引用本文： 賴思可, 曹暢, 李箭, 李棋. 玻璃酸鈉作用于兔膝骨關節炎的代謝組學研究. 華西醫學, 2018, 33(9): 1153-1161. doi: 10.7507/1002-0179.201808068 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是以損害關節軟骨為特征，并累及軟骨下骨、滑膜和關節周圍組織的進展性骨關節疾患[1-3]。膝關節 OA 發病率居全身各部 OA 的首位[4]，中老年人群中發病最常見，65 歲以上人群中約 50% 患有膝關節 OA，大大影響了中老年人的日常生活質量[5]。目前 OA 的發病機制仍不清楚，普遍認為 OA 是關節軟骨、關節滑膜、軟骨下骨三者在力學和生物學因素共同作用下，降解和合成偶聯失衡的結果。1999 年 Nicholson 等[6]完善了代謝組學這一概念，代謝組學重點研究的是基因表達的最終產物，通過對低分子量代謝產物進行定性定量分析從而對疾病進行診斷和藥物治療。該技術可以鑒定標本中所包含的異常生物指標，從而用于包括 OA 在內的多種疾病的診斷、檢測預后以及治療[7-8]。玻璃酸鈉（hyaluronate，HA）是一種是高分子量多糖，是關節軟骨基質和滑液的主要成分，能增加關節液的黏彈性和潤滑功能，促進軟骨再生和修復，改善滑液組織的炎性反應而緩解疼痛[9-10]。1974 年 Peyron 等[11]首次將通過關節腔注射 HA 運用于 OA，取得了良好效果，并有大樣本、多中心的臨床研究證實了其確切療效，但 HA 治療骨關節疾病的作用機制仍未被完全闡明。基于上述背景，本研究擬采用核磁共振（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）為基礎的代謝組學檢測分析研究 HA 在兔膝關節 OA 模型中的影響及作用機制，為進一步研究 HA 治療 OA 的具體機制提供新思路和新依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
重水（D2O）：美國 Cambridge Isotope Laboratories 公司； 3-（三甲基硅基）丙酸鈉鹽：美國 Cambridge Isotope Laboratories 公司；40% 多聚甲醛：江蘇永華精細化工有限公司；HA 注射液（商品名：阿爾治）：日本生化學工業株式會社；Bruker AVⅢ 600 MHz NMR 譜儀：德國 Bruker Biospin 公司。
1.2 實驗動物
30 只健康的 6 月齡新西蘭大白兔，雌雄不限，體質量 2.0～2.5 kg。本研究實驗動物由四川大學華西醫院動物實驗中心提供［實驗動物生產許可證號 SCXK（川）2013-14，實驗動物使用許可證號 SYXK（川）2013-119］，動物日常護理及實驗條件均符合《中華人民共和國實驗動物環境及設施標準》[12]。實驗過程中觀察記錄動物的體質量、飲食情況、活動量及精神狀態等。
1.3 實驗方法
1.3.1 隨機分組及處理
將動物實驗中心提供的 30 只新西蘭大白兔編號，按照隨機數字表法分為：健康空白對照組（N 組）與模型組［包括磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）注射組（P 組）、HA 注射組（H 組）］，每組各 10 只。其中 P、H 兩組采用 Hulth 造模方式進行左側膝關節炎模型制備。
1.3.2 OA 造模
術前 30 min 肌肉注射青霉素鈉 80 萬 U，用 2.0% 戊巴比妥鈉經大白兔耳緣靜脈注射麻醉，常規消毒、鋪巾。采用 Hulth 造模方式[13]：無菌條件下取左膝關節內側縱切口長約 2 cm，顯露膝關節，切斷內側副韌帶及前交叉韌帶，完整切除內側半月板，保留關節軟骨面。生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，消毒。術后無菌敷料覆蓋傷口并用膠帶固定但不固定傷肢，自由活動，給予青霉素鈉預防感染 1 周。手術后 7 d 驅趕動物，30 min/d，分 2 次驅趕，驅趕動物 4 周后行 X 線照片、取材及病理學觀察，證實兔膝 OA 造模成功。結合預實驗結果及文獻，將造模術后 4 周確定為兔膝 OA 早期。
1.3.3 給藥方法
將兔進行耳緣靜脈輕度麻醉，仰臥固定于手術臺上，刮去膝關節處毛發。將兔膝關節微曲，消毒，注射器通過髕上囊外側穿刺進入關節腔，嚴格按照膝關節腔注射方法給藥。P 組給予 PBS 液 0.3 mL，H 組給予 HA 注射液 0.3 mL。于造模術后第 5 周開始注射，1 次/周，總共進行 5 次。N 組不予特殊處理。
1.3.4 取材
造模術后第 10 周以空氣栓塞處死全部實驗動物取材。① 血清。全部實驗動物消毒待乙醇完全揮發后取耳緣靜脈血 5 mL，緩慢注入真空采血管，靜置 1 h 后進行凝固分層。1 500 r/min 離心15 min 取上清液裝載干凈的離心管中，再 3 500 r/min離心 5 min，取上清液分裝到凍存管中，每管 0.5 mL，置于液氮罐中迅速冷凍，并轉入–80° 冰箱保存待測。② 關節液。實驗兔固定后，剪去左側膝關節部位毛發，消毒后在髕韌帶附著點外上方約 0.5 cm 處穿刺進針，抽取關節液于凍存管，快速移入液氮罐中冷凍，而后轉入–80° 冰箱保存待測。
1.3.5 觀測指標
① 一般情況。觀察動物術后的飲食及精神狀態，休息時體位、活動量、切口愈合情況，注意左膝關節有無腫脹、活動障礙、脫位，局部有無積液以及感染情況。
② 大體觀察。觀察動物造模術后滑膜有無增生、關節囊滑液量、軟骨表面有無磨損及光滑度、有無骨贅等情況。
③ 影像學檢查。術后第 4 周拍片：麻醉后將實驗動物仰臥于檢查床，使用沙袋分別伸直、固定雙下肢，拍攝雙側膝關節正側位 X 線片。觀察左側膝關節間隙是否對稱、關節面有無磨損及骨贅形成。
④ 組織病理學觀察。術后第 4 周處死 2 只、術后第 10 周全部處死實驗動物，取材，進行標本脫鈣石蠟切片，行軟骨組織的蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組織化學（組化）染色。光學顯微鏡（光鏡）下觀察其病理組織結構和膠原纖維分布情況，有無炎性細胞浸潤。
⑤ 代謝組學檢測及分析。在 Bruker AVⅢ600 MHz NMR 譜儀上進行檢測，質子共振頻率為 600.13 MHz，實驗溫度為 298 K，檢測 CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）序列[14]。血樣每個精確吸取 200 μL 樣品和 400 μL 鈉離子（Na+）/鉀離子（K+）緩沖液（45 mmol/L，50% D2O，0.8% 氯化鈉）至 5 mm 核磁管，混勻后進行核磁檢測。關節液每個吸取 160 μL 樣品和 320 μL Na+/K+ 緩沖液（45 mmol/L，50% D2O，0.8% 氯化鈉）至 5 mm 核磁管，不足 160 μL 的以 D2O 補足，混勻后進行核磁檢測。檢測得到的自由感應衰減信號經傅立葉變換轉為 1H-NMR 圖譜，使用相關軟件將所有樣本的 1H-NMR 譜進行分段積分。對所有數據進行歸一化處理，將數據導入 SIMCA-P 11.5（瑞典 Umetrics AB 公司）軟件包，通過無監督的模式識別法主成分分析（principal components analysis，PCA）進行多維統計分析。通過 7 次循環交叉驗證法確定主成分值及驗證模型的穩定性和預測性，獲得 PCA 模型。進一步采用有監督的模式識別法進行多維統計分析，建立正交信號校正偏最小二乘判別（orthogonal signal correction-partial least squares-discriminant analysis，OSC-PLS-DA）模型。以每種存在差異的代謝產物作為變量，OSC-PLS-DA 模型的散點圖分布為結果，用相關系數法進行差異代謝物篩選，利用代謝數據庫來分析差異代謝物所參與的代謝途徑和代謝通路。A. 差異代謝相對濃度比較：由 SIMCA-P 軟件篩選出差異代謝產物后，根據其在 1H NMR 圖譜上的峰面積可推算出其相對濃度。相對濃度的升高或者降低反映了相比較的兩類標本之間差異代謝產物變化的趨勢，通過列表及波形擬合的趨勢圖可以較為直觀地展示出來，選用相應的單維統計分析方法，進一步比較每個差異代謝物在兩類標本之間的差異。B. 代謝通路分析：將發現的差異代謝物輸入 Metabo-Analyst，系統完成其在 HMDB、PubChem、KEGG 等數據庫的編號和信息匹配，然后采用機器算法分析出可能的代謝途徑，最后將相關代謝通路按 P 值大小排列顯示。
2 結果
2.1 一般情況
所有模型組動物術后 1 h 內蘇醒，恢復活動，進食正常。術后切口均無感染，造模區愈合良好。
2.2 大體標本觀察
N 組：關節腔無積液，滑膜未見增生，股骨髁及脛骨平臺表面光滑，色澤鮮亮，未見軟骨磨損及骨贅形成。模型組：左側關節腔少量積液，顏色清亮，滑膜輕度增生，股骨髁表面較光整，左側脛骨平臺色澤灰暗，表面欠光滑，內側緣可見骨贅形成。
2.3 影像學表現
N 組：雙側膝關節間隙對稱，無狹窄，骨性關節面光滑，未見骨贅形成；脂肪墊清晰，關節周圍軟組織未見腫脹（圖 1a）。模型組：左側膝關節內側脛骨平臺有增生、稍微變尖，骨贅形成，內側關節囊腫脹，髕下脂肪墊透亮度減低，關節間隙狹窄（圖 1b）。
圖1
實驗動物雙膝關節正側位 X 線片
a. N 組動物 X 線片，可見關節間隙對稱，未見明顯狹窄及骨贅形成；b. 模型組動物 X 線片，可見模型側脛骨平臺有增生，骨贅形成，關節間隙變窄
2.4 組織病理學觀察
分別進行實驗動物關節軟骨 HE、甲苯胺藍及免疫組化染色，光鏡下觀察到病理組織結構和膠原纖維分布情況，及炎性細胞浸潤（圖 2）。N 組：雙側關節軟骨表面光滑、平整，軟骨層次清楚，潮線完整，軟骨細胞分布均勻，細胞排列整齊，無簇聚或減少；甲苯胺藍染色示基質呈均勻的深藍色，無失染現象。P 組：左側膝關節軟骨光鏡下觀察到軟骨表面變薄、粗糙不規則，可見較小和淺的裂隙，潮線不完整，軟骨細胞數量減少，排列紊亂，無細胞聚集現象；甲苯胺藍染色示基質輕度失染。H 組：左側軟骨組織表面有纖維組織增生，軟骨細胞呈散在的點狀增生，軟骨細胞輪廓模糊，有散在的淋巴細胞和漿細胞，細胞排列紊亂，但層次可分清。3 組標本圖形對比觀察，HA 組具有一定的軟骨修復能力。
圖2
光鏡下組織病理學表現
2.5 代謝組學分析
2.5.1 血清樣本
① 血清 1H-NMR 譜代謝物識別。實驗動物 N 組、P 組及 H 組的血清經過磁共振檢測得到的 1H-NMR 譜見圖 3a，圖中橫坐標表示化學位移，主要代謝物包括：組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸等氨基酸類；脂肪酸、不飽和脂肪酸等脂質類；葡萄糖等糖類；乳酸、檸檬酸、醋酸等有機酸類；丙酮酸、谷氨酰胺、膽堿等中間代謝產物；高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等脂蛋白類及 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶等酶類。
② PCA 模型分析。在 PCA 模型中 H6 點出現了明顯偏離，離散樣品會影響模型結構，使模型失真。離散點數量極少，可能由樣本采集或數據采集過程中受到污染造成，予以剔除后再次進行分析，離散點對整體分布影響較小，得到如下 PCA 模型（圖 3b）。3 組動物的血清代謝物已出現了一定的分離趨勢，但還未達到明顯區分的目標。
③ OSC-PLS-DA 模型分析。通過 PCA 模型分析，對血清組的代謝物分布情況有了一個整體的認識，進一步采用有監督的模式識別法進行多維統計分析，并建立 OSC-PLS-DA 模型。根據實驗需求，重點進行 P-H 組間模型比較，得到 OSC-PLS-DA 模型（圖 3c）。在有監督的 OSC-PLS-DA 模型中，血清中的 P 組代謝物與 H 組代謝物已明顯分離。
④ 差異代謝物篩選。血清 1H-NMR 譜 OSC-PLS-DA 模型相關系數圖見圖 3d，圖中遠離原點的變量數據即為可能引起組間差異的主要代謝物。
圖3
血清樣本的 1H-NMR 譜代謝組學分析
a. 血清的 1H-NMR 譜代謝物識別；b、c. 分別為血清 1H-NMR 譜 PCA 散點圖和 OSC-PLS-DA 散點圖，N 表示健康空白對照組，P 表示 PBS 注射組，H 表示 HA 注射組，橫縱坐標表示 2 個主成分；d. 血清 1H-NMR 譜 OSC-PLS-DA 模型的負載權重圖，橫縱坐標表示 2 個主成分
2.5.2 關節液樣本
① 關節液 1H-NMR 譜代謝物識別。實驗動物 N 組、P 組及 H 組的關節液經過磁共振檢測得到 1H-NMR 譜（圖 4a）。主要的代謝物包括：組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸等氨基酸類；脂肪酸、不飽和脂肪酸等脂質類；葡萄糖等糖類；乳酸、檸檬酸、醋酸等有機酸類；丙酮酸、谷氨酰胺、膽堿等中間代謝產物；高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等脂蛋白類以及 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶等酶類。
② PCA 模型分析。在 PCA 模型中 H2、H9 點出現了明顯偏離，離散點數量極少，可能由樣本采集或數據采集過程中受到污染造成，予以剔除后再次進行分析，離散點對整體分布影響較小，PCA 散點圖如圖 4b 示，3 組樣品已出現分離趨勢，可進行后續 OPLS 分析。
③ OSC-PLS-DA 模型分析。將數據進行正交信號校正處理后，進行 OPLS-DA 分析，見圖 4c，可見 3 組樣品已達到完全分離。
④ 差異代謝物篩選。關節液1H-NMR 譜 OSC-PLS-DA 模型相關系數圖見圖 4d ，圖中遠離原點的變量數據即為可能引起組間差異的主要代謝物。
圖4
關節液樣本的1H-NMR 譜代謝組學分析
a. 關節液的 1H-NMR 譜代謝物識別；b、c. 分別為關節液 1H-NMR 譜 PCA 散點圖和 OSC-PLS-DA 散點圖，N 表示健康空白對照組，P 表示 PBS 注射組，H 表示 HA 注射組，橫縱坐標表示 2 個主成分；d. 1H-NMR 譜 OSC-PLS-DA 模型的負載權重圖，橫縱坐標表示2 個主成分
2.5.3 差異代謝相對濃度比較
血清中亮氨酸、纈氨酸、脂質、賴氨酸、醋酸、谷氨酸、檸檬氨酸、蘇氨酸、葡萄糖、不飽和脂肪酸和甲基組氨酸水平 H 組較 P 組均升高，而高密度脂蛋白、乳酸、丙氨酸降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
關節液中亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、醋酸、谷氨酸、乙酰乙酸、檸檬酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及甲酸水平 H 組較 N 組升高，而脂質、乳酸、琥珀酸、肌酸、葡萄糖水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.5.4 代謝通路分析
由圖 5 分析可發現，產生差異代謝物的可能代謝通路主要是蛋白質的生物合成、苯丙氨酸和酪氨酸的代謝、三羧酸循環及生物素代謝、糖異生和葡萄糖-丙氨酸循環等。
圖5
通過代謝物富集分析發現的相關代謝途徑
3 討論
目前 OA 研究的模型有多種[15-17]，動物模型主要有：自發性模型，即實驗動物在無人為干預處理情況下產生，如 STR/ort 小鼠模型、Hartley 豚鼠模型、Bgn-Fbn 雙基因敲除小鼠等；誘發性模型，即通過人為有目的地進行處理干預來誘導產生[18-19]，如改變飲食、關節腔注射藥物及膝關節固定等；手術方法，如改變關節應力、關節腔內注射木瓜蛋白酶誘導法及關節切開造模等，其中前交叉韌帶、半月板切除、Hulth 法是主要膝 OA 手術造模方式，以 Hulth 法建模最為經典[20]。本研究根據實驗設計和實驗條件，選擇兔模型，兔膝關節組織結構與人較類似，其 OA 模型的軟骨生化指標與人類也相近。
HA 是體內重要的生理活性物質，是由 2 000～25 000 個 β-N-乙酞氨基葡糖和 D-葡糖醛酸單糖重復連接而成的鏈狀聚合物[21]。正常關節滑液具有一定的黏彈性，對關節有屏障保護及潤滑減震等作用，對于維持膝關節軟骨面的穩定具有重要意義。OA 關節中滑液的黏彈性減少主要是由于關節滑液中 HA 濃度降低所致。目前關節腔注射 HA 治療 OA 己被廣泛應用。外源性 HA 的生理作用主要是減震、保護軟骨、抑制軟骨細胞丟失、減少 OA 中炎癥細胞。據本動物實驗觀察，H 組對兔膝骨關節軟骨損傷的療效優于 P 組，但對半月板和滑膜無明確的作用。Pham 等[22]實驗表明，關節腔注射 HA 能補充外源性 HA 并刺激內源性 HA 分泌，恢復關節潤滑及改善炎癥反應，促進關節軟骨修復，改善關節功能。HA 膝關節腔注射是目前治療輕中度 OA 的有效藥物，應結合個體化治療方案進行選擇。
目前 OA 的病因和發病機制尚不清楚，相關因素主要包括外傷、肥胖、炎癥、遺傳、內分泌異常、氣候、肌肉衰弱、關節松弛等，此外，與細胞因子、生長因子、免疫及代謝因素也有關[23-25]。本研究從代謝水平分析了 HA 治療 OA 的作用機制，主要與活化蛋白質代謝、脂代謝和能量代謝等途徑有關。軟骨細胞是駐留在關節軟骨內的唯一細胞，負責維持基質合成代謝和分解代謝之間的穩態平衡[26-27]。軟骨細胞功能障礙和活力喪失會導致進行性軟骨損傷[28]，進而發展為 OA。退化的軟骨細胞表現出合成代謝活性降低和分解代謝活性增加，從而損害軟骨細胞外基質完整性[29-30]。有研究表明，OA 會改變能量代謝，包括糖酵解和氧化磷酸化之間的平衡[31]。OA 發生過程中軟骨細胞的肥大變化可能是由糖酵解減少和乳酸積累造成。關節軟骨細胞中腺苷酸激活蛋白激酶活性降低有可能通過促進基質分解代謝破壞軟骨穩態，改變能量代謝，從而促進 OA 的發展[32]。氨基酸的代謝改變與 OA 的發病機制和炎癥改變有關，OA 發生過程中的外周傷害感受轉導可能由谷氨酸和花生四烯酸衍生的炎癥介質發生，代謝異常導致了 OA 關節中解剖學和生理學的變化[33-36]。支鏈氨基酸是構成骨骼肌蛋白質約 1/3 的必需氨基酸，是能量代謝的重要燃料。研究發現，在膝關節 OA 患者中，支鏈氨基酸與組氨酸的比例相較于正常組更高，這一代謝比例有望在未來成為監測 OA 進展的有效標志[37-39]。近年來有研究表明，OA 與以血脂異常為特征的代謝綜合征有關，高膽固醇血癥與 OA 之間存在關聯[40-41]。膽固醇是軟骨細胞生物學中的一種重要信號，可通過孤核受體 Ror-α 的表達刺激軟骨細胞肥大[42]。Huang 等[43]最近提出，脂質多糖介導的炎癥可能解釋肥胖、代謝綜合征和 OA 之間的關聯。因此，脂代謝在 OA 的發生與進展中有著重要作用。
本研究基于 1H-NMR 平臺，通過檢測生物體液中的內源性代謝產物濃度，結合化學信息學分析方法來確定生物體在生理病理狀態或者給藥前后代謝物成分的變化模式，結果顯示 HA 對 OA 的作用主要與蛋白質代謝、脂代謝和能量代謝等代謝途徑的激活有關，為研究 HA 治療膝 OA 的具體機制提供了新思路和新依據。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是以損害關節軟骨為特征，并累及軟骨下骨、滑膜和關節周圍組織的進展性骨關節疾患[1-3]。膝關節 OA 發病率居全身各部 OA 的首位[4]，中老年人群中發病最常見，65 歲以上人群中約 50% 患有膝關節 OA，大大影響了中老年人的日常生活質量[5]。目前 OA 的發病機制仍不清楚，普遍認為 OA 是關節軟骨、關節滑膜、軟骨下骨三者在力學和生物學因素共同作用下，降解和合成偶聯失衡的結果。1999 年 Nicholson 等[6]完善了代謝組學這一概念，代謝組學重點研究的是基因表達的最終產物，通過對低分子量代謝產物進行定性定量分析從而對疾病進行診斷和藥物治療。該技術可以鑒定標本中所包含的異常生物指標，從而用于包括 OA 在內的多種疾病的診斷、檢測預后以及治療[7-8]。玻璃酸鈉（hyaluronate，HA）是一種是高分子量多糖，是關節軟骨基質和滑液的主要成分，能增加關節液的黏彈性和潤滑功能，促進軟骨再生和修復，改善滑液組織的炎性反應而緩解疼痛[9-10]。1974 年 Peyron 等[11]首次將通過關節腔注射 HA 運用于 OA，取得了良好效果，并有大樣本、多中心的臨床研究證實了其確切療效，但 HA 治療骨關節疾病的作用機制仍未被完全闡明。基于上述背景，本研究擬采用核磁共振（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）為基礎的代謝組學檢測分析研究 HA 在兔膝關節 OA 模型中的影響及作用機制，為進一步研究 HA 治療 OA 的具體機制提供新思路和新依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
重水（D2O）：美國 Cambridge Isotope Laboratories 公司； 3-（三甲基硅基）丙酸鈉鹽：美國 Cambridge Isotope Laboratories 公司；40% 多聚甲醛：江蘇永華精細化工有限公司；HA 注射液（商品名：阿爾治）：日本生化學工業株式會社；Bruker AVⅢ 600 MHz NMR 譜儀：德國 Bruker Biospin 公司。
1.2 實驗動物
30 只健康的 6 月齡新西蘭大白兔，雌雄不限，體質量 2.0～2.5 kg。本研究實驗動物由四川大學華西醫院動物實驗中心提供［實驗動物生產許可證號 SCXK（川）2013-14，實驗動物使用許可證號 SYXK（川）2013-119］，動物日常護理及實驗條件均符合《中華人民共和國實驗動物環境及設施標準》[12]。實驗過程中觀察記錄動物的體質量、飲食情況、活動量及精神狀態等。
1.3 實驗方法
1.3.1 隨機分組及處理
將動物實驗中心提供的 30 只新西蘭大白兔編號，按照隨機數字表法分為：健康空白對照組（N 組）與模型組［包括磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）注射組（P 組）、HA 注射組（H 組）］，每組各 10 只。其中 P、H 兩組采用 Hulth 造模方式進行左側膝關節炎模型制備。
1.3.2 OA 造模
術前 30 min 肌肉注射青霉素鈉 80 萬 U，用 2.0% 戊巴比妥鈉經大白兔耳緣靜脈注射麻醉，常規消毒、鋪巾。采用 Hulth 造模方式[13]：無菌條件下取左膝關節內側縱切口長約 2 cm，顯露膝關節，切斷內側副韌帶及前交叉韌帶，完整切除內側半月板，保留關節軟骨面。生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，消毒。術后無菌敷料覆蓋傷口并用膠帶固定但不固定傷肢，自由活動，給予青霉素鈉預防感染 1 周。手術后 7 d 驅趕動物，30 min/d，分 2 次驅趕，驅趕動物 4 周后行 X 線照片、取材及病理學觀察，證實兔膝 OA 造模成功。結合預實驗結果及文獻，將造模術后 4 周確定為兔膝 OA 早期。
1.3.3 給藥方法
將兔進行耳緣靜脈輕度麻醉，仰臥固定于手術臺上，刮去膝關節處毛發。將兔膝關節微曲，消毒，注射器通過髕上囊外側穿刺進入關節腔，嚴格按照膝關節腔注射方法給藥。P 組給予 PBS 液 0.3 mL，H 組給予 HA 注射液 0.3 mL。于造模術后第 5 周開始注射，1 次/周，總共進行 5 次。N 組不予特殊處理。
1.3.4 取材
造模術后第 10 周以空氣栓塞處死全部實驗動物取材。① 血清。全部實驗動物消毒待乙醇完全揮發后取耳緣靜脈血 5 mL，緩慢注入真空采血管，靜置 1 h 后進行凝固分層。1 500 r/min 離心15 min 取上清液裝載干凈的離心管中，再 3 500 r/min離心 5 min，取上清液分裝到凍存管中，每管 0.5 mL，置于液氮罐中迅速冷凍，并轉入–80° 冰箱保存待測。② 關節液。實驗兔固定后，剪去左側膝關節部位毛發，消毒后在髕韌帶附著點外上方約 0.5 cm 處穿刺進針，抽取關節液于凍存管，快速移入液氮罐中冷凍，而后轉入–80° 冰箱保存待測。
1.3.5 觀測指標
① 一般情況。觀察動物術后的飲食及精神狀態，休息時體位、活動量、切口愈合情況，注意左膝關節有無腫脹、活動障礙、脫位，局部有無積液以及感染情況。
② 大體觀察。觀察動物造模術后滑膜有無增生、關節囊滑液量、軟骨表面有無磨損及光滑度、有無骨贅等情況。
③ 影像學檢查。術后第 4 周拍片：麻醉后將實驗動物仰臥于檢查床，使用沙袋分別伸直、固定雙下肢，拍攝雙側膝關節正側位 X 線片。觀察左側膝關節間隙是否對稱、關節面有無磨損及骨贅形成。
④ 組織病理學觀察。術后第 4 周處死 2 只、術后第 10 周全部處死實驗動物，取材，進行標本脫鈣石蠟切片，行軟骨組織的蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組織化學（組化）染色。光學顯微鏡（光鏡）下觀察其病理組織結構和膠原纖維分布情況，有無炎性細胞浸潤。
⑤ 代謝組學檢測及分析。在 Bruker AVⅢ600 MHz NMR 譜儀上進行檢測，質子共振頻率為 600.13 MHz，實驗溫度為 298 K，檢測 CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）序列[14]。血樣每個精確吸取 200 μL 樣品和 400 μL 鈉離子（Na+）/鉀離子（K+）緩沖液（45 mmol/L，50% D2O，0.8% 氯化鈉）至 5 mm 核磁管，混勻后進行核磁檢測。關節液每個吸取 160 μL 樣品和 320 μL Na+/K+ 緩沖液（45 mmol/L，50% D2O，0.8% 氯化鈉）至 5 mm 核磁管，不足 160 μL 的以 D2O 補足，混勻后進行核磁檢測。檢測得到的自由感應衰減信號經傅立葉變換轉為 1H-NMR 圖譜，使用相關軟件將所有樣本的 1H-NMR 譜進行分段積分。對所有數據進行歸一化處理，將數據導入 SIMCA-P 11.5（瑞典 Umetrics AB 公司）軟件包，通過無監督的模式識別法主成分分析（principal components analysis，PCA）進行多維統計分析。通過 7 次循環交叉驗證法確定主成分值及驗證模型的穩定性和預測性，獲得 PCA 模型。進一步采用有監督的模式識別法進行多維統計分析，建立正交信號校正偏最小二乘判別（orthogonal signal correction-partial least squares-discriminant analysis，OSC-PLS-DA）模型。以每種存在差異的代謝產物作為變量，OSC-PLS-DA 模型的散點圖分布為結果，用相關系數法進行差異代謝物篩選，利用代謝數據庫來分析差異代謝物所參與的代謝途徑和代謝通路。A. 差異代謝相對濃度比較：由 SIMCA-P 軟件篩選出差異代謝產物后，根據其在 1H NMR 圖譜上的峰面積可推算出其相對濃度。相對濃度的升高或者降低反映了相比較的兩類標本之間差異代謝產物變化的趨勢，通過列表及波形擬合的趨勢圖可以較為直觀地展示出來，選用相應的單維統計分析方法，進一步比較每個差異代謝物在兩類標本之間的差異。B. 代謝通路分析：將發現的差異代謝物輸入 Metabo-Analyst，系統完成其在 HMDB、PubChem、KEGG 等數據庫的編號和信息匹配，然后采用機器算法分析出可能的代謝途徑，最后將相關代謝通路按 P 值大小排列顯示。
2 結果
2.1 一般情況
所有模型組動物術后 1 h 內蘇醒，恢復活動，進食正常。術后切口均無感染，造模區愈合良好。
2.2 大體標本觀察
N 組：關節腔無積液，滑膜未見增生，股骨髁及脛骨平臺表面光滑，色澤鮮亮，未見軟骨磨損及骨贅形成。模型組：左側關節腔少量積液，顏色清亮，滑膜輕度增生，股骨髁表面較光整，左側脛骨平臺色澤灰暗，表面欠光滑，內側緣可見骨贅形成。
2.3 影像學表現
N 組：雙側膝關節間隙對稱，無狹窄，骨性關節面光滑，未見骨贅形成；脂肪墊清晰，關節周圍軟組織未見腫脹（圖 1a）。模型組：左側膝關節內側脛骨平臺有增生、稍微變尖，骨贅形成，內側關節囊腫脹，髕下脂肪墊透亮度減低，關節間隙狹窄（圖 1b）。
圖1
實驗動物雙膝關節正側位 X 線片
a. N 組動物 X 線片，可見關節間隙對稱，未見明顯狹窄及骨贅形成；b. 模型組動物 X 線片，可見模型側脛骨平臺有增生，骨贅形成，關節間隙變窄
2.4 組織病理學觀察
分別進行實驗動物關節軟骨 HE、甲苯胺藍及免疫組化染色，光鏡下觀察到病理組織結構和膠原纖維分布情況，及炎性細胞浸潤（圖 2）。N 組：雙側關節軟骨表面光滑、平整，軟骨層次清楚，潮線完整，軟骨細胞分布均勻，細胞排列整齊，無簇聚或減少；甲苯胺藍染色示基質呈均勻的深藍色，無失染現象。P 組：左側膝關節軟骨光鏡下觀察到軟骨表面變薄、粗糙不規則，可見較小和淺的裂隙，潮線不完整，軟骨細胞數量減少，排列紊亂，無細胞聚集現象；甲苯胺藍染色示基質輕度失染。H 組：左側軟骨組織表面有纖維組織增生，軟骨細胞呈散在的點狀增生，軟骨細胞輪廓模糊，有散在的淋巴細胞和漿細胞，細胞排列紊亂，但層次可分清。3 組標本圖形對比觀察，HA 組具有一定的軟骨修復能力。
圖2
光鏡下組織病理學表現
2.5 代謝組學分析
2.5.1 血清樣本
① 血清 1H-NMR 譜代謝物識別。實驗動物 N 組、P 組及 H 組的血清經過磁共振檢測得到的 1H-NMR 譜見圖 3a，圖中橫坐標表示化學位移，主要代謝物包括：組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸等氨基酸類；脂肪酸、不飽和脂肪酸等脂質類；葡萄糖等糖類；乳酸、檸檬酸、醋酸等有機酸類；丙酮酸、谷氨酰胺、膽堿等中間代謝產物；高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等脂蛋白類及 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶等酶類。
② PCA 模型分析。在 PCA 模型中 H6 點出現了明顯偏離，離散樣品會影響模型結構，使模型失真。離散點數量極少，可能由樣本采集或數據采集過程中受到污染造成，予以剔除后再次進行分析，離散點對整體分布影響較小，得到如下 PCA 模型（圖 3b）。3 組動物的血清代謝物已出現了一定的分離趨勢，但還未達到明顯區分的目標。
③ OSC-PLS-DA 模型分析。通過 PCA 模型分析，對血清組的代謝物分布情況有了一個整體的認識，進一步采用有監督的模式識別法進行多維統計分析，并建立 OSC-PLS-DA 模型。根據實驗需求，重點進行 P-H 組間模型比較，得到 OSC-PLS-DA 模型（圖 3c）。在有監督的 OSC-PLS-DA 模型中，血清中的 P 組代謝物與 H 組代謝物已明顯分離。
④ 差異代謝物篩選。血清 1H-NMR 譜 OSC-PLS-DA 模型相關系數圖見圖 3d，圖中遠離原點的變量數據即為可能引起組間差異的主要代謝物。
圖3
血清樣本的 1H-NMR 譜代謝組學分析
a. 血清的 1H-NMR 譜代謝物識別；b、c. 分別為血清 1H-NMR 譜 PCA 散點圖和 OSC-PLS-DA 散點圖，N 表示健康空白對照組，P 表示 PBS 注射組，H 表示 HA 注射組，橫縱坐標表示 2 個主成分；d. 血清 1H-NMR 譜 OSC-PLS-DA 模型的負載權重圖，橫縱坐標表示 2 個主成分
2.5.2 關節液樣本
① 關節液 1H-NMR 譜代謝物識別。實驗動物 N 組、P 組及 H 組的關節液經過磁共振檢測得到 1H-NMR 譜（圖 4a）。主要的代謝物包括：組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸等氨基酸類；脂肪酸、不飽和脂肪酸等脂質類；葡萄糖等糖類；乳酸、檸檬酸、醋酸等有機酸類；丙酮酸、谷氨酰胺、膽堿等中間代謝產物；高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等脂蛋白類以及 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶等酶類。
② PCA 模型分析。在 PCA 模型中 H2、H9 點出現了明顯偏離，離散點數量極少，可能由樣本采集或數據采集過程中受到污染造成，予以剔除后再次進行分析，離散點對整體分布影響較小，PCA 散點圖如圖 4b 示，3 組樣品已出現分離趨勢，可進行后續 OPLS 分析。
③ OSC-PLS-DA 模型分析。將數據進行正交信號校正處理后，進行 OPLS-DA 分析，見圖 4c，可見 3 組樣品已達到完全分離。
④ 差異代謝物篩選。關節液1H-NMR 譜 OSC-PLS-DA 模型相關系數圖見圖 4d ，圖中遠離原點的變量數據即為可能引起組間差異的主要代謝物。
圖4
關節液樣本的1H-NMR 譜代謝組學分析
a. 關節液的 1H-NMR 譜代謝物識別；b、c. 分別為關節液 1H-NMR 譜 PCA 散點圖和 OSC-PLS-DA 散點圖，N 表示健康空白對照組，P 表示 PBS 注射組，H 表示 HA 注射組，橫縱坐標表示 2 個主成分；d. 1H-NMR 譜 OSC-PLS-DA 模型的負載權重圖，橫縱坐標表示2 個主成分
2.5.3 差異代謝相對濃度比較
血清中亮氨酸、纈氨酸、脂質、賴氨酸、醋酸、谷氨酸、檸檬氨酸、蘇氨酸、葡萄糖、不飽和脂肪酸和甲基組氨酸水平 H 組較 P 組均升高，而高密度脂蛋白、乳酸、丙氨酸降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
關節液中亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、醋酸、谷氨酸、乙酰乙酸、檸檬酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及甲酸水平 H 組較 N 組升高，而脂質、乳酸、琥珀酸、肌酸、葡萄糖水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.5.4 代謝通路分析
由圖 5 分析可發現，產生差異代謝物的可能代謝通路主要是蛋白質的生物合成、苯丙氨酸和酪氨酸的代謝、三羧酸循環及生物素代謝、糖異生和葡萄糖-丙氨酸循環等。
圖5
通過代謝物富集分析發現的相關代謝途徑
3 討論
目前 OA 研究的模型有多種[15-17]，動物模型主要有：自發性模型，即實驗動物在無人為干預處理情況下產生，如 STR/ort 小鼠模型、Hartley 豚鼠模型、Bgn-Fbn 雙基因敲除小鼠等；誘發性模型，即通過人為有目的地進行處理干預來誘導產生[18-19]，如改變飲食、關節腔注射藥物及膝關節固定等；手術方法，如改變關節應力、關節腔內注射木瓜蛋白酶誘導法及關節切開造模等，其中前交叉韌帶、半月板切除、Hulth 法是主要膝 OA 手術造模方式，以 Hulth 法建模最為經典[20]。本研究根據實驗設計和實驗條件，選擇兔模型，兔膝關節組織結構與人較類似，其 OA 模型的軟骨生化指標與人類也相近。
HA 是體內重要的生理活性物質，是由 2 000～25 000 個 β-N-乙酞氨基葡糖和 D-葡糖醛酸單糖重復連接而成的鏈狀聚合物[21]。正常關節滑液具有一定的黏彈性，對關節有屏障保護及潤滑減震等作用，對于維持膝關節軟骨面的穩定具有重要意義。OA 關節中滑液的黏彈性減少主要是由于關節滑液中 HA 濃度降低所致。目前關節腔注射 HA 治療 OA 己被廣泛應用。外源性 HA 的生理作用主要是減震、保護軟骨、抑制軟骨細胞丟失、減少 OA 中炎癥細胞。據本動物實驗觀察，H 組對兔膝骨關節軟骨損傷的療效優于 P 組，但對半月板和滑膜無明確的作用。Pham 等[22]實驗表明，關節腔注射 HA 能補充外源性 HA 并刺激內源性 HA 分泌，恢復關節潤滑及改善炎癥反應，促進關節軟骨修復，改善關節功能。HA 膝關節腔注射是目前治療輕中度 OA 的有效藥物，應結合個體化治療方案進行選擇。
目前 OA 的病因和發病機制尚不清楚，相關因素主要包括外傷、肥胖、炎癥、遺傳、內分泌異常、氣候、肌肉衰弱、關節松弛等，此外，與細胞因子、生長因子、免疫及代謝因素也有關[23-25]。本研究從代謝水平分析了 HA 治療 OA 的作用機制，主要與活化蛋白質代謝、脂代謝和能量代謝等途徑有關。軟骨細胞是駐留在關節軟骨內的唯一細胞，負責維持基質合成代謝和分解代謝之間的穩態平衡[26-27]。軟骨細胞功能障礙和活力喪失會導致進行性軟骨損傷[28]，進而發展為 OA。退化的軟骨細胞表現出合成代謝活性降低和分解代謝活性增加，從而損害軟骨細胞外基質完整性[29-30]。有研究表明，OA 會改變能量代謝，包括糖酵解和氧化磷酸化之間的平衡[31]。OA 發生過程中軟骨細胞的肥大變化可能是由糖酵解減少和乳酸積累造成。關節軟骨細胞中腺苷酸激活蛋白激酶活性降低有可能通過促進基質分解代謝破壞軟骨穩態，改變能量代謝，從而促進 OA 的發展[32]。氨基酸的代謝改變與 OA 的發病機制和炎癥改變有關，OA 發生過程中的外周傷害感受轉導可能由谷氨酸和花生四烯酸衍生的炎癥介質發生，代謝異常導致了 OA 關節中解剖學和生理學的變化[33-36]。支鏈氨基酸是構成骨骼肌蛋白質約 1/3 的必需氨基酸，是能量代謝的重要燃料。研究發現，在膝關節 OA 患者中，支鏈氨基酸與組氨酸的比例相較于正常組更高，這一代謝比例有望在未來成為監測 OA 進展的有效標志[37-39]。近年來有研究表明，OA 與以血脂異常為特征的代謝綜合征有關，高膽固醇血癥與 OA 之間存在關聯[40-41]。膽固醇是軟骨細胞生物學中的一種重要信號，可通過孤核受體 Ror-α 的表達刺激軟骨細胞肥大[42]。Huang 等[43]最近提出，脂質多糖介導的炎癥可能解釋肥胖、代謝綜合征和 OA 之間的關聯。因此，脂代謝在 OA 的發生與進展中有著重要作用。
本研究基于 1H-NMR 平臺，通過檢測生物體液中的內源性代謝產物濃度，結合化學信息學分析方法來確定生物體在生理病理狀態或者給藥前后代謝物成分的變化模式，結果顯示 HA 對 OA 的作用主要與蛋白質代謝、脂代謝和能量代謝等代謝途徑的激活有關，為研究 HA 治療膝 OA 的具體機制提供了新思路和新依據。
