引用本文： 李大江, 秦江月, 劉坤, 申永春, 陳雪融, 唐小燕. 血清蛋白質組學技術診斷肺結核的臨床運用：基于 Meta 分析的證據. 華西醫學, 2018, 33(8): 977-983. doi: 10.7507/1002-0179.201807133 復制
肺結核是世界范圍內的重大公共衛生難題，世界衛生組織發布的《2017 全球結核病報告》顯示 2016 年全球新發結核病患者約 1 040 萬人，約 167 萬患者死亡，系全球第九大死因，在傳染性疾病中排名第一；我國結核病人數居世界第二，占全球結核病負擔 8.6%[1]。肺結核的診斷是臨床長期以來的難題，其臨床表現具有非特異性，可有發熱、咳嗽、咯血等多種表現形式。現有的結核菌素皮試、結核抗體、結核聚合酶鏈反應檢測、γ-干擾素釋放試驗對肺結核的診斷價值有限，侵入性的檢查并不推薦作為臨床一線檢查方法[2-3]。基于臨床經驗的診治常常導致過度醫療或治療不足，因此積極探索肺結核新型診斷標志物與技術是臨床工作的迫切需求，具有重要的臨床意義。
蛋白質作為生命活動的直接承擔者、蛋白質組學作為功能基因組學的核心支撐，肺結核的蛋白質組學的研究已成為后基因組時代結核病研究的重要領域[4]。2006 年發表在《Lancet》雜志上的研究分析了 179 份活動性結核病患者與 170 份對照者血清樣本，獲得血清蛋白質指紋圖譜，建立由 30 個提供最多信息的譜峰構成的診斷模型，診斷結核病的準確度達到 90%，由此拉開了結核病學蛋白質組學研究的序幕[5]。近年來有不少的研究報道了血清蛋白質組學技術對肺結核的診斷價值，得出的靈敏度、特異度等指標不一，給蛋白質組學技術的臨床運用帶來了困擾[6-8]。本研究擬通過 Meta 分析的方法系統探索血清蛋白質組學技術對肺結核的診斷價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 納入標準
① 以人血清為檢測標本的臨床原始研究；② 數據詳實全面，可以提取診斷四格表數據，數據來源于蛋白質組學直接數據；③ 肺結核的診斷標準明確；④ 文章用中文或英文發表。
1.1.2 排除標準
① 基于動物或者細胞系的基礎實驗性研究；② 無法提取足夠的數據構建四格表數據；③ 文章信息有限，如綜述性論文、個案報道、會議摘要；④ 其他語言發表的文獻。
1.2 文獻檢索
本研究檢索的數據庫主要包括：PubMed（Medline）、Scopus、萬方、中國知網、維普等。英文檢索關鍵詞：“pulmonary tuberculosis”“active pulmonary tuberculosis”“smear positive pulmonary tuberculosis”“smear negative pulmonary tuberculosis”“proteomic”“surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry”“matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry”“iTRAQ”“sensitivity”“specificity”“accuracy”；中文檢索關鍵詞：“肺結核”“活動性肺結核”“菌陽肺結核”“菌陰肺結核”“蛋白質組學”“表面增強激光解析-電離-飛行時間質譜”“基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜”“雙向凝膠電泳”“蛋白質指紋圖譜”“同位素標記相對和絕對定量”“敏感度”“特異度”“靈敏度”“敏感性”“特異性”“準確度”；文獻檢索截止日期為 2018 年 3 月。以中國知網為例，具體檢索策略見框 1。
1.3 文獻篩選及數據提取
根據上述標準由 2 位研究者進行獨立的文獻檢索，并獨立進行文獻的篩選與納入的判斷，不一致的情況由雙方討論決定。數據提取的內容包括：作者姓名、發表時間、研究所在國家、蛋白質技術平臺等基礎資料，再提取每個研究的診斷靈敏度和特異度，進一步依據診斷性試驗四格表計算出單個研究里面真陽性、假陽性、假陰性與真陰性例數。對于同一篇文章中的實驗組與驗證組，每組均視為單獨的研究。
1.4 文獻質量評價
對于納入文獻的質量，本研究采用診斷性試驗質量評價工具-2（Quality Assessment for Studies of Diagnostic Accuracy Studies-2，QUADAS-2）評分[9]對所納入的文獻進行獨立質量評價。
1.5 統計學方法
使用 MetaDisc 1.4 與 Stata 12.0 軟件進行數據統計分析。首先對納入的研究進行異質性分析，選擇合適的統計模型以助于降低在數據合并方面的誤差。通過計算 χ2 檢驗值和 I2 值評估納入研究之間的異質性，如果 I2 值≤50%，提示納入文獻的異質性較小，采用固定效應模型合并統計數據；如果 I2 值>50%，則提示異質性明顯，采用隨機效應模型合并數據。合并分析的指標包括：靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、診斷優勢比，并計算 95% 置信區間（confidence interval，CI）。同時繪制匯總受試者工作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）。采用 Deeks’ 檢驗評估納入文獻的發表偏倚。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
根據設定的納入與排除標準，本次研究納入 10 篇文獻 16 項研究，共計 2 433 例研究對象[10-19]。文獻檢索流程見圖 1。
圖1
文獻篩選流程圖
*具體包括：PubMed（
2.2 納入文獻基本特征
納入的研究對象中包括肺結核患者 1 191 例，非肺結核患者 1 242 例。10 篇文獻包括中文文獻 4 篇[10-11, 13, 16]，英文文獻 6 篇[12, 14-15, 17-19]；相關研究開展國家包括中國 9 篇[10-18]，歐洲國家 1 篇[19]。蛋白質組學技術平臺包括表面增強激光解析-電離-飛行時間質譜[10-13, 15-16, 18]、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜[14, 17]和 SMOAscan[19]。所納入研究均包含了明確的肺結核定義，包括細菌學、病理學、影像學以及臨床診斷。表 1 總結了本次 Meta 分析納入的 16 項研究的基礎信息。
表1
納入文獻的臨床特征
2.3 納入文獻質量評價
納入研究的風險偏倚來源于病例的選擇及待評價試驗兩部分。尤其需要指出的是，有 1 篇文獻對照組以健康人群作為對照，而不是納入常見的需要同肺結核鑒別的相關疾病患者作為對照[13]。文獻質量評價結果見圖 2。
圖2
文獻質量評價圖
2.4 異質性評估
經統計，納入研究的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比和診斷優勢比的 I2值分別為 63.9%（P=0.000 3）、77.8%（P<0.001）、74.5% （P<0.001）、64.6%（P=0.000 2）和 75.8%（P<0.001），P 值均小于 0.05，表明有明顯的統計學異質性存在于各個研究之間，因此選擇隨機效應模型合并相關統計數據。
2.5 蛋白質組學技術的匯總診斷價值
蛋白質組學技術診斷肺結核的合并靈敏度為 0.86［95%CI（0.84，0.88）］（圖 3），特異度為 0.88［95%CI（0.86，0.90）］（圖 4），陽性似然比為 6.72［95%CI（4.85，9.32）］，陰性似然比為 0.17［95%CI（0.13，0.22）］，診斷優勢比為 46.84［95%CI（26.80，81.86）］。圖 5 為診斷活動性肺結核的 SROC 曲線，本研究顯示 Q 值為 0.87，AUC 為 0.93。Deeks’ 檢驗提示 P 值為 0.39，未檢測到發表偏倚（圖 6）。
圖3
血清蛋白質組學技術診斷肺結核的靈敏度森林圖
圖4
血清蛋白質組學技術診斷肺結核的特異度森林圖
圖5
血清蛋白質組學技術診斷肺結核的匯總受試者工作特征曲線
圖6
發表偏倚圖
3 討論
肺結核的診斷仍然較為困難，不斷有研究提示蛋白質組學技術有望作為診斷肺結核的新方法，發現診斷肺結核的新型生物標志物。本研究通過 Meta 分析的方法首次系統評價了血清蛋白質組學技術診斷肺結核的臨床價值，研究表明蛋白質組學技術對肺結核具有良好的診斷價值，為其臨床運用提供了更高層次研究證據。
血清蛋白質組學技術對肺結核的診斷靈敏度與特異度為 0.86 與 0.88，提示仍存在相對較高的誤診率與漏診率。陽性似然比、陰性似然比、診斷優勢比是診斷性 Meta 分析常用的診斷學效能指標。本研究的合并陽性似然比為 6.72，提示在肺結核患者中血清蛋白質組學技術檢測結果為陽性的概率約為非肺結核患者的 7 倍；陰性似然比越小，診斷學試驗結果陰性時為真陰性的可能性越大，本研究中陰性似然比為 0.17，提示蛋白質組學技術檢測結果為陰性時該部分患者仍有較大的概率是肺結核患者，尚不能完全排除肺結核的診斷。診斷優勢比為肺結核患者中蛋白質組學技術檢測陽性/陰性比值與對照者蛋白質組學技術檢測陽性/陰性比值的比值，其值越高提示蛋白質組學技術的診斷辨別能力越高。本研究中蛋白質組學技術的診斷優勢比為 46.84，表明檢測蛋白質組學技術對于診斷肺結核具有良好的臨床價值。SROC 曲線是診斷性 Meta 分析中用于綜合衡量某一診斷指標整體準確性的方法，通過計算 AUC，其值越接近 1，說明診斷效果越好。本次研究發現 AUC 值為 0.93，提示蛋白質組學技術對肺結核具有較高的診斷價值。
蛋白質組學技術不僅可用于活動性肺結核的診斷，臨床研究發現，潛伏結核感染患者與健康對照者血漿的蛋白質表達譜存在顯著差異，利用蛋白質組學技術識別潛伏結核感染的靈敏度與特異度均在 80% 以上[20]。蛋白質組學技術也可用于篩選耐藥結核標志物，Zhang 等[21]通過蛋白質組學技術平臺發現耐藥結核與非耐藥結核患者血清的蛋白質表達譜存在顯著差異，Rv2031c、Rv3692、Rv0444c 有望作為診斷耐藥結核的新型標志物。另外的蛋白質組學研究發現與凝血、中性粒細胞活動、免疫和炎癥相關的蛋白質與結核的治療反應相關，上述蛋白有望成為評估結核治療反應的重要標志物[22]。這些研究提示蛋白質組學技術可以提供結核診斷、耐藥篩查、治療反應評估等一系列的標志物，在肺結核的診治中發揮重要作用。
蛋白質組學有多個技術平臺，如基礎的雙向凝膠電泳、表面增強激光解析-電離-飛行時間質譜、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜，這些技術有助于發現異常的蛋白峰，構建診斷決策模型，用于臨床診斷，但是這些技術尚無法明確蛋白質的結構與名稱，在臨床上運用有所限制。近年來發展的同位素標記相對和絕對定量技術與 SOMAscan 技術可以明確識別異常的蛋白質表達譜，便于后續開發酶聯免疫吸附試劑盒用于大規模的臨床驗證[19, 23]。如何開展更高效、更具有臨床可操作性的蛋白質組學技術還需要進一步的研究。
在解讀本次 Meta 分析的結果時需要注意，本研究納入的文獻、肺結核患者數量較少，并且可能存在部分研究未在檢索數據庫中檢索到，在臨床運用解讀蛋白質組學技術檢測結果時應謹慎；按照設定的入排標準，本次 Meta 分析只選擇了中文、英文發表文獻，存在語言偏倚的可能，并且大部分的研究在中國開展，有可能加入非中英文文獻或者其他國家發表結果后改變當前蛋白質組學技術診斷肺結核結果的可能。同時通過 QUADAS-2 評估文獻質量發現，部分研究僅納入了健康人群作為對照組，對照人群的選擇還需進一步的高質量臨床研究設計來完善。所以對于蛋白質組學技術的臨床運用還需持謹慎態度，有待更多臨床研究的證實。
綜上，血清蛋白質組學技術對于診斷肺結核具有較高的臨床價值，臨床上需開展更多的研究繼續探索蛋白質組學技術診斷肺結核的臨床效能。
肺結核是世界范圍內的重大公共衛生難題，世界衛生組織發布的《2017 全球結核病報告》顯示 2016 年全球新發結核病患者約 1 040 萬人，約 167 萬患者死亡，系全球第九大死因，在傳染性疾病中排名第一；我國結核病人數居世界第二，占全球結核病負擔 8.6%[1]。肺結核的診斷是臨床長期以來的難題，其臨床表現具有非特異性，可有發熱、咳嗽、咯血等多種表現形式。現有的結核菌素皮試、結核抗體、結核聚合酶鏈反應檢測、γ-干擾素釋放試驗對肺結核的診斷價值有限，侵入性的檢查并不推薦作為臨床一線檢查方法[2-3]。基于臨床經驗的診治常常導致過度醫療或治療不足，因此積極探索肺結核新型診斷標志物與技術是臨床工作的迫切需求，具有重要的臨床意義。
蛋白質作為生命活動的直接承擔者、蛋白質組學作為功能基因組學的核心支撐，肺結核的蛋白質組學的研究已成為后基因組時代結核病研究的重要領域[4]。2006 年發表在《Lancet》雜志上的研究分析了 179 份活動性結核病患者與 170 份對照者血清樣本，獲得血清蛋白質指紋圖譜，建立由 30 個提供最多信息的譜峰構成的診斷模型，診斷結核病的準確度達到 90%，由此拉開了結核病學蛋白質組學研究的序幕[5]。近年來有不少的研究報道了血清蛋白質組學技術對肺結核的診斷價值，得出的靈敏度、特異度等指標不一，給蛋白質組學技術的臨床運用帶來了困擾[6-8]。本研究擬通過 Meta 分析的方法系統探索血清蛋白質組學技術對肺結核的診斷價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 納入標準
① 以人血清為檢測標本的臨床原始研究；② 數據詳實全面，可以提取診斷四格表數據，數據來源于蛋白質組學直接數據；③ 肺結核的診斷標準明確；④ 文章用中文或英文發表。
1.1.2 排除標準
① 基于動物或者細胞系的基礎實驗性研究；② 無法提取足夠的數據構建四格表數據；③ 文章信息有限，如綜述性論文、個案報道、會議摘要；④ 其他語言發表的文獻。
1.2 文獻檢索
本研究檢索的數據庫主要包括：PubMed（Medline）、Scopus、萬方、中國知網、維普等。英文檢索關鍵詞：“pulmonary tuberculosis”“active pulmonary tuberculosis”“smear positive pulmonary tuberculosis”“smear negative pulmonary tuberculosis”“proteomic”“surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry”“matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry”“iTRAQ”“sensitivity”“specificity”“accuracy”；中文檢索關鍵詞：“肺結核”“活動性肺結核”“菌陽肺結核”“菌陰肺結核”“蛋白質組學”“表面增強激光解析-電離-飛行時間質譜”“基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜”“雙向凝膠電泳”“蛋白質指紋圖譜”“同位素標記相對和絕對定量”“敏感度”“特異度”“靈敏度”“敏感性”“特異性”“準確度”；文獻檢索截止日期為 2018 年 3 月。以中國知網為例，具體檢索策略見框 1。
1.3 文獻篩選及數據提取
根據上述標準由 2 位研究者進行獨立的文獻檢索，并獨立進行文獻的篩選與納入的判斷，不一致的情況由雙方討論決定。數據提取的內容包括：作者姓名、發表時間、研究所在國家、蛋白質技術平臺等基礎資料，再提取每個研究的診斷靈敏度和特異度，進一步依據診斷性試驗四格表計算出單個研究里面真陽性、假陽性、假陰性與真陰性例數。對于同一篇文章中的實驗組與驗證組，每組均視為單獨的研究。
1.4 文獻質量評價
對于納入文獻的質量，本研究采用診斷性試驗質量評價工具-2（Quality Assessment for Studies of Diagnostic Accuracy Studies-2，QUADAS-2）評分[9]對所納入的文獻進行獨立質量評價。
1.5 統計學方法
使用 MetaDisc 1.4 與 Stata 12.0 軟件進行數據統計分析。首先對納入的研究進行異質性分析，選擇合適的統計模型以助于降低在數據合并方面的誤差。通過計算 χ2 檢驗值和 I2 值評估納入研究之間的異質性，如果 I2 值≤50%，提示納入文獻的異質性較小，采用固定效應模型合并統計數據；如果 I2 值>50%，則提示異質性明顯，采用隨機效應模型合并數據。合并分析的指標包括：靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、診斷優勢比，并計算 95% 置信區間（confidence interval，CI）。同時繪制匯總受試者工作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）。采用 Deeks’ 檢驗評估納入文獻的發表偏倚。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
根據設定的納入與排除標準，本次研究納入 10 篇文獻 16 項研究，共計 2 433 例研究對象[10-19]。文獻檢索流程見圖 1。
圖1
文獻篩選流程圖
*具體包括：PubMed（
2.2 納入文獻基本特征
納入的研究對象中包括肺結核患者 1 191 例，非肺結核患者 1 242 例。10 篇文獻包括中文文獻 4 篇[10-11, 13, 16]，英文文獻 6 篇[12, 14-15, 17-19]；相關研究開展國家包括中國 9 篇[10-18]，歐洲國家 1 篇[19]。蛋白質組學技術平臺包括表面增強激光解析-電離-飛行時間質譜[10-13, 15-16, 18]、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜[14, 17]和 SMOAscan[19]。所納入研究均包含了明確的肺結核定義，包括細菌學、病理學、影像學以及臨床診斷。表 1 總結了本次 Meta 分析納入的 16 項研究的基礎信息。
表1
納入文獻的臨床特征
2.3 納入文獻質量評價
納入研究的風險偏倚來源于病例的選擇及待評價試驗兩部分。尤其需要指出的是，有 1 篇文獻對照組以健康人群作為對照，而不是納入常見的需要同肺結核鑒別的相關疾病患者作為對照[13]。文獻質量評價結果見圖 2。
圖2
文獻質量評價圖
2.4 異質性評估
經統計，納入研究的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比和診斷優勢比的 I2值分別為 63.9%（P=0.000 3）、77.8%（P<0.001）、74.5% （P<0.001）、64.6%（P=0.000 2）和 75.8%（P<0.001），P 值均小于 0.05，表明有明顯的統計學異質性存在于各個研究之間，因此選擇隨機效應模型合并相關統計數據。
2.5 蛋白質組學技術的匯總診斷價值
蛋白質組學技術診斷肺結核的合并靈敏度為 0.86［95%CI（0.84，0.88）］（圖 3），特異度為 0.88［95%CI（0.86，0.90）］（圖 4），陽性似然比為 6.72［95%CI（4.85，9.32）］，陰性似然比為 0.17［95%CI（0.13，0.22）］，診斷優勢比為 46.84［95%CI（26.80，81.86）］。圖 5 為診斷活動性肺結核的 SROC 曲線，本研究顯示 Q 值為 0.87，AUC 為 0.93。Deeks’ 檢驗提示 P 值為 0.39，未檢測到發表偏倚（圖 6）。
圖3
血清蛋白質組學技術診斷肺結核的靈敏度森林圖
圖4
血清蛋白質組學技術診斷肺結核的特異度森林圖
圖5
血清蛋白質組學技術診斷肺結核的匯總受試者工作特征曲線
圖6
發表偏倚圖
3 討論
肺結核的診斷仍然較為困難，不斷有研究提示蛋白質組學技術有望作為診斷肺結核的新方法，發現診斷肺結核的新型生物標志物。本研究通過 Meta 分析的方法首次系統評價了血清蛋白質組學技術診斷肺結核的臨床價值，研究表明蛋白質組學技術對肺結核具有良好的診斷價值，為其臨床運用提供了更高層次研究證據。
血清蛋白質組學技術對肺結核的診斷靈敏度與特異度為 0.86 與 0.88，提示仍存在相對較高的誤診率與漏診率。陽性似然比、陰性似然比、診斷優勢比是診斷性 Meta 分析常用的診斷學效能指標。本研究的合并陽性似然比為 6.72，提示在肺結核患者中血清蛋白質組學技術檢測結果為陽性的概率約為非肺結核患者的 7 倍；陰性似然比越小，診斷學試驗結果陰性時為真陰性的可能性越大，本研究中陰性似然比為 0.17，提示蛋白質組學技術檢測結果為陰性時該部分患者仍有較大的概率是肺結核患者，尚不能完全排除肺結核的診斷。診斷優勢比為肺結核患者中蛋白質組學技術檢測陽性/陰性比值與對照者蛋白質組學技術檢測陽性/陰性比值的比值，其值越高提示蛋白質組學技術的診斷辨別能力越高。本研究中蛋白質組學技術的診斷優勢比為 46.84，表明檢測蛋白質組學技術對于診斷肺結核具有良好的臨床價值。SROC 曲線是診斷性 Meta 分析中用于綜合衡量某一診斷指標整體準確性的方法，通過計算 AUC，其值越接近 1，說明診斷效果越好。本次研究發現 AUC 值為 0.93，提示蛋白質組學技術對肺結核具有較高的診斷價值。
蛋白質組學技術不僅可用于活動性肺結核的診斷，臨床研究發現，潛伏結核感染患者與健康對照者血漿的蛋白質表達譜存在顯著差異，利用蛋白質組學技術識別潛伏結核感染的靈敏度與特異度均在 80% 以上[20]。蛋白質組學技術也可用于篩選耐藥結核標志物，Zhang 等[21]通過蛋白質組學技術平臺發現耐藥結核與非耐藥結核患者血清的蛋白質表達譜存在顯著差異，Rv2031c、Rv3692、Rv0444c 有望作為診斷耐藥結核的新型標志物。另外的蛋白質組學研究發現與凝血、中性粒細胞活動、免疫和炎癥相關的蛋白質與結核的治療反應相關，上述蛋白有望成為評估結核治療反應的重要標志物[22]。這些研究提示蛋白質組學技術可以提供結核診斷、耐藥篩查、治療反應評估等一系列的標志物，在肺結核的診治中發揮重要作用。
蛋白質組學有多個技術平臺，如基礎的雙向凝膠電泳、表面增強激光解析-電離-飛行時間質譜、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜，這些技術有助于發現異常的蛋白峰，構建診斷決策模型，用于臨床診斷，但是這些技術尚無法明確蛋白質的結構與名稱，在臨床上運用有所限制。近年來發展的同位素標記相對和絕對定量技術與 SOMAscan 技術可以明確識別異常的蛋白質表達譜，便于后續開發酶聯免疫吸附試劑盒用于大規模的臨床驗證[19, 23]。如何開展更高效、更具有臨床可操作性的蛋白質組學技術還需要進一步的研究。
在解讀本次 Meta 分析的結果時需要注意，本研究納入的文獻、肺結核患者數量較少，并且可能存在部分研究未在檢索數據庫中檢索到，在臨床運用解讀蛋白質組學技術檢測結果時應謹慎；按照設定的入排標準，本次 Meta 分析只選擇了中文、英文發表文獻，存在語言偏倚的可能，并且大部分的研究在中國開展，有可能加入非中英文文獻或者其他國家發表結果后改變當前蛋白質組學技術診斷肺結核結果的可能。同時通過 QUADAS-2 評估文獻質量發現，部分研究僅納入了健康人群作為對照組，對照人群的選擇還需進一步的高質量臨床研究設計來完善。所以對于蛋白質組學技術的臨床運用還需持謹慎態度，有待更多臨床研究的證實。
綜上，血清蛋白質組學技術對于診斷肺結核具有較高的臨床價值，臨床上需開展更多的研究繼續探索蛋白質組學技術診斷肺結核的臨床效能。
