引用本文： 林琳, 郭帆, 馬良, 馮宇穎, 楊壯. 組蛋白乙酰化酶 6 抑制劑 23BB 改善肌紅蛋白誘導的腎小管上皮細胞內質網應激. 華西醫學, 2018, 33(7): 881-886. doi: 10.7507/1002-0179.201806101 復制
橫紋肌溶解（rhabdomyolysis，RM）是由于各種原因引起橫紋肌損傷、細胞膜破壞，導致大量肌紅蛋白、肌酸激酶等肌細胞內成分進入細胞外液和血循環的一組臨床綜合征[1]。引起 RM 的原因可分為物理原因（擠壓創傷、運動不當等）和非物理原因（藥物、毒物、感染、內分泌及遺傳代謝性疾病等）[2]。臨床表現中 RM 最危重的并發癥之一是急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。據報道，13%～50% 的 RM 住院患者可出現 AKI 且病死率高，而所有 AKI 病因中 RM 占 7%～10%[3-4]。目前，RM 引起的 AKI 治療仍以對癥治療和腎臟替代治療為主，尚缺乏有針對性的治療手段，病死率較高[5-6]。
既往研究報道組蛋白乙酰化酶 6（histone deacetylases 6，HDAC6）參與 RM 致 AKI 的病理生理過程，而通過選擇性地抑制 HDAC6 可保護腎功能，減輕病理損傷[7-8]。高選擇性的 HDAC6 抑制劑 23BB 最初作為抗腫瘤藥物被設計、合成，其有效性和安全性已在多發性肝癌、骨髓瘤、結腸癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤模型中得到充分的驗證[9]。課題組前期應用經典的肌肉注射甘油誘導小鼠 RM 模型，已經證實抑制劑 23BB 對 RM 致 AKI 的保護作用，但具體的腎臟保護機制有待于進一步闡明[10]。本研究中使用肌紅蛋白誘導人腎小管上皮細胞（HK-2）模擬 RM 致 AKI 的體外模型，探討 HDAC6 選擇性抑制劑 23BB 對 RM 致 AKI 的保護機制。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、耗材與儀器
人腎小管上皮細胞（HK-2）購自上海生命科學研究院細胞生物研究所。HDAC6 抑制劑 23BB 由四川大學生物治療國家重點實驗室合成。胎牛血清、胰蛋白酶、Dulbecco 改良 Eagle 培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）購自美國 Gibco 公司。肌紅蛋白、內質網應激拮抗劑 4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）、誘導劑衣霉素（tunicamycin，TM）購自美國 Sigma 公司。引物設計與合成購自上海生物工程技術服務有限公司。Trizol、cDNA 合成試劑盒、反轉錄酶等購自美國 Bio-Rad 公司。兔 anti-GRP78、鼠 anti-CHOP、β-actin 購自美國 Abcam 公司。CFX96 TouchTM熒光定量聚合酶鏈反應儀、Bio-Rad PowerPac 200 通用電泳電源儀、Bio-Rad Sub-Cell GT 水平電泳儀、Bio-Rad Mini-Protein Ⅲ小型蛋白電泳系統等主要儀器購自美國 Bio-Rad 公司。
1.2 細胞培養與藥物干預
人腎小管上皮細胞（HK-2）培養于含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養基中，于 37℃、5% 二氧化碳孵育。當細胞于培養瓶中生長至 70%～80% 融合時傳代 3～4 次后鋪板，準備 6 孔板，細胞計數后按每孔加入約 1×105個細胞加入細胞懸液，再加入培養基培養細胞，每孔培養基總量為 2 mL，隨機分為 5 組：空白對照組、造模組（肌紅蛋白 200 μmol/L）、23BB 治療組（肌紅蛋白 200 μmol/L+23BB 1.25 nmol/L）、4-PBA 治療組（肌紅蛋白 200 μmol/L+ 4-PBA 2.0 mmol/L）及 TM 刺激組（肌紅蛋白 200 μmol/L+23BB 1.25 nmol/L+TM 25 ng/mL），處理 24 h 后收集細胞進行相關檢測。
1.3 四唑鹽比色法檢測細胞生存率
四唑鹽比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法。收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入 100 μL，鋪板并調整待測細胞密度；5% 二氧化碳、37℃ 孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入各組處理條件藥物，每組 4 個復孔；孵育 24 h；棄去培養液，用磷酸鹽緩沖液沖 2～3 遍后，加入 20 μL 噻唑藍溶液（5 mg/mL），繼續培養 4 h。終止培養吸去孔內培養液，加入 150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10 min，使結晶物充分溶解。酶聯免疫檢測儀 OD490 nm 處測量各孔的吸光度值，進而計算生存率。
1.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測內質網應激基因 mRNA 表達
在 GeneBank 中檢索基因序列，利用 Primer-Blast 在線設計引物，檢測基因包括糖調節蛋白 78（glucose regulated protein 78，GRP78）、內質網源性轉錄因子（C/EBP homology protein，CHOP）、肌醇必需酶 1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、蛋白激酶樣內質網激酶（PKR-like ER kinase，PERK）和活化轉錄因子 6（activating transcription factor 6，ATF6），引物序列見表 1。
參照 TRIzol 試劑說明書提取各組細胞總 RNA，利用 oligo（dT）20 引物和試劑盒逆轉錄成 cDNA，按照試劑盒說明書進行擴增，反應條件為：94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，33 個循環，72℃ 5 min。聚合酶鏈反應產物經 2% 瓊脂糖電泳檢測，利用自動電泳凝膠掃描分析系統測定電泳條帶積分密度值（integrated density value，IDV），并將原始數據（Ct 值）換算為基因的相對表達量（2－ΔΔCt）；對照組和實驗組采用隨機化檢驗法進行比較。
表1
引物序列表
1.5 蛋白質印跡法檢測內質網應激蛋白表達
提取 HK-2 細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉印到硝酸纖維素膜，5% 脫脂奶粉封閉 2 h 后，加入一抗室溫孵育 2 h，含有吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液洗膜后加入稀釋的第二抗體孵育 1 h 后洗膜，增強化學發光法顯色曝光并通過 X 線膠片曝光洗片，經自動電泳凝膠分析系統掃描并測定雜交條帶 IDV，實驗重復 3 次，將目的蛋白 IDV/β-actin IDV 平均值作為其蛋白表達水平的相對值。
1.6 統計方法學
采用 SPSS 19.0 軟件處理。對計量資料進行正態性及方差齊性檢驗，數據采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，對于方差齊的多個樣本均數的兩兩比較采用 Tukey test for multiple comparisons 法，方差不齊則用 Games-Howell 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HDAC6 抑制劑 23BB 對 HK-2 生存率的影響
四唑鹽比色法顯示空白對照組細胞正常存活，給予肌紅蛋白刺激的造模組細胞生存率（48.1%）較空白對照組（100.0%）顯著下降，差異有統計學意義。在肌紅蛋白刺激的基礎上給以 23BB 治療（圖 1a，79.3%）或者給以內質網應激抑制劑 4-PBA 刺激（65.8%）后，細胞生存率比造模組明顯好轉，提示 23BB 對于肌紅蛋白對 HK-2 細胞的損傷有治療作用。TM 刺激組中的細胞生存率（51.6%）被內質網應激的誘導劑 TM 逆轉，提示 23BB 的治療作用主要是通過抑制了 HK-2 細胞的內質網應激（圖 1b）。
圖1
四唑鹽比色檢測細胞存活及生長
a. HDAC6 抑制劑 23BB 化學結構；b. 細胞生存率（“+”表示干預刺激，“–”表示無操作）
2.2 23BB 調控肌紅蛋白誘導 HK-2 內質網應激基因的變化
肌紅蛋白刺激后上述基因的轉錄水平較空白對照組均明顯上升，23BB 治療組的 GRP78、IRE1、PERK 和 CHOP 水平較造模組有所緩解，但 ATF6 水平無明顯變化；而 4-PBA 治療組不僅可以下調 GRP78、CHOP，同時也抑制這 3 個非折疊蛋白反應標志蛋白的上升；TM 刺激組中各項內質網應激基因的轉錄水平較 23BB 治療組有顯著上升，與造模組無明顯差異，提示對內質網應激的抑制是 23BB 治療作用中的主導機制（圖 2）。
圖2
逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測細胞內質網應激目的基因轉錄水平
a.
2.3 23BB 抑制肌紅蛋白誘導 HK-2 內質網應激蛋白的表達
肌紅蛋白刺激后上述蛋白的表達水平較空白對照組均明顯上升，23BB 治療組 GRP78 和 CHOP 水平較造模組有所緩解，而 4-PBA 治療組可以下調 GRP78、CHOP 表達，TM 刺激組中各項內質網應激蛋白表達水平較 23BB 治療組有顯著上升，與造模組無明顯差異（圖 3）。
圖3
蛋白質印跡法檢測細胞內質網應激目的蛋白表達水平
a. GRP78 和 CHOP 蛋白表達水平；b. GRP78/β-actin 蛋白表達半定量分析；c. CHOP/β-actin 蛋白表達半定量分析；
3 討論
肌紅蛋白誘導的 HK-2 細胞模型中，HDAC6 選擇性抑制劑 23BB 可抑制腎小管上皮細胞的內質網應激程度，并抑制反向引物為折疊反應蛋白中 IRE1 和 PERK 通路的激活，達到保護作用。
RM 致 AKI 是指由各種原因引起的橫紋肌細胞壞死后，肌紅蛋白等內容物釋放進入血液循環，引起的生化紊亂及腎臟功能損傷等危及生命的并發癥[11-12]。RM 的病理生理過程中，肌紅蛋白是已知的關鍵致病蛋白，在腎臟損傷過程中起主導作用[13-15]。但是肌紅蛋白致 AKI 的確切機制仍未完全闡明。我們前期研究也發現，在甘油誘導的 RM 致 AKI 模型中觀察到小鼠腎臟內質網應激標志蛋白 GRP78 表達的上調，以及內質網應激介導細胞凋亡的關鍵標志蛋白 CHOP 的高表達[10]。這些結果都提示內質網應激可能參與 RM 致 AKI 的發生與發展。
近年來，大量研究證實表觀遺傳學在腎臟疾病的發病機制中起著重要作用。而 HDAC6 主要表達于心、腎、肝及胰腺組織，定位于細胞質，參與調控多種轉錄因子[16]。不同于 HDAC1 和 HDAC3 這類分布廣泛的 HDAC，其基因敲除具有早期胚胎致死性，具有組織特異性的 HDAC6 基因敲除的小鼠往往是可發育存活甚至可以繁衍的。既往研究曾提出，HDAC6 參與 RM 誘導 AKI 的發病過程，調控腎小管上皮細胞的凋亡、炎癥反應、氧化應激和巨噬細胞浸潤[7]，對 HDAC6 的選擇性抑制可能是 AKI 治療中充滿前景的手段。
小分子化合物 23BB 是一種具有高度選擇性的 HDAC6 抑制劑，在甘油誘導 RM 致 AKI 模型中起到腎臟保護作用[9]。本研究也顯示 23BB 可有效改善肌紅蛋白誘導的腎小管上皮細胞內質網應激。因此，我們更有理由認為 HDAC6 選擇性抑制劑 23BB 較 pan-HDAC 抑制劑而言，具有更高的安全性和更少的副作用，是 AKI 治療中充滿前景的藥物。本課題首次報告了內質網應激參與 HDAC6 抑制劑對 RM 致 AKI 的保護作用，將 HDAC6 在該模型中的作用機制精確到細胞器層面，為臨床治療 AKI 提供新的治療靶點。
橫紋肌溶解（rhabdomyolysis，RM）是由于各種原因引起橫紋肌損傷、細胞膜破壞，導致大量肌紅蛋白、肌酸激酶等肌細胞內成分進入細胞外液和血循環的一組臨床綜合征[1]。引起 RM 的原因可分為物理原因（擠壓創傷、運動不當等）和非物理原因（藥物、毒物、感染、內分泌及遺傳代謝性疾病等）[2]。臨床表現中 RM 最危重的并發癥之一是急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。據報道，13%～50% 的 RM 住院患者可出現 AKI 且病死率高，而所有 AKI 病因中 RM 占 7%～10%[3-4]。目前，RM 引起的 AKI 治療仍以對癥治療和腎臟替代治療為主，尚缺乏有針對性的治療手段，病死率較高[5-6]。
既往研究報道組蛋白乙酰化酶 6（histone deacetylases 6，HDAC6）參與 RM 致 AKI 的病理生理過程，而通過選擇性地抑制 HDAC6 可保護腎功能，減輕病理損傷[7-8]。高選擇性的 HDAC6 抑制劑 23BB 最初作為抗腫瘤藥物被設計、合成，其有效性和安全性已在多發性肝癌、骨髓瘤、結腸癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤模型中得到充分的驗證[9]。課題組前期應用經典的肌肉注射甘油誘導小鼠 RM 模型，已經證實抑制劑 23BB 對 RM 致 AKI 的保護作用，但具體的腎臟保護機制有待于進一步闡明[10]。本研究中使用肌紅蛋白誘導人腎小管上皮細胞（HK-2）模擬 RM 致 AKI 的體外模型，探討 HDAC6 選擇性抑制劑 23BB 對 RM 致 AKI 的保護機制。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、耗材與儀器
人腎小管上皮細胞（HK-2）購自上海生命科學研究院細胞生物研究所。HDAC6 抑制劑 23BB 由四川大學生物治療國家重點實驗室合成。胎牛血清、胰蛋白酶、Dulbecco 改良 Eagle 培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）購自美國 Gibco 公司。肌紅蛋白、內質網應激拮抗劑 4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）、誘導劑衣霉素（tunicamycin，TM）購自美國 Sigma 公司。引物設計與合成購自上海生物工程技術服務有限公司。Trizol、cDNA 合成試劑盒、反轉錄酶等購自美國 Bio-Rad 公司。兔 anti-GRP78、鼠 anti-CHOP、β-actin 購自美國 Abcam 公司。CFX96 TouchTM熒光定量聚合酶鏈反應儀、Bio-Rad PowerPac 200 通用電泳電源儀、Bio-Rad Sub-Cell GT 水平電泳儀、Bio-Rad Mini-Protein Ⅲ小型蛋白電泳系統等主要儀器購自美國 Bio-Rad 公司。
1.2 細胞培養與藥物干預
人腎小管上皮細胞（HK-2）培養于含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養基中，于 37℃、5% 二氧化碳孵育。當細胞于培養瓶中生長至 70%～80% 融合時傳代 3～4 次后鋪板，準備 6 孔板，細胞計數后按每孔加入約 1×105個細胞加入細胞懸液，再加入培養基培養細胞，每孔培養基總量為 2 mL，隨機分為 5 組：空白對照組、造模組（肌紅蛋白 200 μmol/L）、23BB 治療組（肌紅蛋白 200 μmol/L+23BB 1.25 nmol/L）、4-PBA 治療組（肌紅蛋白 200 μmol/L+ 4-PBA 2.0 mmol/L）及 TM 刺激組（肌紅蛋白 200 μmol/L+23BB 1.25 nmol/L+TM 25 ng/mL），處理 24 h 后收集細胞進行相關檢測。
1.3 四唑鹽比色法檢測細胞生存率
四唑鹽比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法。收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入 100 μL，鋪板并調整待測細胞密度；5% 二氧化碳、37℃ 孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入各組處理條件藥物，每組 4 個復孔；孵育 24 h；棄去培養液，用磷酸鹽緩沖液沖 2～3 遍后，加入 20 μL 噻唑藍溶液（5 mg/mL），繼續培養 4 h。終止培養吸去孔內培養液，加入 150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10 min，使結晶物充分溶解。酶聯免疫檢測儀 OD490 nm 處測量各孔的吸光度值，進而計算生存率。
1.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測內質網應激基因 mRNA 表達
在 GeneBank 中檢索基因序列，利用 Primer-Blast 在線設計引物，檢測基因包括糖調節蛋白 78（glucose regulated protein 78，GRP78）、內質網源性轉錄因子（C/EBP homology protein，CHOP）、肌醇必需酶 1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、蛋白激酶樣內質網激酶（PKR-like ER kinase，PERK）和活化轉錄因子 6（activating transcription factor 6，ATF6），引物序列見表 1。
參照 TRIzol 試劑說明書提取各組細胞總 RNA，利用 oligo（dT）20 引物和試劑盒逆轉錄成 cDNA，按照試劑盒說明書進行擴增，反應條件為：94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，33 個循環，72℃ 5 min。聚合酶鏈反應產物經 2% 瓊脂糖電泳檢測，利用自動電泳凝膠掃描分析系統測定電泳條帶積分密度值（integrated density value，IDV），并將原始數據（Ct 值）換算為基因的相對表達量（2－ΔΔCt）；對照組和實驗組采用隨機化檢驗法進行比較。
表1
引物序列表
1.5 蛋白質印跡法檢測內質網應激蛋白表達
提取 HK-2 細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉印到硝酸纖維素膜，5% 脫脂奶粉封閉 2 h 后，加入一抗室溫孵育 2 h，含有吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液洗膜后加入稀釋的第二抗體孵育 1 h 后洗膜，增強化學發光法顯色曝光并通過 X 線膠片曝光洗片，經自動電泳凝膠分析系統掃描并測定雜交條帶 IDV，實驗重復 3 次，將目的蛋白 IDV/β-actin IDV 平均值作為其蛋白表達水平的相對值。
1.6 統計方法學
采用 SPSS 19.0 軟件處理。對計量資料進行正態性及方差齊性檢驗，數據采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，對于方差齊的多個樣本均數的兩兩比較采用 Tukey test for multiple comparisons 法，方差不齊則用 Games-Howell 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HDAC6 抑制劑 23BB 對 HK-2 生存率的影響
四唑鹽比色法顯示空白對照組細胞正常存活，給予肌紅蛋白刺激的造模組細胞生存率（48.1%）較空白對照組（100.0%）顯著下降，差異有統計學意義。在肌紅蛋白刺激的基礎上給以 23BB 治療（圖 1a，79.3%）或者給以內質網應激抑制劑 4-PBA 刺激（65.8%）后，細胞生存率比造模組明顯好轉，提示 23BB 對于肌紅蛋白對 HK-2 細胞的損傷有治療作用。TM 刺激組中的細胞生存率（51.6%）被內質網應激的誘導劑 TM 逆轉，提示 23BB 的治療作用主要是通過抑制了 HK-2 細胞的內質網應激（圖 1b）。
圖1
四唑鹽比色檢測細胞存活及生長
a. HDAC6 抑制劑 23BB 化學結構；b. 細胞生存率（“+”表示干預刺激，“–”表示無操作）
2.2 23BB 調控肌紅蛋白誘導 HK-2 內質網應激基因的變化
肌紅蛋白刺激后上述基因的轉錄水平較空白對照組均明顯上升，23BB 治療組的 GRP78、IRE1、PERK 和 CHOP 水平較造模組有所緩解，但 ATF6 水平無明顯變化；而 4-PBA 治療組不僅可以下調 GRP78、CHOP，同時也抑制這 3 個非折疊蛋白反應標志蛋白的上升；TM 刺激組中各項內質網應激基因的轉錄水平較 23BB 治療組有顯著上升，與造模組無明顯差異，提示對內質網應激的抑制是 23BB 治療作用中的主導機制（圖 2）。
圖2
逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測細胞內質網應激目的基因轉錄水平
a.
2.3 23BB 抑制肌紅蛋白誘導 HK-2 內質網應激蛋白的表達
肌紅蛋白刺激后上述蛋白的表達水平較空白對照組均明顯上升，23BB 治療組 GRP78 和 CHOP 水平較造模組有所緩解，而 4-PBA 治療組可以下調 GRP78、CHOP 表達，TM 刺激組中各項內質網應激蛋白表達水平較 23BB 治療組有顯著上升，與造模組無明顯差異（圖 3）。
圖3
蛋白質印跡法檢測細胞內質網應激目的蛋白表達水平
a. GRP78 和 CHOP 蛋白表達水平；b. GRP78/β-actin 蛋白表達半定量分析；c. CHOP/β-actin 蛋白表達半定量分析；
3 討論
肌紅蛋白誘導的 HK-2 細胞模型中，HDAC6 選擇性抑制劑 23BB 可抑制腎小管上皮細胞的內質網應激程度，并抑制反向引物為折疊反應蛋白中 IRE1 和 PERK 通路的激活，達到保護作用。
RM 致 AKI 是指由各種原因引起的橫紋肌細胞壞死后，肌紅蛋白等內容物釋放進入血液循環，引起的生化紊亂及腎臟功能損傷等危及生命的并發癥[11-12]。RM 的病理生理過程中，肌紅蛋白是已知的關鍵致病蛋白，在腎臟損傷過程中起主導作用[13-15]。但是肌紅蛋白致 AKI 的確切機制仍未完全闡明。我們前期研究也發現，在甘油誘導的 RM 致 AKI 模型中觀察到小鼠腎臟內質網應激標志蛋白 GRP78 表達的上調，以及內質網應激介導細胞凋亡的關鍵標志蛋白 CHOP 的高表達[10]。這些結果都提示內質網應激可能參與 RM 致 AKI 的發生與發展。
近年來，大量研究證實表觀遺傳學在腎臟疾病的發病機制中起著重要作用。而 HDAC6 主要表達于心、腎、肝及胰腺組織，定位于細胞質，參與調控多種轉錄因子[16]。不同于 HDAC1 和 HDAC3 這類分布廣泛的 HDAC，其基因敲除具有早期胚胎致死性，具有組織特異性的 HDAC6 基因敲除的小鼠往往是可發育存活甚至可以繁衍的。既往研究曾提出，HDAC6 參與 RM 誘導 AKI 的發病過程，調控腎小管上皮細胞的凋亡、炎癥反應、氧化應激和巨噬細胞浸潤[7]，對 HDAC6 的選擇性抑制可能是 AKI 治療中充滿前景的手段。
小分子化合物 23BB 是一種具有高度選擇性的 HDAC6 抑制劑，在甘油誘導 RM 致 AKI 模型中起到腎臟保護作用[9]。本研究也顯示 23BB 可有效改善肌紅蛋白誘導的腎小管上皮細胞內質網應激。因此，我們更有理由認為 HDAC6 選擇性抑制劑 23BB 較 pan-HDAC 抑制劑而言，具有更高的安全性和更少的副作用，是 AKI 治療中充滿前景的藥物。本課題首次報告了內質網應激參與 HDAC6 抑制劑對 RM 致 AKI 的保護作用，將 HDAC6 在該模型中的作用機制精確到細胞器層面，為臨床治療 AKI 提供新的治療靶點。
