引用本文： 趙小丹, 劉浩, 黃富國, 劉熹, 鄧宇驍. Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白在不同損傷類型動物模型椎間盤組織內的含量變化規律 . 華西醫學, 2018, 33(9): 1146-1152. doi: 10.7507/1002-0179.201807150 復制
椎間盤損傷后加速退變是影響脊柱骨折患者功能恢復的重要因素，并逐漸引起國內外學者的重視。已有的研究發現椎間盤損傷后組織周圍存在明確的炎癥反應過程[1]。與其他膠原蛋白相比較，椎間盤組織內Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量最高，它們是椎間盤發揮其生理功能的分子基礎[2]。纖維環內膠原大部分為Ⅰ型膠原，占椎間盤Ⅰ型膠原總量的 80%。由外向內Ⅰ型膠原很快減少，Ⅱ型膠原顯著增多。在椎間盤髓核組織內，Ⅱ型膠原的含量為 80% 左右，而Ⅰ型膠原的含量很低。正常的軟骨細胞主要分泌Ⅱ型膠原原纖維。研究表明：在椎間盤退變過程中，軟骨細胞內Ⅱ型膠原的信使 RNA（messenger RNA，mRNA）水平下降，以及Ⅰ型前膠原的合成開始增加打破了椎間盤內膠原組成的比例平衡，致使椎間盤無法發揮原有的生理性能[3]。在自身組織結構及力學環境改變的共同作用下，椎間盤內Ⅰ型膠原含量進一步上升，Ⅱ型膠原含量不斷下降，Ⅰ/Ⅱ型膠原在椎間盤內的相對比例不斷增大，形成一個惡性循環。那么作為椎間盤合成分泌膠原的主要功能細胞，軟骨細胞在椎間盤損傷后不同階段，在各種細胞因子的刺激下，細胞內Ⅰ、Ⅱ型膠原 mRNA 的水平變化直接可以反映其生理功能變化規律，而上述變化的研究結果有助于揭示損傷椎間盤加速退變的分子細胞基礎。
基于上述已有研究結果，我們建立了新西蘭大白兔的椎間盤損傷模型，通過定量檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原 mRNA 的變化水平，探討損傷椎間盤的具體病理變化過程，為未來尋找相應生物治療的靶點提供依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選取健康成年新西蘭大白兔 40 只（由四川大學華西醫院動物實驗中心提供），由四川大學華西動物實驗中心標準化喂養。經腰椎 MRI 和計算機 X 線掃描檢查，排除脊柱的先天畸形和椎間盤退變后納入實驗。其中雌性 22 只，雄性 18 只，平均年齡 8 個月，平均體質量（3.0±0.5）kg。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗動物分組
采用隨機數字表法將納入的 40 只新西蘭大白兔分為 4 組，包括纖維環穿刺組、上位軟骨終板單次穿刺組、上下位軟骨終板多次穿刺組與假手術對照組，每組各 10 只實驗動物。
1.2.2 新西蘭大白兔椎間盤損傷模型的建立
動物手術選擇經側方腹膜外入路顯露椎間盤，在順利暴露實驗動物目標椎間盤后，按照術前制定的實驗計劃對其進行不同的椎間盤手術操作（圖 1）。
① 纖維環穿刺組：分別用 18 G 針頭在暴露目標椎間盤進行穿刺。以針頭帽制作的套筒為保護裝置，控制刺入深度為 5 mm（新西蘭大白兔纖維環平均厚度為 2.8 mm，可以確保穿過纖維環全層），由纖維環前外側方平行終板方向刺入椎間盤中央，刺入并維持 5 s 后從原有針道拔出穿刺針頭。
② 上位軟骨終板單次穿刺組：采用腹膜外手術入路暴露出最尾段 4 個腰椎（lumbar，L）椎間盤（L3–4、L4–5、L5–6、L6–7）后，分別用消毒的 18 G 注射針頭，以 45° 從距椎間盤上位終板 2～3 mm 處椎體正前方單次刺入穿破椎間盤上位軟骨終板。有明顯落空感后，表明已穿破終板進入目標椎間盤髓核內，維持 10 s 以后，從原有針道退出。
③ 上下位軟骨終板多次穿刺組：同樣采用纖維環穿刺組的損傷模型操作方式，采用 18 G 注射針頭，以 45° 從距目標椎間盤上、下位終板 2～3 mm 處椎體左側及正前方刺入穿破椎間盤上、下位軟骨終板。有明顯落空感后，表明已穿破終板進入目標椎間盤髓核內，停留 10 s 以后，從原有針道退出。
④ 假手術對照組：手術準備及暴露椎間盤內與前面 3 組沒有差異，椎間盤顯露以后不進行破壞椎間盤的相關手術操作。
分別于動物建模手術術后第 2 天及第 2、8、12、24 周在每組中隨機選取 2 只實驗動物，采用經耳緣靜脈注入空氣 10 mL 處死實驗動物各 2 只。獲取目標椎間盤，取下的椎間盤標本充分蒸餾水沖洗，洗凈血液及其他軟組織后，去除軟骨下骨，用手術刀沿軟骨終板下緣與纖維環交界處切開軟骨終板后，小心分離纖維環內的髓核組織，將以上結構標本編號后置于消毒的 EP 管中，稱重并記錄結果后，置于深低溫冰箱內 – 70℃ 條件下凍存備用。
圖1
椎間盤損傷模型示意圖
白箭表示手術穿刺部位；a. 纖維環穿刺組；b. 上位軟骨終板單次穿刺組；c. 上下位軟骨終板多次穿刺組
1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）測定椎間盤軟骨終板細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原 mRNA 水平
1.3.1 軟骨終板組織的 RNA 提取
加入 Trizol 試劑的軟骨終板組織混懸液置于玻璃勻漿器中反復研磨，使其充分裂解。 反復溶劑處理離心后的 RNA 沉淀在室溫條件下干燥 6～8 min，視沉淀量加入 20～30 μL 焦碳酸二乙酯水，55℃ 孵育 10 min 使 RNA 沉淀的溶解。
1.3.2 樣本 RNA 的檢測
提取的 RNA 樣本取 5 μL 用 0.5×TBE（Tris 硼酸，一種 PCR 技術中用到的緩沖液）稀釋成 500 μL，于核酸測定儀上測定 RNA 濃度及 RNA 濃度與蛋白濃度比值 A260/A280，選用比值在 1.80～2.00 的樣品標本，其比值在 1.60 以下的棄用。
1.3.3 逆轉錄
逆轉錄采用 Revertaid M-Mulv 逆轉錄酶，按照廠商提供的步驟進行。逆轉錄成互補 DNA（complementary DNA，cDNA），置 – 20℃ 保存備用。
1.3.4 引物設計
參照文獻[4] 進行引物設計。Ⅰ型膠原序列：上游引物：5’-TCCAAAGGAGAGAGCGGTAA-3’，下游引物：5’-GACCAGGGAGACCAAACTCA-3’；擴增參數：95℃ 變性 45 s，56℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 45 s，30 個循環。內對照采用 β-actin：上游引物：5’-AGGTTTCCTCTCTCGCCATT-3’，下游引物：5’-CTGGTCCCTCGGTTTGAGT-3’；擴增參數：95℃ 變性 20 s，56℃ 退火 20 s，72℃ 延伸 1 min，25 個循環。
Ⅱ型膠原序列：上游引物： 5’-GCTCCCAGAACATCGCCTACC-3’，下游引物： 5’-TGAACCTGCTATTGCCCTCT-3’；擴增參數：95℃ 變性 45 s，56℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 45 s，30 個循環。內對照采用 β-actin：上游引物：5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGA-3’，下游引物：5’-ATGGATGATGATATCGCCGC-3’；擴增參數：95℃ 變性 20 s，56℃ 退火 20 s，72℃ 延伸 1 min，25 個循環。
有內對照 β-actin 的為 Marker 組，該組含有標準量的 β-actin，無其他實驗組標本成分，以其擴增測定的灰度值為標準，作為其他實驗組測定灰度值的標準對照，本實驗將實驗組灰度值與 Marker 組灰度值的比值作為關鍵的實驗數據進行收集整理和比較。無 cDNA 模板的反應組，其標本內未添加 β-actin 及其他實驗組標本成分，作為瓊脂糖凝膠電泳的空白對照組，理論上不會在特定目標位置瓊脂糖凝膠電泳的掃描圖上顯影，該組的設定是為了排除可能來源于污染的基因組 DNA 的擴增。
1.3.5 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）
建立 PCR 反應體系，用 0.5×TBE 電泳緩沖液配制 2% 的瓊脂糖凝膠電泳（120 V，40 min），紫外燈下觀察擴增結果，并于凝膠成像儀上掃描存圖分析。測定不同電泳條帶的灰度值，其數值與內對照 β-actin（Marker 組）的灰度值的比值作為 PCR 產物灰度值比較相對強度。所以標本的相對強度=實驗組目的基因強度/β-actin 基因強度×100%。收集相對強度的比值作為實驗數據整理后備下一步進行統計學分析。
1.3.6 實驗椎間盤甲苯胺藍（toluidine blue，TB）染色
為進一步明確椎間盤軟骨終板的軟骨細胞形態及極性，采用 TB 染色。由于椎間盤損傷 8 周左右是損傷椎間盤病理生理改變的關鍵節點，因此在本實驗中選取術后 8 周實驗動物的 TB 染色結果進行病理組織觀察。且由于只有軟骨終板內有椎間盤軟骨細胞，故只選取了上位軟骨終板單次穿刺組及上下位軟骨終板多次穿刺組的軟骨細胞進行了描述和觀察。
1.4 觀察指標
各實驗組Ⅰ、Ⅱ型膠原 RT-PCR 的合成量隨時間變化的灰度值的相對強度數值，由于術后 12 周為此次動物實驗的觀察時間的中點，膠原含量變化改變明顯，故選用術后 12 周來觀察各組Ⅰ、Ⅱ型膠原 RT-PCR 檢測結果。同時收集整理各組實驗標本的Ⅰ型膠原 mRNA 的相對強度（Ⅰ型膠原 mRNA 的相對強度=實驗組目的基因強度/β-actin 基因強度×100%），這一比值可以反映其Ⅰ型膠原合成量的變化情況，因此將其作為實驗數據整理后備下一步進行統計學分析。觀察術后 8、24 周椎間盤標本中軟骨終板的 TB 染色病理結果，及與假手術對照組比較其炎癥改變及纖維化的具體病理改變過程。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 18.0 統計學軟件對實驗數據進行統計分析。實驗結果以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，各組數據之間兩兩比較則采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α（雙側）=0.05。
2 結果
2.1 Ⅰ型膠原 mRNA 的檢測結果
Ⅰ型膠原 mRNA 顯影位置在 500～700 bp，確認 RT-PCR 擴增的目標片段無誤（圖 2）。
圖2
術后 12 周各組Ⅰ型膠原 RT-PCR 電泳圖
1：Marker 組；2：纖維環穿刺組；3：上位軟骨終板單次穿刺組；4：上下位軟骨終板多次穿刺組；5：假手術對照組；6：實驗空白組
從術后 2 周開始，各手術組Ⅰ型膠原 mRNA 水平開始升高，與假手術對照組相比差異均有統計學意義（P<0.05）。在上下位軟骨終板多次穿刺組軟骨細胞內，其術后Ⅰ型膠原 mRNA 的表達水平明顯升高，在術后 2、8、12、24 周該組Ⅰ型膠原 mRNA 的表達水平均高于纖維環穿刺組及上位軟骨終板單次穿刺組，差異有統計學意義（P<0.05）。纖維環穿刺組術后Ⅰ型膠原 mRNA 的表達水平持續上升，在術后第 24 周與假手術對照組相比較，mRNA 的水平升高了 38%（P<0.05）；上位軟骨終板單次穿刺組及上下位軟骨終板多次穿刺組其術后軟骨細胞內Ⅰ型膠原 mRNA 的表達水平在術后 12 周達到高峰，保持穩定；在術后第 24 周，其 mRNA 的水平與假手術對照組相比較分別升高了 43% 和 69%（P<0.05）。見表 1。
表1
椎間盤軟骨細胞Ⅰ型膠原合成量的相對強度比值 （
）
2.2 Ⅱ型膠原 mRNA 的檢測結果
Ⅱ型膠原 mRNA 顯影位置在 200～300 bp，確認 RT-PCR 擴增的目標片段無誤（圖 3）。
術后 24 周，各手術組Ⅱ型膠原合成量明顯下降，與假手術對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。纖維環穿刺組及上位軟骨終板單次穿刺組，術后 2 周其Ⅱ型膠原 mRNA 的表達水平上升，與假手術組相比較，mRNA 的水平分別升高了 35% 及 51%（P<0.05）。從術后 8 周開始，纖維環穿刺組及上位軟骨終板單次穿刺組 mRNA 的水平進行性下降，到術后 24 周，與假手術對照組相比較，mRNA 的水平分別下降了 27%、31%（P<0.05）。上下位軟骨終板多次穿刺組自術后 2 周開始即呈現出進行性下降的趨勢，整個術后 24 周時間 5 個觀測時間點均未出現Ⅱ型膠原 mRNA 水平的升高，與假手術對照組相比，該組術后 24 周 mRNA 的水平下降了 48%（P<0.05）。見表 2。
圖3
術后 12 周Ⅱ型膠原 RT-PCR 電泳圖
1：Marker 組；2：纖維環穿刺組；3：實驗空白組；4：假手術對照組；5：上位軟骨終板單次穿刺組；6：上下位軟骨終板多次穿刺組
表2
椎間盤軟骨細胞Ⅱ型膠原合成量的相對強度比值（
）
2.3 TB 染色結果
術后 8 周，對損傷椎間盤的軟骨細胞行 TB 染色，其為典型的石榴樣形態。且與假手術對照組的正常椎間盤（圖 4a）相比，上下位軟骨終板多次穿刺組軟骨終板結構紊亂，厚度變薄，細胞數量減少，組織極性紊亂；同時還可以觀察到在終板受損部位軟骨終板髓核側松質骨結構紊亂，大量血細胞、血小板及炎癥細胞浸潤（圖 4b）。
隨著時間的延續，在術后 24 周，上下位軟骨終板多次穿刺組穿刺部位形成的軟骨缺損，未觀察到有軟骨組織增生、修復軟骨終板，而卻可以明確觀察到纖維樣組織結構長入并修復缺損（圖 4c）。
圖4
椎間盤 TB 染色結果
a. 術后 8 周假手術對照組（TB ×200）；b. 術后 8 周上下位軟骨終板多次穿刺組（TB ×200）；c. 術后 24 周上下位軟骨終板多次穿刺組椎間盤軟骨終板（TB ×400），穿刺部位有明顯軟骨缺損，非軟骨樣組織已長入填補缺損，周圍有炎性細胞浸潤（黃箭）
3 討論
3.1 Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白在不同椎間盤損傷模型中的變化特點
膠原纖維是椎間盤組織中重要的大分子結構，作為椎間盤內最主要的兩種膠原類型，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白在椎間盤退變的相關研究中扮演了十分重要的角色。在許多基礎實驗中，研究人員都通過檢測其含量變化作為評估退變嚴重程度的指標。既往的研究顯示在椎間盤自然退變過程中，椎間盤內Ⅱ型膠原含量不斷下降，而Ⅰ型膠原總量進行性上升，Ⅰ型膠原在椎間盤內的相對比例不斷增大，導致椎間盤力學性能的改變[1-2]。在本實驗中，損傷椎間盤軟骨細胞內Ⅰ型膠原的 mRNA 的水平在損傷早期上升的幅度不明顯。而在損傷 8 周以后，Ⅰ型膠原的 mRNA 水平上升速度加快，其上升幅度與椎間盤的損傷程度密切相關。在未有任何外加細胞因子作用下，軟骨細胞分泌Ⅰ型膠原能力的增強進一步提示：損傷椎間盤在損傷早期即開始呈現出典型的組織纖維化病理過程。
在此次研究中，更值得關注的是損傷椎間盤內Ⅱ型膠原的變化特點。通過對不同時間點損傷椎間盤內軟骨細胞Ⅱ型膠原的 mRNA 水平的檢測，我們發現了一個有趣的現象：不同于椎間盤自然退變過程中Ⅱ型膠原的進行性下降，在椎間盤損傷的早期，特別是術后 2 周，損傷椎間盤內Ⅱ型膠原的 mRNA 水平并沒有呈現下降的趨勢，在纖維環穿刺組及上位軟骨終板單次穿刺組中，其水平呈現一過性的升高。而在上下位軟骨終板多次穿刺組，Ⅱ型膠原的合成卻表現為進行性下降。同為損傷，如何解釋上述現象的發生，我們認為：在損傷程度較輕的椎間盤動物模型中，損傷早期出現的各種纖維化相關的細胞因子：如轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），輔助性 T 細胞相關細胞因子［白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-4、IL-13］其濃度水平較低。低濃度細胞因子刺激下的軟骨細胞功能活躍，Ⅱ型膠原分泌增加；而在上下位軟骨終板多次穿刺組，通過本課題組相關實驗的免疫組織化學結果發現，上述因子在上述損傷部位的陽性表達率明顯增加，由此推測：手術操作造成的椎間盤損傷嚴重。TGF-β 被肥大細胞大量釋放并激活，導致其在椎間盤組織內濃度增高明顯。而 TGF-β 作為目前公認的組織纖維化過程中最為重要的細胞因子[5]在不同濃度下對軟骨細胞的作用結果截然不同：軟骨細胞在較低濃度 TGF-β 作用下，可以加速Ⅱ型膠原分泌及軟細胞增殖。在高濃度作用下，TGF-β 下游的重要細胞因子結締組織生長因子的 mRNA 水平明顯上調，軟骨細胞發生細胞表現型轉化，其分泌Ⅰ型膠原顯著增多。這一研究結果可以解釋本實驗中上述現象的發生。在未來相關研究中，觀察多種細胞因子在其不同濃度下對椎間盤細胞生物學行為可能會對揭示不同形式、不同損傷程度造成的椎間盤退變提供更為有力的實驗依據。
3.2 研討未來損傷椎間盤動物模型的改進
在既往椎間盤退變動物模型的建立過程中，不同損傷形式（包括纖維環穿刺、終板破壞）都可以造成椎間盤的加速退變[6-7]。目前絕大部分動物椎間盤退變模型建立的目標都是為研究人類椎間盤由于年齡老化引起的椎間盤自然退變過程。而作為一個理想的椎間盤退變模型，應該滿足以下幾個條件[8-9]：① 與人椎間盤的自然退變過程具有相似性，能再現椎間盤退行性改變的客觀規律；② 良好的可重復性；③ 操作方式的易行性和經濟性。而在此次實驗過程中，我們發現損傷椎間盤引起加速退變的過程是一個纖維化修復的過程，與常見的椎間盤自然退變過程存在一定的差異。主要表現在：在實驗過程中我們明確觀察到椎間盤細胞在損傷后即開始出現 α-平滑肌肌動蛋白的表達，隨后出現轉分化等組織纖維化過程特有的病理特征，而這在椎間盤自然退變的相關研究中還未有類似的研究結果。在本實驗中，促纖維化細胞因子在不同損傷形式椎間盤模型中，無論是表達的部位、強度還是出現時間上都有一定的差異。這些也與椎間盤自然退變的相關研究結果存在一定差異，提示損傷椎間盤的病理過程可能不同于椎間盤的自然退變。損傷程度較輕的椎間盤軟骨細胞早期Ⅱ型膠原的 mRNA 水平升高，隨著時間的推移又開始緩慢下降的過程與自然退變相比較也存在一定差異。
綜上所述，目前經典的椎間盤退變模型可能還無法真正滿足理想椎間盤動物模型的標準。在未來的研究中，建立更加接近正常自然退變過程的椎間盤動物模型可能會對人類進一步加深椎間盤相關疾病的了解提供更多、更有價值的信息。
3.3 阻斷損傷椎間盤加速退變的可能分子生物學途徑
IL-13 是近年來組織纖維化研究的熱點，已有的研究顯示：IL-13 可與 TGF-β1 共同作用參與組織纖維化過程，同時也可像 IL-4 一樣單獨誘導組織纖維化發生，同時也是椎間盤退變中的重要分子生物學靶點。最近研究發現：人及動物組織中存在一種 IL-13 的誘導受體[10]，與 IL-13 結合后，可有效阻斷其相關生物學功能。目前國內外學者都致力于通過各種方法阻斷纖維化相關細胞因子的生理作用進而減緩纖維化過程的發生，諸如基因敲除纖維化相關基因、抗體中和及受體封閉等方式。而可溶性白細胞介素-13 受體 α2（soluble interleukin-13 receptor-α2，sIL-13Rα2）的發現及相關研究結果為阻斷 IL-13 在纖維化過程中的作用提供了新的、更可行的選擇[11]。IL-13Rα2 被稱為 IL-13 的誘導受體，與 IL-13R 結合后，可有效阻斷其相關的細胞傳導通路。有研究檢測曼氏血吸蟲病患者外周血單核細胞細胞培養上清液中的 IL-13 含量，結果發現 IL-13Rα2 是下調曼氏血吸蟲病 IL-13 所致組織纖維化的重要因子[12]。而采用 sIL-13Rα2 融合蛋白（sIL-13Rα2-Fc）處理感染了曼氏血吸蟲的野生鼠，其肝臟細胞外基質的沉積量減少 85%。以上研究皆表明：sIL-13Rα2 可有效阻斷 IL-13 在纖維化過程中的相關作用，減少損傷組織內異常細胞外基質的沉積。那么在損傷椎間盤內，sIL-13Rα2 是否具有類似的阻斷效果進而減緩損傷椎間盤的退變過程，可能成為未來損傷椎間盤治療方面新的研究方向。
椎間盤損傷后加速退變是影響脊柱骨折患者功能恢復的重要因素，并逐漸引起國內外學者的重視。已有的研究發現椎間盤損傷后組織周圍存在明確的炎癥反應過程[1]。與其他膠原蛋白相比較，椎間盤組織內Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量最高，它們是椎間盤發揮其生理功能的分子基礎[2]。纖維環內膠原大部分為Ⅰ型膠原，占椎間盤Ⅰ型膠原總量的 80%。由外向內Ⅰ型膠原很快減少，Ⅱ型膠原顯著增多。在椎間盤髓核組織內，Ⅱ型膠原的含量為 80% 左右，而Ⅰ型膠原的含量很低。正常的軟骨細胞主要分泌Ⅱ型膠原原纖維。研究表明：在椎間盤退變過程中，軟骨細胞內Ⅱ型膠原的信使 RNA（messenger RNA，mRNA）水平下降，以及Ⅰ型前膠原的合成開始增加打破了椎間盤內膠原組成的比例平衡，致使椎間盤無法發揮原有的生理性能[3]。在自身組織結構及力學環境改變的共同作用下，椎間盤內Ⅰ型膠原含量進一步上升，Ⅱ型膠原含量不斷下降，Ⅰ/Ⅱ型膠原在椎間盤內的相對比例不斷增大，形成一個惡性循環。那么作為椎間盤合成分泌膠原的主要功能細胞，軟骨細胞在椎間盤損傷后不同階段，在各種細胞因子的刺激下，細胞內Ⅰ、Ⅱ型膠原 mRNA 的水平變化直接可以反映其生理功能變化規律，而上述變化的研究結果有助于揭示損傷椎間盤加速退變的分子細胞基礎。
基于上述已有研究結果，我們建立了新西蘭大白兔的椎間盤損傷模型，通過定量檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原 mRNA 的變化水平，探討損傷椎間盤的具體病理變化過程，為未來尋找相應生物治療的靶點提供依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選取健康成年新西蘭大白兔 40 只（由四川大學華西醫院動物實驗中心提供），由四川大學華西動物實驗中心標準化喂養。經腰椎 MRI 和計算機 X 線掃描檢查，排除脊柱的先天畸形和椎間盤退變后納入實驗。其中雌性 22 只，雄性 18 只，平均年齡 8 個月，平均體質量（3.0±0.5）kg。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗動物分組
采用隨機數字表法將納入的 40 只新西蘭大白兔分為 4 組，包括纖維環穿刺組、上位軟骨終板單次穿刺組、上下位軟骨終板多次穿刺組與假手術對照組，每組各 10 只實驗動物。
1.2.2 新西蘭大白兔椎間盤損傷模型的建立
動物手術選擇經側方腹膜外入路顯露椎間盤，在順利暴露實驗動物目標椎間盤后，按照術前制定的實驗計劃對其進行不同的椎間盤手術操作（圖 1）。
① 纖維環穿刺組：分別用 18 G 針頭在暴露目標椎間盤進行穿刺。以針頭帽制作的套筒為保護裝置，控制刺入深度為 5 mm（新西蘭大白兔纖維環平均厚度為 2.8 mm，可以確保穿過纖維環全層），由纖維環前外側方平行終板方向刺入椎間盤中央，刺入并維持 5 s 后從原有針道拔出穿刺針頭。
② 上位軟骨終板單次穿刺組：采用腹膜外手術入路暴露出最尾段 4 個腰椎（lumbar，L）椎間盤（L3–4、L4–5、L5–6、L6–7）后，分別用消毒的 18 G 注射針頭，以 45° 從距椎間盤上位終板 2～3 mm 處椎體正前方單次刺入穿破椎間盤上位軟骨終板。有明顯落空感后，表明已穿破終板進入目標椎間盤髓核內，維持 10 s 以后，從原有針道退出。
③ 上下位軟骨終板多次穿刺組：同樣采用纖維環穿刺組的損傷模型操作方式，采用 18 G 注射針頭，以 45° 從距目標椎間盤上、下位終板 2～3 mm 處椎體左側及正前方刺入穿破椎間盤上、下位軟骨終板。有明顯落空感后，表明已穿破終板進入目標椎間盤髓核內，停留 10 s 以后，從原有針道退出。
④ 假手術對照組：手術準備及暴露椎間盤內與前面 3 組沒有差異，椎間盤顯露以后不進行破壞椎間盤的相關手術操作。
分別于動物建模手術術后第 2 天及第 2、8、12、24 周在每組中隨機選取 2 只實驗動物，采用經耳緣靜脈注入空氣 10 mL 處死實驗動物各 2 只。獲取目標椎間盤，取下的椎間盤標本充分蒸餾水沖洗，洗凈血液及其他軟組織后，去除軟骨下骨，用手術刀沿軟骨終板下緣與纖維環交界處切開軟骨終板后，小心分離纖維環內的髓核組織，將以上結構標本編號后置于消毒的 EP 管中，稱重并記錄結果后，置于深低溫冰箱內 – 70℃ 條件下凍存備用。
圖1
椎間盤損傷模型示意圖
白箭表示手術穿刺部位；a. 纖維環穿刺組；b. 上位軟骨終板單次穿刺組；c. 上下位軟骨終板多次穿刺組
1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）測定椎間盤軟骨終板細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原 mRNA 水平
1.3.1 軟骨終板組織的 RNA 提取
加入 Trizol 試劑的軟骨終板組織混懸液置于玻璃勻漿器中反復研磨，使其充分裂解。 反復溶劑處理離心后的 RNA 沉淀在室溫條件下干燥 6～8 min，視沉淀量加入 20～30 μL 焦碳酸二乙酯水，55℃ 孵育 10 min 使 RNA 沉淀的溶解。
1.3.2 樣本 RNA 的檢測
提取的 RNA 樣本取 5 μL 用 0.5×TBE（Tris 硼酸，一種 PCR 技術中用到的緩沖液）稀釋成 500 μL，于核酸測定儀上測定 RNA 濃度及 RNA 濃度與蛋白濃度比值 A260/A280，選用比值在 1.80～2.00 的樣品標本，其比值在 1.60 以下的棄用。
1.3.3 逆轉錄
逆轉錄采用 Revertaid M-Mulv 逆轉錄酶，按照廠商提供的步驟進行。逆轉錄成互補 DNA（complementary DNA，cDNA），置 – 20℃ 保存備用。
1.3.4 引物設計
參照文獻[4] 進行引物設計。Ⅰ型膠原序列：上游引物：5’-TCCAAAGGAGAGAGCGGTAA-3’，下游引物：5’-GACCAGGGAGACCAAACTCA-3’；擴增參數：95℃ 變性 45 s，56℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 45 s，30 個循環。內對照采用 β-actin：上游引物：5’-AGGTTTCCTCTCTCGCCATT-3’，下游引物：5’-CTGGTCCCTCGGTTTGAGT-3’；擴增參數：95℃ 變性 20 s，56℃ 退火 20 s，72℃ 延伸 1 min，25 個循環。
Ⅱ型膠原序列：上游引物： 5’-GCTCCCAGAACATCGCCTACC-3’，下游引物： 5’-TGAACCTGCTATTGCCCTCT-3’；擴增參數：95℃ 變性 45 s，56℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 45 s，30 個循環。內對照采用 β-actin：上游引物：5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGA-3’，下游引物：5’-ATGGATGATGATATCGCCGC-3’；擴增參數：95℃ 變性 20 s，56℃ 退火 20 s，72℃ 延伸 1 min，25 個循環。
有內對照 β-actin 的為 Marker 組，該組含有標準量的 β-actin，無其他實驗組標本成分，以其擴增測定的灰度值為標準，作為其他實驗組測定灰度值的標準對照，本實驗將實驗組灰度值與 Marker 組灰度值的比值作為關鍵的實驗數據進行收集整理和比較。無 cDNA 模板的反應組，其標本內未添加 β-actin 及其他實驗組標本成分，作為瓊脂糖凝膠電泳的空白對照組，理論上不會在特定目標位置瓊脂糖凝膠電泳的掃描圖上顯影，該組的設定是為了排除可能來源于污染的基因組 DNA 的擴增。
1.3.5 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）
建立 PCR 反應體系，用 0.5×TBE 電泳緩沖液配制 2% 的瓊脂糖凝膠電泳（120 V，40 min），紫外燈下觀察擴增結果，并于凝膠成像儀上掃描存圖分析。測定不同電泳條帶的灰度值，其數值與內對照 β-actin（Marker 組）的灰度值的比值作為 PCR 產物灰度值比較相對強度。所以標本的相對強度=實驗組目的基因強度/β-actin 基因強度×100%。收集相對強度的比值作為實驗數據整理后備下一步進行統計學分析。
1.3.6 實驗椎間盤甲苯胺藍（toluidine blue，TB）染色
為進一步明確椎間盤軟骨終板的軟骨細胞形態及極性，采用 TB 染色。由于椎間盤損傷 8 周左右是損傷椎間盤病理生理改變的關鍵節點，因此在本實驗中選取術后 8 周實驗動物的 TB 染色結果進行病理組織觀察。且由于只有軟骨終板內有椎間盤軟骨細胞，故只選取了上位軟骨終板單次穿刺組及上下位軟骨終板多次穿刺組的軟骨細胞進行了描述和觀察。
1.4 觀察指標
各實驗組Ⅰ、Ⅱ型膠原 RT-PCR 的合成量隨時間變化的灰度值的相對強度數值，由于術后 12 周為此次動物實驗的觀察時間的中點，膠原含量變化改變明顯，故選用術后 12 周來觀察各組Ⅰ、Ⅱ型膠原 RT-PCR 檢測結果。同時收集整理各組實驗標本的Ⅰ型膠原 mRNA 的相對強度（Ⅰ型膠原 mRNA 的相對強度=實驗組目的基因強度/β-actin 基因強度×100%），這一比值可以反映其Ⅰ型膠原合成量的變化情況，因此將其作為實驗數據整理后備下一步進行統計學分析。觀察術后 8、24 周椎間盤標本中軟骨終板的 TB 染色病理結果，及與假手術對照組比較其炎癥改變及纖維化的具體病理改變過程。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 18.0 統計學軟件對實驗數據進行統計分析。實驗結果以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，各組數據之間兩兩比較則采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α（雙側）=0.05。
2 結果
2.1 Ⅰ型膠原 mRNA 的檢測結果
Ⅰ型膠原 mRNA 顯影位置在 500～700 bp，確認 RT-PCR 擴增的目標片段無誤（圖 2）。
圖2
術后 12 周各組Ⅰ型膠原 RT-PCR 電泳圖
1：Marker 組；2：纖維環穿刺組；3：上位軟骨終板單次穿刺組；4：上下位軟骨終板多次穿刺組；5：假手術對照組；6：實驗空白組
從術后 2 周開始，各手術組Ⅰ型膠原 mRNA 水平開始升高，與假手術對照組相比差異均有統計學意義（P<0.05）。在上下位軟骨終板多次穿刺組軟骨細胞內，其術后Ⅰ型膠原 mRNA 的表達水平明顯升高，在術后 2、8、12、24 周該組Ⅰ型膠原 mRNA 的表達水平均高于纖維環穿刺組及上位軟骨終板單次穿刺組，差異有統計學意義（P<0.05）。纖維環穿刺組術后Ⅰ型膠原 mRNA 的表達水平持續上升，在術后第 24 周與假手術對照組相比較，mRNA 的水平升高了 38%（P<0.05）；上位軟骨終板單次穿刺組及上下位軟骨終板多次穿刺組其術后軟骨細胞內Ⅰ型膠原 mRNA 的表達水平在術后 12 周達到高峰，保持穩定；在術后第 24 周，其 mRNA 的水平與假手術對照組相比較分別升高了 43% 和 69%（P<0.05）。見表 1。
表1
椎間盤軟骨細胞Ⅰ型膠原合成量的相對強度比值 （
）
2.2 Ⅱ型膠原 mRNA 的檢測結果
Ⅱ型膠原 mRNA 顯影位置在 200～300 bp，確認 RT-PCR 擴增的目標片段無誤（圖 3）。
術后 24 周，各手術組Ⅱ型膠原合成量明顯下降，與假手術對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。纖維環穿刺組及上位軟骨終板單次穿刺組，術后 2 周其Ⅱ型膠原 mRNA 的表達水平上升，與假手術組相比較，mRNA 的水平分別升高了 35% 及 51%（P<0.05）。從術后 8 周開始，纖維環穿刺組及上位軟骨終板單次穿刺組 mRNA 的水平進行性下降，到術后 24 周，與假手術對照組相比較，mRNA 的水平分別下降了 27%、31%（P<0.05）。上下位軟骨終板多次穿刺組自術后 2 周開始即呈現出進行性下降的趨勢，整個術后 24 周時間 5 個觀測時間點均未出現Ⅱ型膠原 mRNA 水平的升高，與假手術對照組相比，該組術后 24 周 mRNA 的水平下降了 48%（P<0.05）。見表 2。
圖3
術后 12 周Ⅱ型膠原 RT-PCR 電泳圖
1：Marker 組；2：纖維環穿刺組；3：實驗空白組；4：假手術對照組；5：上位軟骨終板單次穿刺組；6：上下位軟骨終板多次穿刺組
表2
椎間盤軟骨細胞Ⅱ型膠原合成量的相對強度比值（
）
2.3 TB 染色結果
術后 8 周，對損傷椎間盤的軟骨細胞行 TB 染色，其為典型的石榴樣形態。且與假手術對照組的正常椎間盤（圖 4a）相比，上下位軟骨終板多次穿刺組軟骨終板結構紊亂，厚度變薄，細胞數量減少，組織極性紊亂；同時還可以觀察到在終板受損部位軟骨終板髓核側松質骨結構紊亂，大量血細胞、血小板及炎癥細胞浸潤（圖 4b）。
隨著時間的延續，在術后 24 周，上下位軟骨終板多次穿刺組穿刺部位形成的軟骨缺損，未觀察到有軟骨組織增生、修復軟骨終板，而卻可以明確觀察到纖維樣組織結構長入并修復缺損（圖 4c）。
圖4
椎間盤 TB 染色結果
a. 術后 8 周假手術對照組（TB ×200）；b. 術后 8 周上下位軟骨終板多次穿刺組（TB ×200）；c. 術后 24 周上下位軟骨終板多次穿刺組椎間盤軟骨終板（TB ×400），穿刺部位有明顯軟骨缺損，非軟骨樣組織已長入填補缺損，周圍有炎性細胞浸潤（黃箭）
3 討論
3.1 Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白在不同椎間盤損傷模型中的變化特點
膠原纖維是椎間盤組織中重要的大分子結構，作為椎間盤內最主要的兩種膠原類型，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白在椎間盤退變的相關研究中扮演了十分重要的角色。在許多基礎實驗中，研究人員都通過檢測其含量變化作為評估退變嚴重程度的指標。既往的研究顯示在椎間盤自然退變過程中，椎間盤內Ⅱ型膠原含量不斷下降，而Ⅰ型膠原總量進行性上升，Ⅰ型膠原在椎間盤內的相對比例不斷增大，導致椎間盤力學性能的改變[1-2]。在本實驗中，損傷椎間盤軟骨細胞內Ⅰ型膠原的 mRNA 的水平在損傷早期上升的幅度不明顯。而在損傷 8 周以后，Ⅰ型膠原的 mRNA 水平上升速度加快，其上升幅度與椎間盤的損傷程度密切相關。在未有任何外加細胞因子作用下，軟骨細胞分泌Ⅰ型膠原能力的增強進一步提示：損傷椎間盤在損傷早期即開始呈現出典型的組織纖維化病理過程。
在此次研究中，更值得關注的是損傷椎間盤內Ⅱ型膠原的變化特點。通過對不同時間點損傷椎間盤內軟骨細胞Ⅱ型膠原的 mRNA 水平的檢測，我們發現了一個有趣的現象：不同于椎間盤自然退變過程中Ⅱ型膠原的進行性下降，在椎間盤損傷的早期，特別是術后 2 周，損傷椎間盤內Ⅱ型膠原的 mRNA 水平并沒有呈現下降的趨勢，在纖維環穿刺組及上位軟骨終板單次穿刺組中，其水平呈現一過性的升高。而在上下位軟骨終板多次穿刺組，Ⅱ型膠原的合成卻表現為進行性下降。同為損傷，如何解釋上述現象的發生，我們認為：在損傷程度較輕的椎間盤動物模型中，損傷早期出現的各種纖維化相關的細胞因子：如轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），輔助性 T 細胞相關細胞因子［白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-4、IL-13］其濃度水平較低。低濃度細胞因子刺激下的軟骨細胞功能活躍，Ⅱ型膠原分泌增加；而在上下位軟骨終板多次穿刺組，通過本課題組相關實驗的免疫組織化學結果發現，上述因子在上述損傷部位的陽性表達率明顯增加，由此推測：手術操作造成的椎間盤損傷嚴重。TGF-β 被肥大細胞大量釋放并激活，導致其在椎間盤組織內濃度增高明顯。而 TGF-β 作為目前公認的組織纖維化過程中最為重要的細胞因子[5]在不同濃度下對軟骨細胞的作用結果截然不同：軟骨細胞在較低濃度 TGF-β 作用下，可以加速Ⅱ型膠原分泌及軟細胞增殖。在高濃度作用下，TGF-β 下游的重要細胞因子結締組織生長因子的 mRNA 水平明顯上調，軟骨細胞發生細胞表現型轉化，其分泌Ⅰ型膠原顯著增多。這一研究結果可以解釋本實驗中上述現象的發生。在未來相關研究中，觀察多種細胞因子在其不同濃度下對椎間盤細胞生物學行為可能會對揭示不同形式、不同損傷程度造成的椎間盤退變提供更為有力的實驗依據。
3.2 研討未來損傷椎間盤動物模型的改進
在既往椎間盤退變動物模型的建立過程中，不同損傷形式（包括纖維環穿刺、終板破壞）都可以造成椎間盤的加速退變[6-7]。目前絕大部分動物椎間盤退變模型建立的目標都是為研究人類椎間盤由于年齡老化引起的椎間盤自然退變過程。而作為一個理想的椎間盤退變模型，應該滿足以下幾個條件[8-9]：① 與人椎間盤的自然退變過程具有相似性，能再現椎間盤退行性改變的客觀規律；② 良好的可重復性；③ 操作方式的易行性和經濟性。而在此次實驗過程中，我們發現損傷椎間盤引起加速退變的過程是一個纖維化修復的過程，與常見的椎間盤自然退變過程存在一定的差異。主要表現在：在實驗過程中我們明確觀察到椎間盤細胞在損傷后即開始出現 α-平滑肌肌動蛋白的表達，隨后出現轉分化等組織纖維化過程特有的病理特征，而這在椎間盤自然退變的相關研究中還未有類似的研究結果。在本實驗中，促纖維化細胞因子在不同損傷形式椎間盤模型中，無論是表達的部位、強度還是出現時間上都有一定的差異。這些也與椎間盤自然退變的相關研究結果存在一定差異，提示損傷椎間盤的病理過程可能不同于椎間盤的自然退變。損傷程度較輕的椎間盤軟骨細胞早期Ⅱ型膠原的 mRNA 水平升高，隨著時間的推移又開始緩慢下降的過程與自然退變相比較也存在一定差異。
綜上所述，目前經典的椎間盤退變模型可能還無法真正滿足理想椎間盤動物模型的標準。在未來的研究中，建立更加接近正常自然退變過程的椎間盤動物模型可能會對人類進一步加深椎間盤相關疾病的了解提供更多、更有價值的信息。
3.3 阻斷損傷椎間盤加速退變的可能分子生物學途徑
IL-13 是近年來組織纖維化研究的熱點，已有的研究顯示：IL-13 可與 TGF-β1 共同作用參與組織纖維化過程，同時也可像 IL-4 一樣單獨誘導組織纖維化發生，同時也是椎間盤退變中的重要分子生物學靶點。最近研究發現：人及動物組織中存在一種 IL-13 的誘導受體[10]，與 IL-13 結合后，可有效阻斷其相關生物學功能。目前國內外學者都致力于通過各種方法阻斷纖維化相關細胞因子的生理作用進而減緩纖維化過程的發生，諸如基因敲除纖維化相關基因、抗體中和及受體封閉等方式。而可溶性白細胞介素-13 受體 α2（soluble interleukin-13 receptor-α2，sIL-13Rα2）的發現及相關研究結果為阻斷 IL-13 在纖維化過程中的作用提供了新的、更可行的選擇[11]。IL-13Rα2 被稱為 IL-13 的誘導受體，與 IL-13R 結合后，可有效阻斷其相關的細胞傳導通路。有研究檢測曼氏血吸蟲病患者外周血單核細胞細胞培養上清液中的 IL-13 含量，結果發現 IL-13Rα2 是下調曼氏血吸蟲病 IL-13 所致組織纖維化的重要因子[12]。而采用 sIL-13Rα2 融合蛋白（sIL-13Rα2-Fc）處理感染了曼氏血吸蟲的野生鼠，其肝臟細胞外基質的沉積量減少 85%。以上研究皆表明：sIL-13Rα2 可有效阻斷 IL-13 在纖維化過程中的相關作用，減少損傷組織內異常細胞外基質的沉積。那么在損傷椎間盤內，sIL-13Rα2 是否具有類似的阻斷效果進而減緩損傷椎間盤的退變過程，可能成為未來損傷椎間盤治療方面新的研究方向。
