引用本文： 周琦, 李自圓, 陸方. Leber 先天性黑矇患者的臨床表型及遺傳學分析. 華西醫學, 2018, 33(11): 1359-1366. doi: 10.7507/1002-0179.201809128 復制
Leber 先天性黑矇（leber congenital amaurosis，LCA）是一種嚴重的遺傳性致盲性視網膜營養不良，約占遺傳性視網膜疾病的 5%，占學齡兒童盲的 20%，全世界患病率為 1/80 000～1/30 000[1]。德國眼科醫師 Theodor Leber 于 1869 年首先報道了該病[2]。近年來的遺傳學研究相繼發現了 19 個致病基因與 LCA 相關，這些基因編碼的蛋白在視網膜發育和視網膜生理功能中起到多種作用[3]。LCA 具有遺傳異質性與表型多樣性的特點，本文中我們通過全外顯子組測序（whole-exome sequencing，WGS）的方法對 3 例 LCA 患者及其父母進行遺傳學診斷及分型。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
收集 2016 年 6 月—8 月在四川大學華西醫院眼科臨床診斷為 LCA 的患者 3 例。
1.2 研究方法
1.2.1 全身麻醉（全麻）下 RetcamⅡ眼底血管造影檢查
所有患者均在雙眼瞳孔充分散大后，在全麻下，使用廣角數碼視網膜成像系統（RetcamⅡ，美國 Massie 公司）配合鞏膜壓迫器檢查眼底，要求檢查到包含鋸齒緣的全部視網膜，同時配合眼底血管造影檢查留存影像資料。
1.2.2 DNA 提取
監護人簽署知情同意書后，分別采集患者及其父母的外周靜脈血各約 2 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝，用 QIAamp 全血 DNA 提取試劑盒（德國 Qiagen 公司）按其指南提取基因組 DNA。本研究經四川大學華西醫院倫理委員會審批通過，所有研究對象均知情同意。
1.2.3 目標基因捕獲和高通量測序
應用 GenCap 液相捕獲目標基因技術（北京邁基諾公司），對眼科相關基因的編碼外顯子和側翼區域進行捕獲。將先證者的基因組 DNA 片段化，與 GenCap 探針（北京邁基諾公司）混合進行聚合酶鏈反應和雜交。樣品用 MyOne 磁珠（美國 Life Technology 公司）洗滌并重懸于結合緩沖液中。將混合的樣品轉移至含有 80 μL MyOne 磁珠的試管中，并旋轉混勻 1 h。最后，用 Buffer Elute 洗脫 DNA 并在捕獲后進行擴增。富集的文庫用 Illumina HiSeq 2000（美國 Illumina 公司）第二代測序儀進行雙端測序，讀長為 90 bp。
1.2.4 數據篩選和生物信息學分析
目標區域測序后原始數據經過 index 拆分后獲得各個樣本的原始序列，去除測序數據中的接頭和低質量數據（質量值≤20），運用 BWA 軟件比對到參考基因組上，用 GATK 軟件對各個樣本的比對數據進行多態性位點的檢測，對單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入缺失突變（insertion deletion mutations，InDel）等數據進行統計和分析。查找 SNP 及 InDel 在千人基因組及 dbSNP132 數據庫中頻率。利用 SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++ 等數據庫對 SNP 及 InDel 的致病性進行預測分析。
1.2.5 Sanger 測序驗證
根據需要測序的 DNA 片段合成引物（表 1），用聚合酶鏈反應法進行擴增，用 ABI3730xl 測序儀（美國 Applied Biosystems 公司）以 Sanger 測序法進行測序，測序結果與目標區域捕獲測序后的結果進行比對。
表1
引物及產物長度
2 結果
患者 1，女，6 歲。自幼雙眼視力差，合并“先天性腦癱”；父母為近親結婚，眼科檢查均未見異常（圖 1a）。表現為雙眼指壓征（+），雙眼視力不會認，眼球內陷，眼球震顫，結膜無充血，角膜透明，前房深度正常，瞳孔直徑約 5 mm，直接光反射遲鈍，晶狀體透明，全麻下 RetcamⅡ示雙眼底視盤顏色蒼白，邊界清楚，視盤周圍血管閉塞呈“白線”狀，視網膜廣泛椒鹽狀色素改變。熒光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）示雙眼視盤周圍血管充盈欠佳，視網膜廣泛點狀透見熒光（圖 1b）。該患者確診：雙眼 LCA，雙眼視神經萎縮，腦癱。患者未予以治療。患者 1 外周血基因檢測結果發現 SPATA7 純合突變，突變類型為 14 號染色體 5 號外顯子上的插入突變［c.744（E5）至 c.745（E5）插入 T, p.249, L>Ffs4］，其父母攜帶SPATA7 雜合突變，符合常染色體隱性遺傳規律（圖 1c）。
圖1
患者 1 檢查結果
a. 患者家系圖，父母為近親結婚；b. 患者眼底圖，可見雙眼視盤顏色蒼白，視盤周圍血管閉塞呈“白線”狀，視網膜廣泛椒鹽狀色素改變，FFA 示雙眼視盤周圍血管充盈欠佳，視網膜廣泛點狀透見熒光；c. 基因檢測結果：患者父母攜帶
患者 2，男，4 個月。發現雙眼不能追視 2 個月就診，患者父母眼科檢查未見異常（圖 2a）。表現為雙眼指壓征（+），雙眼視力不會認，眼球震顫，結膜無充血，角膜透明，前房深度正常，瞳孔直徑約 5 mm，直接光反射遲鈍，晶狀體透明，全麻下 RetcamⅡ示雙眼底視盤蒼白，視網膜血管變細，周邊視網膜脫色素。FFA 示雙眼視盤強熒光，周邊視網膜可見小片無灌注區，未見熒光素滲漏（圖 2b）。診斷：雙眼 LCA，雙眼視神經萎縮。予以患者鼠神經生長因子肌肉注射治療，2 個月后患者家屬訴患者按壓眼球頻次減少，可追光及自主抓物。患者 2 及其父親外周血基因檢測結果發現 WFS1 雜合突變，突變為 4 號染色體 5 號外顯子 c.535G>A, p.A179T（圖 2c）。
圖2
患者 2 檢查結果
a. 患者家系圖；b. 患者眼底圖，可見雙眼視盤蒼白，視網膜血管變細，FFA 示雙眼視盤強熒光，周邊視網膜可見小片無灌注區；c. 基因檢測結果：患者及父親為
患者 3，女，6 個月。發現患者雙眼無法追視 2+個月就診，患者父母眼科檢查未見異常（圖 3a）。表現為雙眼指壓征（+），眼球內陷，雙眼視力不會認，眼球震顫，結膜無充血，角膜透明，前房深度正常，瞳孔直徑約 4 mm，直接光反射消失，晶狀體透明，全麻下 RetcamⅡ示雙眼視盤蒼白，對稱性黃斑色素上皮萎縮，視網膜、脈絡膜廣泛脫色素及變性，視網膜血管變細，FFA 可見黃斑區不規則邊緣清楚的低熒光區，以及視網膜上廣泛及均勻的斑點狀透見熒光（圖 3b）。診斷：雙眼 LCA，雙眼視神經萎縮。患者未予以治療。患者 3 外周血基因檢測結果發現 CRB1、RPGRIP1、SPATA7 雜合突變。其父親攜帶 RPGRIP1、SPATA7 突變基因，母親攜帶 CRB1 突變基因。CRB1 突變為 1 號染色體 3 號外顯子 c.664G>A, p.E222K。RPGRIP1 突變為 14 號染色體 5 號外顯子 c.775T>C, p.C259R。SPATA7 突變為 14 號染色體 7 號外顯子 c.899T>C, p.I300T（圖 3c～3e）。
圖3
患者 3 檢查結果
a. 患者家系圖；b. 患者眼底圖，眼底照相示雙眼視盤蒼白，對稱性黃斑色素上皮萎縮，視網膜血管變細，視網膜、脈絡膜廣泛脫色素及變性，FFA 示黃斑區不規則邊緣清楚的低熒光區，以及視網膜上廣泛及均勻的斑點狀透見熒光；c～e. 基因檢測結果：患者外周血基因檢測結果發現
3 討論
LCA 的臨床特征為出生時或出生后不久（多在 6 個月之內）即出現視力低下或喪失、眼球震顫、瞳孔反應遲鈍、畏光、指壓征、眼球內陷等。眼底表現個體差異較大，可表現為色素沉著（椒鹽樣、骨細胞樣）、視網膜血管變細、廣泛視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）萎縮，少數患者眼底可無明顯異常。視網膜電圖（electroretinogram，ERG）表現為 a、b 波平坦。由于遺傳異質性，患者同時還可伴有圓錐角膜、白內障、高度遠視、發育遲緩、神經系統及腎、骨骼異常等[4]。
指壓征是 LCA 患者特征性眼部表現，本文 3 例患者均出現指壓征（+）。指壓征是指反復用手指或者指關節戳、按壓或者摩擦眼球，其具體發生機制不明確，推測此動作可能使患者產生閃光感及幻視。指壓征時手指持續壓迫眼球，導致眶脂肪萎縮，進而引起眼球內陷，也有學者認為，指壓征與 LCA 患者圓錐角膜形成有關[5]。
LCA 一般呈常染色體隱性遺傳，也有少數呈常染色體顯性遺傳[6-7]。目前共確定了該病的 19 個致病基因，解釋了大約 70% 患者的致病原因[3]。已發現的基因包括 GUCY2D[8]、RPE65[9]、SPATA7[10]、AIPL1[11]、LCA5[12]、RPGRIP1[13]、CRX[14]、CRB1[15]、NMNAT1[16]、CEP290[15]、RD3[17]、IMPDH1[16]、RDH12[18]、LRAT[19]、TULP1[20]、KCNJ13[21]、IQCB1（也稱為 NPHP5）[22-23]、MERTK[24]以及 OTX2[25]。LCA 基因編碼的蛋白涉及多種視網膜功能，包括視網膜內維生素 A 的代謝循環（RPE65、RDH12、LRAT）、鳥嘌呤的合成（IMPDH1）、錐細胞外節的吞噬作用（MERTK）、光感受器纖毛轉運過程（CEP290、LCA5、RPGRIP1、TULP1）、視網膜光電信號的傳導過程（APL1、GUCY2D）、視網膜光感受器細胞的分化和發育（CRB1、CRX）以及蛋白轉運和分布（AIPL1、RPGRIP1）[6]。
在患者 1 中，患者眼部癥狀出現早，眼部表現為視力差、指壓征（+）及眼球震顫，眼底檢查見視盤蒼白、血管閉塞及視網膜廣泛椒鹽狀色素改變，符合 LCA 臨床診斷。且患者外周血基因檢測結果證實為 SPATA7 基因純合突變，突變類型為 14 號染色體 5 號外顯子上的插入突變［c.744（E5）至 c.745（E5）插入 T, p.249, L>Ffs4］，為已知 LCA 致病基因的未知位點異常。患者父母為近親結婚，眼部表現正常，攜帶SPATA7 致病基因，符合常染色體隱性遺傳規律。SPATA7 在人體組織中廣泛表達，尤其在視網膜、腦組織和睪丸中高表達，其存在 2 種亞型，亞型 1 主要在神經組織和視網膜中高表達，亞型 2 主要在睪丸組織中高表達[10]。SPATA7 編碼蛋白的功能尚不明確，因此 SPATA7 突變導致 LCA 的分子機制尚不清楚。且 SPATA7 在腦組織和睪丸組織中高表達，其突變可能導致多系統病變和生殖功能異常。SPATA7 突變導致 LCA 臨床特點為早期發生嚴重的視網膜萎縮和視功能損害，眼底檢查可見視盤色淡、動脈變細、RPE 萎縮及視網膜色素沉著[10]。Mackay 等[26]研究發現 SPATA7 突變導致的 LCA 患者臨床表現包括早期嚴重視力下降、眼球震顫及瞳孔對光反應遲鈍，眼底表現為廣泛 RPE 萎縮、血管變細及視盤蒼白，ERG 結果提示視錐及視桿反應波形消失，部分患者還伴有聽力喪失。且該患者同時合并腦癱，因 SPATA7 同時在腦組織中高表達，兩者之間是否有關聯還需進一步證實。
患者 2 中，患者在出生后即發病，眼部表現為指壓征（+）、眼球震顫、瞳孔光反射遲鈍及眼底視神經萎縮，符合 LCA 臨床診斷。但患者外周血基因檢測結果發現 WFS1 雜合突變，目前尚無研究證實 WFS1 是 LCA 的致病基因之一。但 Wang 等[27]在中國 LCA 患者中發現 WFS1 突變，推測 WFS1 可能與 LCA 發病密切相關，有待進一步研究證實。WFS1 可表達于胰島 β 細胞上，編碼跨膜蛋白 Wolframin，其在抑制胰島 β 細胞凋亡及維持內質網穩態方面有至關重要[28]。Kawano 等[29]發現 WFS1 表達于無長突細胞及 Müller 細胞，WFS1 突變可影響神經節細胞存活甚至進一步導致視神經萎縮。Wolfram 綜合征是一種常染色體隱性遺傳性神經退行性疾病，目前已證實 Wolfram 綜合征與 WFS1 突變有關，主要表現為糖尿病、視神經萎縮、耳聾及尿崩癥[30]。
患者 3 中，患者在 1 歲以內發病，眼部癥狀包括雙眼指壓征（+）、眼球內陷、眼球震顫、瞳孔光反射消失、眼底視神經及黃斑色素上皮萎縮、視網膜血管變細及色素改變，符合 LCA 臨床表現。患者外周血基因檢測結果發現 CRB1、RPGRIP1、SPATA7 雜合突變，此 3 種基因均為已明確 LCA 致病基因。患者父母眼部表現正常，其父親攜帶 RPGRIP1、SPATA7 突變基因，母親攜帶 CRB1 突變基因，不符合 LCA 遺傳特征，存在的原因可能包括：① 目前基因診斷水平限制；② 部分常染色體隱性遺傳患者，在單點突變的情況下也可能致病；③ 該患者的 3 個已發現的致病基因，并非來自父親或者母親一方，而是來自雙方，不排除 3 個致病基因同時存在導致患者出現臨床癥狀。CRB1 編碼的蛋白質是含有 1 406 個氨基酸的跨膜蛋白，主要位于 Müller 細胞近頂點區細胞膜上，參與維持細胞極性和上皮細胞間的連接。CRB1 突變后導致視網膜發育缺陷，可出現視網膜變厚及層次結構不清，類似于未發育成熟的視網膜[31]。CRB1 突變患者可出現嚴重視力下降、遠視、黃斑萎縮，部分患者眼底可出現類似 coats 病表現，視網膜毛細血管擴張、視網膜滲出及視網膜脫離[32]。該患者 CRB1 突變為 1 號染色體 3 號外顯子的突變 c.664G>A, p.E222K。Li 等[24]在中國漢族 LCA 患者中也發現該錯義突變，但因其同時在正常人中檢測出，認為該突變為一種未被發現的 SNP。RPGRIP1 編碼的蛋白質參與調節纖毛間的蛋白質轉運及光感受器外節膜盤的更新，RPGRIP1 突變后將導致視網膜萎縮及嚴重的功能損害[33]。Hanein 等[34]總結 RPGRIP1 突變患者的臨床特征包括：畏光、遠視（度數<+7D）、視力從數指到 20/400 不等，早期眼底可出現視網膜變性。Galvin 等[35]發現 RPGRIP1 突變患者在 10 歲之前視力會下降到光感甚至無光感。
LCA 具有遺傳異質性與表型多樣性的特點，認識不同基因型的臨床表型特點，有助于縮小基因篩查的范圍，進一步為基因治療提供依據。LCA 患者視功能損害的嚴重程度和進展速度與基因型存在一定關系。LCA 患者視力通常從 20/200 到光感甚至無光感不等。CRB1、LCA5 及 RPE65 突變患者可表現為視力短暫性提高，穩定一段時間后又下降[6, 36]。CEP290 和 GUCY2D 突變患者可表現為視力嚴重下降且保持穩定[37-38]。AILP1 和 RPGRIP1 突變患者可表現為進行性視力下降[39-40]。GUCY2D 基因編碼的蛋白位于視錐和視桿光感受器的細胞核和內節中，突變后導致類似光持續照射的情況，不能恢復為暗反應[35]。GUCY2D 突變患者臨床上多表現為視功能嚴重損害，眼底大致正常，畏光明顯。Gradstein 等[38]在 1 個 GUCY2D 突變導致的 LCA 家系中發現，8 例患者均在 1 歲以內均出現嚴重視力下降，而眼底表現為正常或者輕度異常，該家系部分患者還合并圓錐角膜、白內障以及眼球震顫。RPE65 參與 RPE 細胞內視紫紅質合成和循環，Lorenz 等[41]發現 4 個 RPE65 突變患者在嬰兒期會出現明顯的視力損害，而在 6～10 歲時出現視力提高。CEP290 編碼的蛋白調節纖毛生成并參與纖毛間的微管轉運，CEP290 還與 Joubert 綜合征等多系統疾病相關[42]。CEP290 突變患者可表現為早期嚴重的視力下降，出生后視力即光感甚至無光感，可伴高度遠視、眼球震顫等，ERG 檢查重度異常，眼底可表現為視網膜血管變細、RPE 層萎縮以及視網膜骨細胞樣色素沉著，但晚期黃斑區視網膜仍可保留光感受器細胞[37]。另有報道指出 CEP290 突變導致的 LCA 還可合并其他全身癥狀，包括肌張力下降、共濟失調、智力障礙及自閉癥等，但部分智力障礙的患者經 MRI 檢查明確診斷為 Joubert 綜合征[43]。NMNAT1 基因與軸突退變相關，NMNAT1 功能缺失，可導致感光細胞的萎縮退化[44]。NMNAT1 突變可導致視力嚴重損害、眼球震顫及 ERG 反應異常，眼底檢查可見視盤蒼白、血管變細及色素改變，雙等位基因突變者還特征性的表現為黃斑缺損[44]。
LCA 的致病基因多且發病機制復雜，其治療主要包括光感受器和 RPE 細胞移植或干細胞移植、基因治療以及藥物治療。LCA 是第 1 個在人類中進行基因治療的疾病，目前已上市的 Luxturna 可用于治療 RPE65 突變引起的 LCA [45]。另外，針對 LRAT、AIPL1、GUCY2D 等基因的治療也處于臨床前期研究，在動物實驗中已取得顯著效果。LCA 已成為最有希望被基因治療攻克的人類遺傳病之一。
LCA 是一種嚴重的遺傳性視網膜病變，具有遺傳異質性與表型多樣性的特點。LCA 的基因研究是目前眼科學與遺傳學的研究熱點，目前約 30% LCA 患者的致病基因尚未明確，明確致病基因及發病機制是基因治療的前提。本文中 3 例患者致病基因及遺傳方式不同，臨床癥狀及眼底表現也各有差異。因此，進一步明確致病基因、臨床工作中注重基因型與相應臨床表型之間的聯系，有助于明確診斷、減少基因檢測費用，并為患者進一步的基因治療奠定基礎。
Leber 先天性黑矇（leber congenital amaurosis，LCA）是一種嚴重的遺傳性致盲性視網膜營養不良，約占遺傳性視網膜疾病的 5%，占學齡兒童盲的 20%，全世界患病率為 1/80 000～1/30 000[1]。德國眼科醫師 Theodor Leber 于 1869 年首先報道了該病[2]。近年來的遺傳學研究相繼發現了 19 個致病基因與 LCA 相關，這些基因編碼的蛋白在視網膜發育和視網膜生理功能中起到多種作用[3]。LCA 具有遺傳異質性與表型多樣性的特點，本文中我們通過全外顯子組測序（whole-exome sequencing，WGS）的方法對 3 例 LCA 患者及其父母進行遺傳學診斷及分型。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
收集 2016 年 6 月—8 月在四川大學華西醫院眼科臨床診斷為 LCA 的患者 3 例。
1.2 研究方法
1.2.1 全身麻醉（全麻）下 RetcamⅡ眼底血管造影檢查
所有患者均在雙眼瞳孔充分散大后，在全麻下，使用廣角數碼視網膜成像系統（RetcamⅡ，美國 Massie 公司）配合鞏膜壓迫器檢查眼底，要求檢查到包含鋸齒緣的全部視網膜，同時配合眼底血管造影檢查留存影像資料。
1.2.2 DNA 提取
監護人簽署知情同意書后，分別采集患者及其父母的外周靜脈血各約 2 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝，用 QIAamp 全血 DNA 提取試劑盒（德國 Qiagen 公司）按其指南提取基因組 DNA。本研究經四川大學華西醫院倫理委員會審批通過，所有研究對象均知情同意。
1.2.3 目標基因捕獲和高通量測序
應用 GenCap 液相捕獲目標基因技術（北京邁基諾公司），對眼科相關基因的編碼外顯子和側翼區域進行捕獲。將先證者的基因組 DNA 片段化，與 GenCap 探針（北京邁基諾公司）混合進行聚合酶鏈反應和雜交。樣品用 MyOne 磁珠（美國 Life Technology 公司）洗滌并重懸于結合緩沖液中。將混合的樣品轉移至含有 80 μL MyOne 磁珠的試管中，并旋轉混勻 1 h。最后，用 Buffer Elute 洗脫 DNA 并在捕獲后進行擴增。富集的文庫用 Illumina HiSeq 2000（美國 Illumina 公司）第二代測序儀進行雙端測序，讀長為 90 bp。
1.2.4 數據篩選和生物信息學分析
目標區域測序后原始數據經過 index 拆分后獲得各個樣本的原始序列，去除測序數據中的接頭和低質量數據（質量值≤20），運用 BWA 軟件比對到參考基因組上，用 GATK 軟件對各個樣本的比對數據進行多態性位點的檢測，對單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入缺失突變（insertion deletion mutations，InDel）等數據進行統計和分析。查找 SNP 及 InDel 在千人基因組及 dbSNP132 數據庫中頻率。利用 SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++ 等數據庫對 SNP 及 InDel 的致病性進行預測分析。
1.2.5 Sanger 測序驗證
根據需要測序的 DNA 片段合成引物（表 1），用聚合酶鏈反應法進行擴增，用 ABI3730xl 測序儀（美國 Applied Biosystems 公司）以 Sanger 測序法進行測序，測序結果與目標區域捕獲測序后的結果進行比對。
表1
引物及產物長度
2 結果
患者 1，女，6 歲。自幼雙眼視力差，合并“先天性腦癱”；父母為近親結婚，眼科檢查均未見異常（圖 1a）。表現為雙眼指壓征（+），雙眼視力不會認，眼球內陷，眼球震顫，結膜無充血，角膜透明，前房深度正常，瞳孔直徑約 5 mm，直接光反射遲鈍，晶狀體透明，全麻下 RetcamⅡ示雙眼底視盤顏色蒼白，邊界清楚，視盤周圍血管閉塞呈“白線”狀，視網膜廣泛椒鹽狀色素改變。熒光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）示雙眼視盤周圍血管充盈欠佳，視網膜廣泛點狀透見熒光（圖 1b）。該患者確診：雙眼 LCA，雙眼視神經萎縮，腦癱。患者未予以治療。患者 1 外周血基因檢測結果發現 SPATA7 純合突變，突變類型為 14 號染色體 5 號外顯子上的插入突變［c.744（E5）至 c.745（E5）插入 T, p.249, L>Ffs4］，其父母攜帶SPATA7 雜合突變，符合常染色體隱性遺傳規律（圖 1c）。
圖1
患者 1 檢查結果
a. 患者家系圖，父母為近親結婚；b. 患者眼底圖，可見雙眼視盤顏色蒼白，視盤周圍血管閉塞呈“白線”狀，視網膜廣泛椒鹽狀色素改變，FFA 示雙眼視盤周圍血管充盈欠佳，視網膜廣泛點狀透見熒光；c. 基因檢測結果：患者父母攜帶
患者 2，男，4 個月。發現雙眼不能追視 2 個月就診，患者父母眼科檢查未見異常（圖 2a）。表現為雙眼指壓征（+），雙眼視力不會認，眼球震顫，結膜無充血，角膜透明，前房深度正常，瞳孔直徑約 5 mm，直接光反射遲鈍，晶狀體透明，全麻下 RetcamⅡ示雙眼底視盤蒼白，視網膜血管變細，周邊視網膜脫色素。FFA 示雙眼視盤強熒光，周邊視網膜可見小片無灌注區，未見熒光素滲漏（圖 2b）。診斷：雙眼 LCA，雙眼視神經萎縮。予以患者鼠神經生長因子肌肉注射治療，2 個月后患者家屬訴患者按壓眼球頻次減少，可追光及自主抓物。患者 2 及其父親外周血基因檢測結果發現 WFS1 雜合突變，突變為 4 號染色體 5 號外顯子 c.535G>A, p.A179T（圖 2c）。
圖2
患者 2 檢查結果
a. 患者家系圖；b. 患者眼底圖，可見雙眼視盤蒼白，視網膜血管變細，FFA 示雙眼視盤強熒光，周邊視網膜可見小片無灌注區；c. 基因檢測結果：患者及父親為
患者 3，女，6 個月。發現患者雙眼無法追視 2+個月就診，患者父母眼科檢查未見異常（圖 3a）。表現為雙眼指壓征（+），眼球內陷，雙眼視力不會認，眼球震顫，結膜無充血，角膜透明，前房深度正常，瞳孔直徑約 4 mm，直接光反射消失，晶狀體透明，全麻下 RetcamⅡ示雙眼視盤蒼白，對稱性黃斑色素上皮萎縮，視網膜、脈絡膜廣泛脫色素及變性，視網膜血管變細，FFA 可見黃斑區不規則邊緣清楚的低熒光區，以及視網膜上廣泛及均勻的斑點狀透見熒光（圖 3b）。診斷：雙眼 LCA，雙眼視神經萎縮。患者未予以治療。患者 3 外周血基因檢測結果發現 CRB1、RPGRIP1、SPATA7 雜合突變。其父親攜帶 RPGRIP1、SPATA7 突變基因，母親攜帶 CRB1 突變基因。CRB1 突變為 1 號染色體 3 號外顯子 c.664G>A, p.E222K。RPGRIP1 突變為 14 號染色體 5 號外顯子 c.775T>C, p.C259R。SPATA7 突變為 14 號染色體 7 號外顯子 c.899T>C, p.I300T（圖 3c～3e）。
圖3
患者 3 檢查結果
a. 患者家系圖；b. 患者眼底圖，眼底照相示雙眼視盤蒼白，對稱性黃斑色素上皮萎縮，視網膜血管變細，視網膜、脈絡膜廣泛脫色素及變性，FFA 示黃斑區不規則邊緣清楚的低熒光區，以及視網膜上廣泛及均勻的斑點狀透見熒光；c～e. 基因檢測結果：患者外周血基因檢測結果發現
3 討論
LCA 的臨床特征為出生時或出生后不久（多在 6 個月之內）即出現視力低下或喪失、眼球震顫、瞳孔反應遲鈍、畏光、指壓征、眼球內陷等。眼底表現個體差異較大，可表現為色素沉著（椒鹽樣、骨細胞樣）、視網膜血管變細、廣泛視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）萎縮，少數患者眼底可無明顯異常。視網膜電圖（electroretinogram，ERG）表現為 a、b 波平坦。由于遺傳異質性，患者同時還可伴有圓錐角膜、白內障、高度遠視、發育遲緩、神經系統及腎、骨骼異常等[4]。
指壓征是 LCA 患者特征性眼部表現，本文 3 例患者均出現指壓征（+）。指壓征是指反復用手指或者指關節戳、按壓或者摩擦眼球，其具體發生機制不明確，推測此動作可能使患者產生閃光感及幻視。指壓征時手指持續壓迫眼球，導致眶脂肪萎縮，進而引起眼球內陷，也有學者認為，指壓征與 LCA 患者圓錐角膜形成有關[5]。
LCA 一般呈常染色體隱性遺傳，也有少數呈常染色體顯性遺傳[6-7]。目前共確定了該病的 19 個致病基因，解釋了大約 70% 患者的致病原因[3]。已發現的基因包括 GUCY2D[8]、RPE65[9]、SPATA7[10]、AIPL1[11]、LCA5[12]、RPGRIP1[13]、CRX[14]、CRB1[15]、NMNAT1[16]、CEP290[15]、RD3[17]、IMPDH1[16]、RDH12[18]、LRAT[19]、TULP1[20]、KCNJ13[21]、IQCB1（也稱為 NPHP5）[22-23]、MERTK[24]以及 OTX2[25]。LCA 基因編碼的蛋白涉及多種視網膜功能，包括視網膜內維生素 A 的代謝循環（RPE65、RDH12、LRAT）、鳥嘌呤的合成（IMPDH1）、錐細胞外節的吞噬作用（MERTK）、光感受器纖毛轉運過程（CEP290、LCA5、RPGRIP1、TULP1）、視網膜光電信號的傳導過程（APL1、GUCY2D）、視網膜光感受器細胞的分化和發育（CRB1、CRX）以及蛋白轉運和分布（AIPL1、RPGRIP1）[6]。
在患者 1 中，患者眼部癥狀出現早，眼部表現為視力差、指壓征（+）及眼球震顫，眼底檢查見視盤蒼白、血管閉塞及視網膜廣泛椒鹽狀色素改變，符合 LCA 臨床診斷。且患者外周血基因檢測結果證實為 SPATA7 基因純合突變，突變類型為 14 號染色體 5 號外顯子上的插入突變［c.744（E5）至 c.745（E5）插入 T, p.249, L>Ffs4］，為已知 LCA 致病基因的未知位點異常。患者父母為近親結婚，眼部表現正常，攜帶SPATA7 致病基因，符合常染色體隱性遺傳規律。SPATA7 在人體組織中廣泛表達，尤其在視網膜、腦組織和睪丸中高表達，其存在 2 種亞型，亞型 1 主要在神經組織和視網膜中高表達，亞型 2 主要在睪丸組織中高表達[10]。SPATA7 編碼蛋白的功能尚不明確，因此 SPATA7 突變導致 LCA 的分子機制尚不清楚。且 SPATA7 在腦組織和睪丸組織中高表達，其突變可能導致多系統病變和生殖功能異常。SPATA7 突變導致 LCA 臨床特點為早期發生嚴重的視網膜萎縮和視功能損害，眼底檢查可見視盤色淡、動脈變細、RPE 萎縮及視網膜色素沉著[10]。Mackay 等[26]研究發現 SPATA7 突變導致的 LCA 患者臨床表現包括早期嚴重視力下降、眼球震顫及瞳孔對光反應遲鈍，眼底表現為廣泛 RPE 萎縮、血管變細及視盤蒼白，ERG 結果提示視錐及視桿反應波形消失，部分患者還伴有聽力喪失。且該患者同時合并腦癱，因 SPATA7 同時在腦組織中高表達，兩者之間是否有關聯還需進一步證實。
患者 2 中，患者在出生后即發病，眼部表現為指壓征（+）、眼球震顫、瞳孔光反射遲鈍及眼底視神經萎縮，符合 LCA 臨床診斷。但患者外周血基因檢測結果發現 WFS1 雜合突變，目前尚無研究證實 WFS1 是 LCA 的致病基因之一。但 Wang 等[27]在中國 LCA 患者中發現 WFS1 突變，推測 WFS1 可能與 LCA 發病密切相關，有待進一步研究證實。WFS1 可表達于胰島 β 細胞上，編碼跨膜蛋白 Wolframin，其在抑制胰島 β 細胞凋亡及維持內質網穩態方面有至關重要[28]。Kawano 等[29]發現 WFS1 表達于無長突細胞及 Müller 細胞，WFS1 突變可影響神經節細胞存活甚至進一步導致視神經萎縮。Wolfram 綜合征是一種常染色體隱性遺傳性神經退行性疾病，目前已證實 Wolfram 綜合征與 WFS1 突變有關，主要表現為糖尿病、視神經萎縮、耳聾及尿崩癥[30]。
患者 3 中，患者在 1 歲以內發病，眼部癥狀包括雙眼指壓征（+）、眼球內陷、眼球震顫、瞳孔光反射消失、眼底視神經及黃斑色素上皮萎縮、視網膜血管變細及色素改變，符合 LCA 臨床表現。患者外周血基因檢測結果發現 CRB1、RPGRIP1、SPATA7 雜合突變，此 3 種基因均為已明確 LCA 致病基因。患者父母眼部表現正常，其父親攜帶 RPGRIP1、SPATA7 突變基因，母親攜帶 CRB1 突變基因，不符合 LCA 遺傳特征，存在的原因可能包括：① 目前基因診斷水平限制；② 部分常染色體隱性遺傳患者，在單點突變的情況下也可能致病；③ 該患者的 3 個已發現的致病基因，并非來自父親或者母親一方，而是來自雙方，不排除 3 個致病基因同時存在導致患者出現臨床癥狀。CRB1 編碼的蛋白質是含有 1 406 個氨基酸的跨膜蛋白，主要位于 Müller 細胞近頂點區細胞膜上，參與維持細胞極性和上皮細胞間的連接。CRB1 突變后導致視網膜發育缺陷，可出現視網膜變厚及層次結構不清，類似于未發育成熟的視網膜[31]。CRB1 突變患者可出現嚴重視力下降、遠視、黃斑萎縮，部分患者眼底可出現類似 coats 病表現，視網膜毛細血管擴張、視網膜滲出及視網膜脫離[32]。該患者 CRB1 突變為 1 號染色體 3 號外顯子的突變 c.664G>A, p.E222K。Li 等[24]在中國漢族 LCA 患者中也發現該錯義突變，但因其同時在正常人中檢測出，認為該突變為一種未被發現的 SNP。RPGRIP1 編碼的蛋白質參與調節纖毛間的蛋白質轉運及光感受器外節膜盤的更新，RPGRIP1 突變后將導致視網膜萎縮及嚴重的功能損害[33]。Hanein 等[34]總結 RPGRIP1 突變患者的臨床特征包括：畏光、遠視（度數<+7D）、視力從數指到 20/400 不等，早期眼底可出現視網膜變性。Galvin 等[35]發現 RPGRIP1 突變患者在 10 歲之前視力會下降到光感甚至無光感。
LCA 具有遺傳異質性與表型多樣性的特點，認識不同基因型的臨床表型特點，有助于縮小基因篩查的范圍，進一步為基因治療提供依據。LCA 患者視功能損害的嚴重程度和進展速度與基因型存在一定關系。LCA 患者視力通常從 20/200 到光感甚至無光感不等。CRB1、LCA5 及 RPE65 突變患者可表現為視力短暫性提高，穩定一段時間后又下降[6, 36]。CEP290 和 GUCY2D 突變患者可表現為視力嚴重下降且保持穩定[37-38]。AILP1 和 RPGRIP1 突變患者可表現為進行性視力下降[39-40]。GUCY2D 基因編碼的蛋白位于視錐和視桿光感受器的細胞核和內節中，突變后導致類似光持續照射的情況，不能恢復為暗反應[35]。GUCY2D 突變患者臨床上多表現為視功能嚴重損害，眼底大致正常，畏光明顯。Gradstein 等[38]在 1 個 GUCY2D 突變導致的 LCA 家系中發現，8 例患者均在 1 歲以內均出現嚴重視力下降，而眼底表現為正常或者輕度異常，該家系部分患者還合并圓錐角膜、白內障以及眼球震顫。RPE65 參與 RPE 細胞內視紫紅質合成和循環，Lorenz 等[41]發現 4 個 RPE65 突變患者在嬰兒期會出現明顯的視力損害，而在 6～10 歲時出現視力提高。CEP290 編碼的蛋白調節纖毛生成并參與纖毛間的微管轉運，CEP290 還與 Joubert 綜合征等多系統疾病相關[42]。CEP290 突變患者可表現為早期嚴重的視力下降，出生后視力即光感甚至無光感，可伴高度遠視、眼球震顫等，ERG 檢查重度異常，眼底可表現為視網膜血管變細、RPE 層萎縮以及視網膜骨細胞樣色素沉著，但晚期黃斑區視網膜仍可保留光感受器細胞[37]。另有報道指出 CEP290 突變導致的 LCA 還可合并其他全身癥狀，包括肌張力下降、共濟失調、智力障礙及自閉癥等，但部分智力障礙的患者經 MRI 檢查明確診斷為 Joubert 綜合征[43]。NMNAT1 基因與軸突退變相關，NMNAT1 功能缺失，可導致感光細胞的萎縮退化[44]。NMNAT1 突變可導致視力嚴重損害、眼球震顫及 ERG 反應異常，眼底檢查可見視盤蒼白、血管變細及色素改變，雙等位基因突變者還特征性的表現為黃斑缺損[44]。
LCA 的致病基因多且發病機制復雜，其治療主要包括光感受器和 RPE 細胞移植或干細胞移植、基因治療以及藥物治療。LCA 是第 1 個在人類中進行基因治療的疾病，目前已上市的 Luxturna 可用于治療 RPE65 突變引起的 LCA [45]。另外，針對 LRAT、AIPL1、GUCY2D 等基因的治療也處于臨床前期研究，在動物實驗中已取得顯著效果。LCA 已成為最有希望被基因治療攻克的人類遺傳病之一。
LCA 是一種嚴重的遺傳性視網膜病變，具有遺傳異質性與表型多樣性的特點。LCA 的基因研究是目前眼科學與遺傳學的研究熱點，目前約 30% LCA 患者的致病基因尚未明確，明確致病基因及發病機制是基因治療的前提。本文中 3 例患者致病基因及遺傳方式不同，臨床癥狀及眼底表現也各有差異。因此，進一步明確致病基因、臨床工作中注重基因型與相應臨床表型之間的聯系，有助于明確診斷、減少基因檢測費用，并為患者進一步的基因治療奠定基礎。
