通過計數板將其調整至 3×109/mL 備用。經流式細胞學檢測，血小板激活率低于 1%，血小板現制現用。
1.3.2 肺組織的熒光標記
A、B 組小鼠術前尾靜脈穿刺置管，觀測前 30 min 注射羅丹明 B，1 mg/mL，100 μL/只。
1.3.3 手術和成像
① 動物手術和成像前準備。A、B 組小鼠此部分處理方法相同：2% 戊巴比妥鈉 40 mg/kg 腹腔注射麻醉，待小鼠足趾疼痛反射消失后，仰臥固定于自制穩定裝置上（圖 1a）。頸部剃毛備皮，切開頸部皮膚，分離皮下組織和腺體，暴露氣管，24 G 動脈穿刺針行氣管插管，絲線固定并與呼吸機相連，行機械通氣。
小鼠轉至左側臥位，右側胸壁剃毛備皮，以第 4、5 肋間為中心，剪掉一直徑約 1 cm 的皮膚，然后逐層撥開筋膜、肌肉，提起第 4 肋剪掉約 2 mm，胸腔負壓消失，待肺組織與胸膜分離再進一步擴大此開口，直到可暴露直徑約 6 mm 的肺組織（圖 1b），電刀止血。
將裝置和小鼠一起移至顯微鏡載物臺上，將觀察用壓片放置在小鼠胸部，觀察窗口對準暴露的肺組織，固定壓片，開啟負壓吸引裝置，使待觀察的肺組織穩定貼附于觀察窗的玻片，調整物距，準備成像。見圖 1c。
圖1
自制視野穩定裝置及觀測前小鼠的手術操作和固定
a. 氣管插管和機械通氣，A：自制器官穩定裝置；b. 肺組織暴露窗；c. 小鼠及其肺部的固定，B：觀察窗，C：負壓導管，D：壓片
② 組織活體顯微成像。A 組小鼠于拍攝過程中經尾靜脈注射預先準備好的 FITC-葡聚糖，用于觀察該方法對肺組織血液灌注的影響以及對肺組織的損傷情況；B 組小鼠注射提取的血小板，用于觀察該方法在視頻錄制期間是否造成肺組織形態變化以及對體積小、運動快的目標（經尾靜脈注射的血小板）的成像能力。成像儀器：尼康正置激光共聚焦顯微鏡（A1R），20 倍物鏡（NA 0.75）和 10 倍物鏡（NA 0.45）。
參數設置：A 組，用于觀察血液灌注情況：拍攝模式 Resonant，單向掃描，針孔 29.2 μm，成像速度 15 幀/s；FITC-葡聚糖激發光波長 488 nm，激光功率（power）為 9.7（2.2 mW）、增益（high voltage，HV）為 120（1.2 kV）、偏置電壓（offset）為–30%，525/50 濾塊接收；羅丹明-B 激發光波長 560 nm，power 為 29.2（7.5 mW）、HV 為 115（1.15 kV）、offset 為 –51%，595/50 nm 濾塊接收；成像像素（圖像分辨率）512×512。拍攝總時長為 5 min，無間隔模式。
B 組，用于觀察血小板運動情況：拍攝模式 Resonant，單向掃描，針孔 83.01 μm，成像速度 15 幀/s；綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-血小板激發光波長為 488 nm，power 為 8.0（1.8 mW）、HV 為 70（0.7 kV）、offset 為 0%，525/50 濾塊接收；羅丹明-B 激發光波長 560 nm，power 為 7.2（1.8 mW）、HV 為 54（0.54 kV）、offset 為 –70%，595/50 nm 濾塊接收；成像像素（圖像分辨率）512×512。拍攝總時長為 5 min，無間隔模式。
③ 組織病理學檢查。A 組小鼠于視頻錄制后，保持穩定裝置對肺部的負壓吸引 1 h，然后將小鼠從裝置上取下，斷頸處死，心臟放血后，取下被觀察的肺葉，4% 多聚甲醛固定 24 h 后制成石蠟切片，然后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。
1.4 圖像處理方法
應用 NIS 圖像分析軟件，從 B 組每只小鼠的視頻中分別抽取第 0、30、60、120、180 和 300 秒的圖像（共 30 張）。然后將每只鼠不同時間點的圖像（6 張）進行疊加，觀察重疊情況，由此評估圖像隨時間推移的穩定性。再應用該軟件計算出每只小鼠在每個時間點視頻圖像中所有肺泡腔面積的均數（肺泡腔定義為紅色熒光強度為 0～180 的區域，計算時，所有參數保持統一）。
1.5 統計學方法
使用 SPSS 19.0 軟件對不同時間點肺泡腔面積的數據進行統計分析。肺泡面積以均數±標準差表示，對數據進行 Mauchly 球形度檢驗，滿足球形度假設，則采用單因素重復測量方差分析，不滿足則采用 Greenhouse-Geisser 校正。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠肺部組織血流灌注和損傷情況
A 組小鼠注射前，肺部 FITC 通道無熒光信號。注射后，FITC-葡聚糖迅速充盈了小鼠肺部的血管和肺泡間隔，肺內血液灌注良好（圖 2）；肺組織結構完整，無出血，無明顯炎癥反應（圖 3）。
圖2
正置激光共聚焦顯微鏡下 A 組小鼠尾靜脈注射 FITC-葡聚糖前后肺部的圖像（ ×10）
Merged：“FITC-葡聚糖”和“肺組織”疊加
圖3
A 組小鼠肺組織 HE 染色結果
a. HE ×20；b. HE ×10
2.2 小鼠肺部組織形態情況
B 組小鼠拍攝的圖像顯示肺泡、肺泡間隔、血管結構清晰，無圖像扭曲、無偽影；每只小鼠不同時間點的圖像疊加后，重合良好（圖 4）。5 只小鼠 6 個時間點肺泡面積均值依次為（1 603±181）、（1 588±183）、（1 528±363）、（1 506±353）、（1 437±369）、（1 549±307） μm2，見表 1。因數據球形度檢驗 P<0.05，不滿足球形性，經校正，方差分析的結果顯示F=2.03、P=1.198，不同時間點間兩兩比較，差異均無統計學意義（P>0.05），顯示隨時間推移，小鼠肺泡面積未發生顯著性變化（圖 5）。
圖4
正置激光共聚焦顯微鏡下不同時間點 B 組小鼠肺部圖像及其重合情況（ ×20）
a. 0 s；b. 30 s；c. 60 s；d. 120 s；e. 180 s；f. 300 s；g. 6個時間點的圖像疊加
表1
不同時間點 B 組每只小鼠的肺泡面積（μm2，
）
圖5
不同時間點 B 組所有小鼠肺泡面積的均值（n=5）
2.3 血小板在小鼠肺內的運動情況
B 組小鼠的視頻中血小板顆粒分明，運動軌跡流暢、清晰（圖 6）。隨時間推移，視頻記錄到部分血小板黏附在血管壁和肺泡間隔。
圖6
正置激光共聚焦顯微鏡下 B 組小鼠尾靜脈注入血小板前后肺部影像（ ×20）
Merged：“GFP-血小板”和“肺組織”疊加
3 討論
活體成像對于肺、心臟等運動速度快、幅度大的器官，首先要克服的困難就是如何讓觀察區穩定在焦平面，其次是在暴露和穩定的同時，如何盡可能減少對生理功能的影響。
從 20 世紀 30 年代起，陸續就有研究者開始探索活體上觀察肺組織的方法[11-12]，然而直到 2007 年，有實驗才獲得了肺部微循環的視頻影像，但圖像穩定性和分辨率還非常有限[13]：該實驗中，研究者在小鼠胸壁切口黏附聚丙乙烯膜，再經膈間導管抽掉胸腔中的空氣使肺組織與薄膜貼附，構造了一個可在活體觀察肺組織的窗口，然后通過選取呼氣相中比較穩定的時段進行拍攝，從而獲得肺微循環的視頻。這種方法對肺的呼吸運動限制較少，但錄制時畫面抖動較為嚴重，對后續不同時間點的圖像比較造成了困難，而且圖像的分辨率僅能辨別小動脈/小靜脈，更細小的毛細血管、肺泡結構難以看清。
近 10 年，隨著熒光標記方法以及共聚焦、雙光子顯微鏡應用的開發，肺活體成像的深度、圖像質量有了明顯改善。目前已報道的針對肺的活體研究主要采用雙光子顯微鏡[8-9]：雙光子的光毒性和光損傷比激光小，組織穿透深度也優于激光[10, 14]，但是此類設備價格昂貴，染料的激發易受其他因素的影響[13]，而且多色成像時不同通道間易產生串色，所以樣本通常只做單色或雙色標記，雖然一些研究通過二次諧波效應使組織輪廓成像（二次諧波效應主要發生在組織內的膠原成分）[12]，但總體而言熒光標記的色彩組合仍然十分有限，所以在經濟和操作難度方面都限制了一些實驗室的應用，也限制了一些研究方案的實施。正因如此，本研究嘗試利用價格更經濟、操作更簡便的共聚焦顯微鏡開展肺活體實驗，為更多實驗室開展肺的活體研究提供方法學參考。
結果顯示，此套方法可以在小鼠活體狀態下、原位獲得肺組織結構的清晰圖像和某些細胞快速運動的情況；而且一定時間內，觀察區的肺組織形態和位置不會發生變化，說明本方法中的負壓吸引不會引起組織的持續擴大和變形，激光掃描也不會導致這一結果。在 x、y、z 3 個方向上，此套方法都沒有發生 20 倍物鏡下可察覺的位移。這種穩定的狀態為今后進一步觀察肺組織內某些細胞或物質的運動、增殖、擴散等提供了數據比較的基礎。同時 HE 染色結果提示，該方法持續拍攝 5 min（累計拍攝 9 000 次），后又繼續負壓吸引 1 h，未造成明顯的肺部損傷，如果采用間歇式拍攝，肺組織能耐受的掃描和吸引時長可能更長，但有待進一步研究。
此外，本研究拍攝流動的血小板的結果說明，本套方法對于快速運動目標也有較好的捕捉能力，視頻中提取的圖像的分辨率，可供定性和定量分析，也可直接應用 Imaris 軟件進行運動速度、運動軌跡等方面的分析。
相比已發表的其他類似研究[15-17]，本套方法有如下幾方面的優勢：① 所需設備和技術的可及性好。共聚焦顯微鏡在國內已比較普遍，對于大多數熒光染料，在單光子（激光）激發下，產生的發射光譜相對穩定，受染料濃度、環境因素影響小[9]，信號采集和真偽判斷方面較雙光子簡單。② 小鼠固定用的模具，制作工藝簡單、有利于保溫并且同時適用于多種器官。整套裝置中沒有額外需要特別高超制造工藝的結構，全部通過 3D 打印制作。采用“樹脂”材料做動物床和觀察窗壓片，一方面方便加工，另一方面，相比金屬材質，“樹脂”材料能更好地降低體溫丟失[15]。可移動滑槽，允許觀察窗安置在多個部位。③ 雙側滑槽支撐觀察窗比單個金屬臂支撐[15]，視野在 z 軸方向上更穩定，加之 4 個方向同時給予負壓吸引，圖像在 x、y 方向上也更穩定。
綜上所述，利用這套方法國內更多的實驗室可以開展肺部的活體研究，例如在活體下觀察炎癥時肺部微循環內的免疫學現象、肺部腫瘤的轉移擴散、藥物在肺部的生物學行為等等。另外，由于肺相對于其他器官易破損、運動劇烈，所以以本方法為基礎，廣大研究人員可以開發其他多種器官的活體成像技術，獲得更多活體狀態下的生物信息，這將有可能帶來醫學各領域的重大突破。但本方法也存在一定的局限性：如前文提及的單光子（激光）穿透組織的深度不及雙光子，本方法只能觀察到肺部表淺部位；手術創傷仍較嚴重，動物在一次觀察后難以繼續存活；因條件所限，實驗中未監測小鼠的血氧分壓、二氧化碳分壓和酸堿值，未能更全面地評估對小鼠生理功能的影響。
近年隨著光學成像技術和熒光標記技術的發展，越來越多的研究者開始利用光學儀器開展活體顯微成像，觀察活體內特定組織中不同細胞的形態、運動、遷移和相互作用等[1-3]。這樣獲得的實驗結果因為避免了傳統實驗方法中各種物理、化學因素的干擾，更接近生理狀態下的真實情況。肺是一種獨特的器官：首先肺部的多種疾病，如肺癌、慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征等發病率或死亡率均居于前列[4-6]，因此許多實驗室都開展了肺部相關的研究；其次肺內微循環極其豐富，毛細血管網的面積總計約 35 m2，毛細血管的血容量約為肺總血容量的一半[7]，肺內每分鐘都發生著大量的物質交換，生命活動非常旺盛；同時，對于活體成像，肺部面臨更多的困難—自主呼吸和心臟搏動將嚴重影響觀察區的穩定，導致“對焦”困難，觀察視野也可能隨時間推移發生偏移，導致不同時間點間圖像可比性差；肺組織本身質地疏松薄弱，極易受損，而活體成像要盡可能好地維護組織的完整和功能的正常。
近幾年文獻報道的關于肺部的活體動物實驗多采用“雙光子顯微鏡”[8-9]，此類設備價格昂貴，對熒光標志物的穩定性和發射光譜的特異性要求較高[10]，因此對操作人員的技術水平也有較高要求，這大大限制了此類實驗的開展。鑒于此，我們設計了一套用普通共聚焦顯微鏡進行觀察的方法，該方法可在肺部維持正常通氣和血供的情況下，獲得穩定的肺組織圖像。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無特定病原體（specific pathogen free，SPF）的 tie2-cre&rosa26-tomato-EGFP 轉基因 black C57 雄性小鼠 5 只，普通 BALB/c 雄性小鼠 10 只，周齡均為 8～10 周，體重均在 20～24 g。10 只普通小鼠，依次編為 1、2、3、……、10 號，然后利用隨機數字表法將其分為 2 組（A 組和 B 組），每組 5 只。轉基因小鼠受贈于四川大學教育部移植工程與移植免疫重點實驗室石毓君教授，普通小鼠購買于成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證為［SCXK（川）2015-30］。飼養于四川大學華西醫院基因工程小鼠中心 SPF 級動物房，使用許可證為［SYXK（川）2013-119］。飼養溫度為 22～26℃，濕度為 40%～70%，晝夜節律為 12 h，飼料為小鼠專用輻照全價日糧，自由攝食飲水。所有動物實驗均獲得四川大學華西醫院動物實驗倫理委員會審查通過，倫理備案號：2015061A。
1.2 細胞、試劑和儀器
血小板：從 tie2-cre&rosa26-tomato-EGFP 轉基因 C57BL/6 小鼠血液中提取。熒光標志物：羅丹明 B（美國西格瑪奧德里奇），配制成 1 mg/mL；相對分子質量 7 萬的異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-葡聚糖（美國西格瑪奧德里奇公司），配制成 1 mg/mL。儀器：小動物活體觀察固定裝置（自制，專利申請中）；電刀（美國肯特科技）；小動物電熱毯（中國上海玉研科學儀器有限公司）；小動物呼吸機（美國肯特科技）；正置共聚焦顯微鏡（尼康 A1R，日本尼康公司），配有 NIS-Elements AR 4.50.00 64-bit 圖像采集和處理系統。手術器械：眼科剪、眼科鑷、24 G 靜脈留置針、4% 多聚甲醛。
1.3 方法
1.3.1 血小板提取
將轉基因小鼠麻醉后開胸，于心尖部取血 1 mL，與 0.1 mL 酸性枸櫞酸葡萄糖緩沖液混勻，靜置 30 min 后，以 100×g離心 10 min，吸取上層富血小板血漿，再以 740×g離心 10 min，棄上清液，管底沉積物以磷酸鹽緩沖液重懸，通過計數板將其調整至 3×109/mL 備用。經流式細胞學檢測，血小板激活率低于 1%，血小板現制現用。
1.3.2 肺組織的熒光標記
A、B 組小鼠術前尾靜脈穿刺置管，觀測前 30 min 注射羅丹明 B，1 mg/mL，100 μL/只。
1.3.3 手術和成像
① 動物手術和成像前準備。A、B 組小鼠此部分處理方法相同：2% 戊巴比妥鈉 40 mg/kg 腹腔注射麻醉，待小鼠足趾疼痛反射消失后，仰臥固定于自制穩定裝置上（圖 1a）。頸部剃毛備皮，切開頸部皮膚，分離皮下組織和腺體，暴露氣管，24 G 動脈穿刺針行氣管插管，絲線固定并與呼吸機相連，行機械通氣。
小鼠轉至左側臥位，右側胸壁剃毛備皮，以第 4、5 肋間為中心，剪掉一直徑約 1 cm 的皮膚，然后逐層撥開筋膜、肌肉，提起第 4 肋剪掉約 2 mm，胸腔負壓消失，待肺組織與胸膜分離再進一步擴大此開口，直到可暴露直徑約 6 mm 的肺組織（圖 1b），電刀止血。
將裝置和小鼠一起移至顯微鏡載物臺上，將觀察用壓片放置在小鼠胸部，觀察窗口對準暴露的肺組織，固定壓片，開啟負壓吸引裝置，使待觀察的肺組織穩定貼附于觀察窗的玻片，調整物距，準備成像。見圖 1c。
圖1
自制視野穩定裝置及觀測前小鼠的手術操作和固定
a. 氣管插管和機械通氣，A：自制器官穩定裝置；b. 肺組織暴露窗；c. 小鼠及其肺部的固定，B：觀察窗，C：負壓導管，D：壓片
② 組織活體顯微成像。A 組小鼠于拍攝過程中經尾靜脈注射預先準備好的 FITC-葡聚糖，用于觀察該方法對肺組織血液灌注的影響以及對肺組織的損傷情況；B 組小鼠注射提取的血小板，用于觀察該方法在視頻錄制期間是否造成肺組織形態變化以及對體積小、運動快的目標（經尾靜脈注射的血小板）的成像能力。成像儀器：尼康正置激光共聚焦顯微鏡（A1R），20 倍物鏡（NA 0.75）和 10 倍物鏡（NA 0.45）。
參數設置：A 組，用于觀察血液灌注情況：拍攝模式 Resonant，單向掃描，針孔 29.2 μm，成像速度 15 幀/s；FITC-葡聚糖激發光波長 488 nm，激光功率（power）為 9.7（2.2 mW）、增益（high voltage，HV）為 120（1.2 kV）、偏置電壓（offset）為–30%，525/50 濾塊接收；羅丹明-B 激發光波長 560 nm，power 為 29.2（7.5 mW）、HV 為 115（1.15 kV）、offset 為 –51%，595/50 nm 濾塊接收；成像像素（圖像分辨率）512×512。拍攝總時長為 5 min，無間隔模式。
B 組，用于觀察血小板運動情況：拍攝模式 Resonant，單向掃描，針孔 83.01 μm，成像速度 15 幀/s；綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-血小板激發光波長為 488 nm，power 為 8.0（1.8 mW）、HV 為 70（0.7 kV）、offset 為 0%，525/50 濾塊接收；羅丹明-B 激發光波長 560 nm，power 為 7.2（1.8 mW）、HV 為 54（0.54 kV）、offset 為 –70%，595/50 nm 濾塊接收；成像像素（圖像分辨率）512×512。拍攝總時長為 5 min，無間隔模式。
③ 組織病理學檢查。A 組小鼠于視頻錄制后，保持穩定裝置對肺部的負壓吸引 1 h，然后將小鼠從裝置上取下，斷頸處死，心臟放血后，取下被觀察的肺葉，4% 多聚甲醛固定 24 h 后制成石蠟切片，然后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。
1.4 圖像處理方法
應用 NIS 圖像分析軟件，從 B 組每只小鼠的視頻中分別抽取第 0、30、60、120、180 和 300 秒的圖像（共 30 張）。然后將每只鼠不同時間點的圖像（6 張）進行疊加，觀察重疊情況，由此評估圖像隨時間推移的穩定性。再應用該軟件計算出每只小鼠在每個時間點視頻圖像中所有肺泡腔面積的均數（肺泡腔定義為紅色熒光強度為 0～180 的區域，計算時，所有參數保持統一）。
1.5 統計學方法
使用 SPSS 19.0 軟件對不同時間點肺泡腔面積的數據進行統計分析。肺泡面積以均數±標準差表示，對數據進行 Mauchly 球形度檢驗，滿足球形度假設，則采用單因素重復測量方差分析，不滿足則采用 Greenhouse-Geisser 校正。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠肺部組織血流灌注和損傷情況
A 組小鼠注射前，肺部 FITC 通道無熒光信號。注射后，FITC-葡聚糖迅速充盈了小鼠肺部的血管和肺泡間隔，肺內血液灌注良好（圖 2）；肺組織結構完整，無出血，無明顯炎癥反應（圖 3）。
圖2
正置激光共聚焦顯微鏡下 A 組小鼠尾靜脈注射 FITC-葡聚糖前后肺部的圖像（ ×10）
Merged：“FITC-葡聚糖”和“肺組織”疊加
圖3
A 組小鼠肺組織 HE 染色結果
a. HE ×20；b. HE ×10
2.2 小鼠肺部組織形態情況
B 組小鼠拍攝的圖像顯示肺泡、肺泡間隔、血管結構清晰，無圖像扭曲、無偽影；每只小鼠不同時間點的圖像疊加后，重合良好（圖 4）。5 只小鼠 6 個時間點肺泡面積均值依次為（1 603±181）、（1 588±183）、（1 528±363）、（1 506±353）、（1 437±369）、（1 549±307） μm2，見表 1。因數據球形度檢驗 P<0.05，不滿足球形性，經校正，方差分析的結果顯示F=2.03、P=1.198，不同時間點間兩兩比較，差異均無統計學意義（P>0.05），顯示隨時間推移，小鼠肺泡面積未發生顯著性變化（圖 5）。
圖4
正置激光共聚焦顯微鏡下不同時間點 B 組小鼠肺部圖像及其重合情況（ ×20）
a. 0 s；b. 30 s；c. 60 s；d. 120 s；e. 180 s；f. 300 s；g. 6個時間點的圖像疊加
表1
不同時間點 B 組每只小鼠的肺泡面積（μm2，
）
圖5
不同時間點 B 組所有小鼠肺泡面積的均值（n=5）
2.3 血小板在小鼠肺內的運動情況
B 組小鼠的視頻中血小板顆粒分明，運動軌跡流暢、清晰（圖 6）。隨時間推移，視頻記錄到部分血小板黏附在血管壁和肺泡間隔。
圖6
正置激光共聚焦顯微鏡下 B 組小鼠尾靜脈注入血小板前后肺部影像（ ×20）
Merged：“GFP-血小板”和“肺組織”疊加
3 討論
活體成像對于肺、心臟等運動速度快、幅度大的器官，首先要克服的困難就是如何讓觀察區穩定在焦平面，其次是在暴露和穩定的同時，如何盡可能減少對生理功能的影響。
從 20 世紀 30 年代起，陸續就有研究者開始探索活體上觀察肺組織的方法[11-12]，然而直到 2007 年，有實驗才獲得了肺部微循環的視頻影像，但圖像穩定性和分辨率還非常有限[13]：該實驗中，研究者在小鼠胸壁切口黏附聚丙乙烯膜，再經膈間導管抽掉胸腔中的空氣使肺組織與薄膜貼附，構造了一個可在活體觀察肺組織的窗口，然后通過選取呼氣相中比較穩定的時段進行拍攝，從而獲得肺微循環的視頻。這種方法對肺的呼吸運動限制較少，但錄制時畫面抖動較為嚴重，對后續不同時間點的圖像比較造成了困難，而且圖像的分辨率僅能辨別小動脈/小靜脈，更細小的毛細血管、肺泡結構難以看清。
近 10 年，隨著熒光標記方法以及共聚焦、雙光子顯微鏡應用的開發，肺活體成像的深度、圖像質量有了明顯改善。目前已報道的針對肺的活體研究主要采用雙光子顯微鏡[8-9]：雙光子的光毒性和光損傷比激光小，組織穿透深度也優于激光[10, 14]，但是此類設備價格昂貴，染料的激發易受其他因素的影響[13]，而且多色成像時不同通道間易產生串色，所以樣本通常只做單色或雙色標記，雖然一些研究通過二次諧波效應使組織輪廓成像（二次諧波效應主要發生在組織內的膠原成分）[12]，但總體而言熒光標記的色彩組合仍然十分有限，所以在經濟和操作難度方面都限制了一些實驗室的應用，也限制了一些研究方案的實施。正因如此，本研究嘗試利用價格更經濟、操作更簡便的共聚焦顯微鏡開展肺活體實驗，為更多實驗室開展肺的活體研究提供方法學參考。
結果顯示，此套方法可以在小鼠活體狀態下、原位獲得肺組織結構的清晰圖像和某些細胞快速運動的情況；而且一定時間內，觀察區的肺組織形態和位置不會發生變化，說明本方法中的負壓吸引不會引起組織的持續擴大和變形，激光掃描也不會導致這一結果。在 x、y、z 3 個方向上，此套方法都沒有發生 20 倍物鏡下可察覺的位移。這種穩定的狀態為今后進一步觀察肺組織內某些細胞或物質的運動、增殖、擴散等提供了數據比較的基礎。同時 HE 染色結果提示，該方法持續拍攝 5 min（累計拍攝 9 000 次），后又繼續負壓吸引 1 h，未造成明顯的肺部損傷，如果采用間歇式拍攝，肺組織能耐受的掃描和吸引時長可能更長，但有待進一步研究。
此外，本研究拍攝流動的血小板的結果說明，本套方法對于快速運動目標也有較好的捕捉能力，視頻中提取的圖像的分辨率，可供定性和定量分析，也可直接應用 Imaris 軟件進行運動速度、運動軌跡等方面的分析。
相比已發表的其他類似研究[15-17]，本套方法有如下幾方面的優勢：① 所需設備和技術的可及性好。共聚焦顯微鏡在國內已比較普遍，對于大多數熒光染料，在單光子（激光）激發下，產生的發射光譜相對穩定，受染料濃度、環境因素影響小[9]，信號采集和真偽判斷方面較雙光子簡單。② 小鼠固定用的模具，制作工藝簡單、有利于保溫并且同時適用于多種器官。整套裝置中沒有額外需要特別高超制造工藝的結構，全部通過 3D 打印制作。采用“樹脂”材料做動物床和觀察窗壓片，一方面方便加工，另一方面，相比金屬材質，“樹脂”材料能更好地降低體溫丟失[15]。可移動滑槽，允許觀察窗安置在多個部位。③ 雙側滑槽支撐觀察窗比單個金屬臂支撐[15]，視野在 z 軸方向上更穩定，加之 4 個方向同時給予負壓吸引，圖像在 x、y 方向上也更穩定。
綜上所述，利用這套方法國內更多的實驗室可以開展肺部的活體研究，例如在活體下觀察炎癥時肺部微循環內的免疫學現象、肺部腫瘤的轉移擴散、藥物在肺部的生物學行為等等。另外，由于肺相對于其他器官易破損、運動劇烈，所以以本方法為基礎，廣大研究人員可以開發其他多種器官的活體成像技術，獲得更多活體狀態下的生物信息，這將有可能帶來醫學各領域的重大突破。但本方法也存在一定的局限性：如前文提及的單光子（激光）穿透組織的深度不及雙光子，本方法只能觀察到肺部表淺部位；手術創傷仍較嚴重，動物在一次觀察后難以繼續存活；因條件所限，實驗中未監測小鼠的血氧分壓、二氧化碳分壓和酸堿值，未能更全面地評估對小鼠生理功能的影響。
