表觀遺傳學的研究進展表明，多種表觀遺傳學修飾包括乙酰化、甲基化和微 RNA（microRNA，miRNA）參與急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的發病機制。近期研究發現，通過藥物抑制組蛋白去乙酰化酶增強組蛋白乙酰化導致更嚴重的腎小管損傷，并加重和延緩腎臟結構和功能的恢復。缺血/再灌注損傷腎臟發生 DNA 啟動子甲基化的變化。MiRNA 的表達也與 AKI 后腎小管損傷和再生調節有關。針對表觀遺傳學調節過程將可能有助于 AKI 患者的臨床靶向治療。該文對 AKI 表觀遺傳調控的最新進展進行了總結，并闡述了乙酰化、甲基化及 miRNA 在 AKI 的發生發展過程中的作用機制。
引用本文： 劉峰, 湯錦花, 莊守綱. 表觀遺傳學與急性腎損傷. 華西醫學, 2018, 33(7): 824-830. doi: 10.7507/1002-0179.201806093 復制
急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一類腎功能在短期內急性減退的臨床常見危重病，由多種病因造成，包括缺血/再灌注（ischemia/reperfusion， I/R）損傷、膿毒血癥或腎毒性藥物等。在普通住院患者中 AKI 的發病率普遍報道在 3.2%～9.6%，在危重癥的重癥監護病房患者中其發病率在 5% 至>10%[1-2]。近年來 AKI 的發病率逐年增長，影響全球數百萬患者，可導致死亡率上升或不可逆腎功能損害而需終身透析。在過去的數十年間，盡管 AKI 的發病機制及血液凈化技術不斷進步，但目前仍缺乏行之有效的藥物治療措施，患者病死率仍居高不下，達 50% 以上[1]。因此，研究 AKI 的發病機制及有效治療措施至關重要。
相對于心、腦組織，腎臟具有強大的再生修復能力[3-4]，在一定程度上可從缺血或其他損傷造成的腎小管壞死中恢復。有研究采用基因譜系示蹤研究證實，AKI 后腎臟再生的腎小管細胞主要來源于殘存腎小管上皮細胞的擴增[5-6]。發生 AKI 后，在缺血、毒素等損傷下，腎小管上皮細胞發生變性、凋亡、壞死，上皮細胞脫落、腎小管基底膜裸露，殘存的小管上皮細胞首先發生表型去分化，轉變成為能夠增殖的細胞，進而發生增生、遷移，最后再分化形成成熟的腎小管細胞[7]，在一定程度上可使腎臟上皮恢復其正常功能和結構。盡管目前關于 AKI 后腎小管上皮細胞再生修復的發生機制并不完全明了，有報道顯示，某些分子如波形蛋白、Pax-2 和神經細胞黏附分子，正常情況下這些分子表達在腎臟發育過程中的后腎間質而在成熟的腎臟并不表達，但是在腎小管損傷后修復的過程中，這些分子則在成熟的腎臟發生再表達[8-10]。這提示腎臟損傷后的再生過程可能模擬早期腎臟發育的過程。
表觀遺傳學調節參與腎臟發育過程，在基因轉錄調控中起重要作用。表觀遺傳學是指在不改變基因組 DNA 序列條件下，基因功能發生可遺傳的遺傳信息變化，最終導致可遺傳的表型變化，包括組蛋白和 DNA 甲基化、組蛋白乙酰化等。我們近期研究顯示組蛋白乙酰化參與 AKI 后腎小管上皮細胞的再生修復過程。Ⅰ 型組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）活性具有腎臟保護作用，而抑制 Ⅰ 型 HDAC 活性，加重葉酸或橫紋肌溶解誘導 AKI 小鼠腎功能損害，促進腎小管上皮細胞凋亡，抑制腎小管上皮細胞去分化、增殖的再生修復過程[11]；抑制 HDAC6 活性保護橫紋肌溶解或順鉑誘導的 AKI，減輕腎小管上皮細胞凋亡，減少炎癥因子釋放，改善腎組織氧化應激水平，促進腎小管上皮細胞再生修復[12-13]。DNA 和組蛋白甲基化以及微 RNA（microRNA，miRNA）也參與 AKI、慢性腎臟病（chronic kidney diseases，CKD）以及 AKI-CKD 轉換等病理生理過程[14]。
大量研究顯示表觀遺傳學參與 AKI 發病機制，在本文我們將闡述表觀遺傳學修飾包括乙酰化、甲基化和 miRNA 在 AKI 中的最新研究進展。
1 乙酰化與 AKI
緊密的染色體結構部分依賴于組蛋白上正電荷和 DNA 上負電荷之間的相互作用。組蛋白乙酰化可移除組蛋白的正電荷，從而降低組蛋白對帶負電荷 DNA 的親和性，使染色質結構松弛，有利于各種轉錄因子和協同轉錄因子能與 DNA 結合位點特異性結合，激活基因的轉錄。組蛋白乙酰化和去乙酰化是由組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）和 HDAC 兩種酶所催化。HAT 是一組將乙酰輔酶 A 的乙酰基轉移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上形成-N-乙酰賴氨酸。HDAC 則將乙酰基從組蛋白或非組蛋白的-氨基賴氨酸殘基移除，導致染色質致密卷曲，從而抑制基因的轉錄。目前共發現 18 種 HDAC，根據序列同源性及進化分析，被分為 4 種類型：Ⅰ 型 HDAC 包括 HDAC1～3、8，Ⅱ 型 HDAC 包括 HDAC4～7、9、10，Ⅲ 型 HDAC 包括 SIRT1～7， Ⅳ 型 HDAC 為 HDAC11。
HDAC 活化參與 AKI 后腎臟再生修復過程，在不同腎臟損傷模型中起不同的作用。HDAC 活化導致細胞存活還是細胞死亡，取決于不同細胞類型和不同損傷刺激方式。我們課題組研究發現，在葉酸或橫紋肌溶解誘導 AKI 模型小鼠，應用 MS-275 抑制Ⅰ型 HDAC 活性加重小鼠腎臟損害，表現為腎功能惡化、腎損傷標志物中性粒細胞明膠酶脂質運載蛋白表達增加、腎小管上皮細胞凋亡加重以及 胱天蛋白酶（caspase）-3 表達上升，同時抑制腎小管上皮細胞去分化標志物波形蛋白及增殖標志物增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達。這些結果顯示抑制 Ⅰ 型 HDAC 促進腎小管上皮細胞凋亡，抑制腎小管上皮細胞去分化、增殖的再生修復過程[11]。在體外實驗，應用 MS-275 抑制Ⅰ型 HDAC 活性，或應用小干擾 RNA 沉默 HDAC1、3 和 8 活性，可誘導組蛋白乙酰化水平增加，降低體外腎小管近端小管細胞增殖，減少細胞周期蛋白 cyclin D1 和 PCNA 的表達，提示Ⅰ型 HDAC 介導腎小管細胞增殖[11]。但是其他課題組在脂多糖誘導膿毒癥 AKI 小鼠模型中發現，MS-275 抑制Ⅰ型 HDAC 活性通過抑制活性氧的氧化應激和內皮網應激而起腎臟保護作用；MS-275 的干預緩解了脂多糖-誘導 AKI 小鼠腎臟損害，提高脂多糖-誘導膿毒癥模型的存活率，減輕腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL) -1β、IL-6、環氧化酶-2 的表達和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 的核轉位，并抑制 AKI 小鼠腎組織活性氧的產生。體外應用人腎小管上皮細胞 HK-2 細胞研究也顯示，MS-275 減輕脂多糖-誘導 HK-2 細胞凋亡，抑制活性氧和丙二醛的產生，增加谷胱甘肽生成和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，并減少與內質網應激相關的 C/EBP 同源蛋白、葡萄糖調節蛋白78、caspase-3 和 caspase-12 表達。因此，MS-275 抑制 Ⅰ 型 HDAC 活性可能通過活性氧介導的氧化應激和內質網應激改善腎功能并減輕脂多糖-誘導 AKI [15]。在順鉑-誘導腎素性腎損傷小鼠模型中，Ⅰ 型及 Ⅱ 型 HDAC 抑制劑曲古抑菌素 A 可抑制順鉑-誘導腎損傷、腎臟炎癥及腎上皮細胞凋亡，同時上調腎上皮抗炎蛋白-活化的小膠質細胞/巨噬細胞 WAP 結構域蛋白，后者是 HDAC 發揮腎臟保護作用的重要介質[16-17]。在馬兜鈴酸誘導小鼠腎損傷模型中，HDAC 抑制劑 4-甲基苯硫代丁酸酯可促進腎臟損傷再生修復，減少再生中的腎小管上皮細胞在 G2/M 細胞周期阻滯，并改善 AKI 后腎臟纖維化進展[18]。
Ⅱ 型 HDAC 在 AKI 中也發揮重要的作用。我們近期研究發現，應用 tubastatin A 抑制 HDAC6 活性保護橫紋肌溶解或順鉑誘導的 AKI，緩解腎組織病理損傷，減輕腎小管上皮細胞凋亡，減少炎癥因子釋放，改善腎組織氧化應激水平，促進腎小管上皮細胞再生修復[12-13]。機制研究發現，順鉑干預誘導小鼠腎臟 AKT 活化及上皮鈣黏素（E-cadherin）表達下降，而抑制 HDAC6 活性增加順鉑-誘導小鼠損傷腎臟 AKT 活化進一步增加并維持 E-cadherin 表達，同時增強腎組織自噬及減輕腎臟氧化應激，同時抑制 NF-κB 磷酸化及 TNF-α 和 IL-6 的表達[12]。應用另一種 HDAC6 抑制劑 23BB 化合物抑制 HDAC6 活性同樣對橫紋肌溶解-誘導 AKI 起保護作用，通過抑制內質網應激減少腎小管上皮細胞凋亡[19]。在 I/R 損傷小鼠腎臟，缺血階段 I/R 誘導組蛋白乙酰化短暫下降，隨后在灌注恢復階段 HDAC5 表達下調，從而誘導近端腎小管細胞骨形成蛋白-7 的表達[20]，后者是腎缺血損傷后腎小管上皮細胞再生修復的重要介質[21]。
Ⅲ 型 HDAC 成員 SIRT1 及 SIRT3 活化在盲腸結扎穿孔術誘導膿毒敗血癥大鼠 AKI 模型延緩腎臟損傷[22]。膿毒敗血癥過程中，腎小管上皮細胞 SIRT1/3 活性下降，SOD2 乙酰化增加，氧化應激水平升高，伴有線粒體損傷。而應用白藜蘆醇誘導 SIRT1/3 活化，可有效地減少 SOD2 乙酰化水平，減輕氧化應激和線粒體功能受損，延長小鼠存活時間[22]，提示 SIRT1/3 活化在膿毒血癥相關 AKI 中潛在的治療前景。在 I/R 損傷大鼠 AKI 模型中，白藜蘆醇干預顯著增加 SIRT1 基因表達，聯合應用瘦素可減輕腎小管上皮細胞凋亡，這一過程可能通過改變 JAK/STAT 信號途徑而發揮作用[23]。
2 甲基化與 AKI
甲基化可通過 DNA 甲基化或蛋白甲基化導致表觀遺傳學改變。DNA 甲基化是指從活性甲基化合物（如 S 腺苷基甲硫氨酸）上將甲基催化轉移到胞嘧啶或腺嘌呤 DNA 核苷酸。這個過程是由 DNA 轉移酶家族催化。DNA 甲基化在發育及疾病發生發展基因條件過程中起著重要作用，包括 AKI。Pratt 等[24]2006 年首次報道在 I/R-誘導 AKI 大鼠腎臟 DNA 甲基化狀態的變化。隨后，DNA 啟動子異常超甲基化狀態被認為是 AKI 的腎損傷標志物。例如，腎移植患者與正常健康人群相比較，尿液降鈣素基因啟動子甲基化水平顯著升高。另外，急性腎小管壞死患者尿液降鈣素基因啟動子甲基化水平也明顯升高[25]。血漿尿酸鹽轉運體啟動子 Slc22a12 區域非甲基化 DNA 在基線水平不表達，而在 AKI 后其表達顯著升高[26]。腎內的啟動子激肽釋放酶 1（kallikrein-1，KLK1）CpG 甲基化在血清中的水平高于尿液 DNA，而 AKI 血液 DNA 的 KLK1 甲基化水平高于健康對照者，雖然 AKI 患者尿中 KLK1 甲基化有升高趨勢，但其直接與早期/初期的 KLK1 分泌變化相一致，而不是與后期/晚期的一致[27]。Huang 等[28]進一步發現，腎臟 I/R 損傷可導致小鼠腎小球 5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmc）水平下降。I/R 損傷也可以減少 Cxc110 和 Ifngr2 基因啟動子 5hmc 富集，從而降低腎臟中 Cxc110 和 Ifngr2 mRNA 表達[28]。在順鉑誘導的 AKI 小鼠模型中，發現存在 215 種不同的甲基化 DNA 區域，包括 15 種蛋白編碼的啟動子或啟動子調控區[29]。上述結果均提示在 AKI 過程中存在 DNA 甲基化改變。需要更深入的研究揭示胞嘧啶甲基化與 AKI 的關系。
乙酰化與“開放”的染色質狀態和基因表達活化相關不同，組蛋白甲基化提供了染色質修飾物的錨位點，可以改變轉錄過程而產生不同的后果——染色質和轉錄標志物的活化，靜止和抑制狀態。已知的甲基化位點包括，H3 上的 6 個賴氨酸殘基（K4、K9、K23、K27、K36、K56 和 K79），H4 上的 K20，H1 上的 K26，以及 H3 上的精氨酸（R）殘基（R2、R8、R17、R26），H4 上的 R3，H2A 上的 R11 和 R29。一般情況下，H3K4、H3K36 和 H3K79 促進轉錄活化，而 H3K9、H3K27 和 H4K20 抑制基因轉錄[30]。組蛋白賴氨酸和精氨酸甲基化修飾受甲基轉移酶和去甲基化酶調控。組蛋白甲基化酶包括兩大類，即賴氨酸甲基化酶和精氨酸甲基化酶。賴氨酸特異性去甲基化酶（LSD 和 KDM）包括 KDM1 到 KDM6 等 6 個 LSD 家族。
有關組蛋白甲基化在 AKI 中的作用研究較少。有研究發現，缺血損傷后，腎臟 TNF-α 首尾外顯子上的組蛋白 3 的 4 位點的賴氨酸三甲基化（H3K4m3）水平上升[31]。AKI 患者 HMG-CoA 還原酶（HMG-CoA reductase，HMGCR）基因外顯子 3 水平升高，有助于 HMGCR 活性上調[32]。在 3 種不同 AKI 動物模型中（脂多糖預處理、馬來酸腎毒性和單側輸尿管梗阻），單核細胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）和 TNF-α 基因外顯子 H3K4m3 水平上升，可以促使 RNA 聚合酶Ⅱ聚集至 MCP-1 和 TNF-α 基因[33]。在 I/R 大鼠模型中，C3 基因的啟動子可以出現強烈的去甲基化修飾[34]。我們的研究也發現，Zeste 同源物增強子 2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）可以催化 H3K27me3，參與單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstrucion，UUO）誘導的腎臟纖維化過程[35]。在缺血和葉酸損傷誘導 AKI 小鼠，藥物抑制 EZH2 可改善腎功能、減輕腎組織損傷、促進腎小管細胞再生（個人通信）。提示 EZH2 有可能成為急慢性腎損傷治療的靶點。
越來越多的證據表明，組蛋白甲基化修飾參與調控細胞去分化和增殖。例如，LSD1，可以使 H3K4 和 H3K9 去甲基化，有助于增強胚胎干細胞分化過程中的去化作用，從而能促使胚胎干細胞向新的細胞狀態轉化[36]。H3K27me3、H3K36me3、H3K4me1/2/3 或 H3K9me3 與多梳組蛋白的相互作用是維持表皮干細胞活性和調控分化的關鍵[37]。此外，反式-2-苯基環丙胺，一種 LSD1 抑制劑，促使組蛋白甲基化增強，可以顯著抑制斑馬魚發育過程中神經肥大細胞的增殖，并促進神經細胞凋亡[38]，提示 LSD1 影響神經肥大細胞的生長和生存。腎小管上皮細胞增殖和分化是 AKI 腎臟再生的核心機制，組蛋白甲基化修飾也可能參與其中。甲基化酶 G9a 催化的組蛋白甲基化參與 UUO 誘導的腎臟纖維化[39]，SMYD2 催化的組蛋白甲基化和多種信號蛋白（STAT3、NF-κB、p53）甲基化修飾參與腎囊腫發育和炎癥反應[40]，其是否參與 AKI 均值得深入研究。通過運用藥物和基因技術開展更深入的研究，揭示組蛋白甲基化修飾在 AKI 中的作用。
3 miRNA 與 AKI
miRNA 是一類內源性的、短的非編碼 RNA 分子，在轉錄后水平調控基因表達，從而在不同的細胞過程中暗示自己，包括發育、細胞分化和增殖、細胞周期、細胞凋亡和代謝[41]。已有研究表明 miRNA 參與包括 AKI 在內的腎臟病病理過程。miRNA 在 AKI 中的作用首先是在一個腎小管特異性基因敲除 Dicer（一種調控 miRNA 生成的酶）的小鼠模型中被證實的，大約 80% 的 miRNA 被去除[42]。在急性 I/R 損傷過程中，相對于野生型小鼠，腎皮質中 miRNA 的下調表現出腎臟保護作用，包括改善腎功能，減輕組織損傷，減少腎小管凋亡和提高存活率[42]。與這些觀察相一致，進一步的研究還表明含有微泡的 miRNA 保護腎臟對抗缺血性 AKI[43]。
目前為止，許多特異性 miRNA，包括 miRNA-24、miRNA-494、miRNA-21 和 miRNA-127 在 AKI 中的作用被證實。I/R 損傷后的小鼠腎臟和腎移植后患者腎組織中 miRNA-24 表達上調[44]。在腎臟內皮細胞和腎小管上皮細胞缺氧狀態下，miRNA-24 過表達誘導凋亡和降低功能性參數，而 miRNA-24 基因沉默可以減少凋亡和改善功能性參數[44]。體內實驗也表明，小鼠 I/R 損傷前給予 miRNA-24 基因沉默，有助于提高生存率和改善腎功能，減少凋亡，改善腎小管組織學損傷，減少炎細胞浸潤[44]。上述結果表明，miRNA-24 通過促進內皮和腎小管上皮細胞凋亡加劇腎缺血損傷，提示抑制 miRNA-24 可能成為治療 AKI 的有效手段之一。
I/R 損傷后腎組織中 miRNA-494 表達也上調，其可以顯著降低活化轉錄因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）的水平，促進炎癥介質的表達，包括 IL-6、MCP-1、P-選擇素和 NF-κB 依賴性炎癥反應，促進細胞凋亡和惡化腎功能[45]。與對照組相比，I/R 模型和 AKI 患者尿液中 miRNA-494 水平顯著升高早于血清中[45]。因此，I/R 損傷后，miRNA-494 上調，通過抑制 ATF3 表達，從而促進炎癥和黏附分子誘導的腎臟損傷。且miRNA-494 可成為 AKI 特異性和無創性生物學標志物。
在體外，腎小管上皮細胞中基因敲除 miRNA-21 可以增加細胞死亡，而 miRNA-21 過表達有助于減少細胞死亡[46]。在體內研究還表明，預處理誘導 miRNA-21 表達上調有助于保護腎臟 I/R 損傷，其機制可能與其靶基因程序性細胞死亡 4 基因以及其與低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）之間的相互作用有關。提示 miRNA-21 在 AKI 中具有保護作用。另一種 miRNA，miRNA-127 是細胞和細胞基質黏附的關鍵調節物質，通過 HIF-1 保護近端腎小管細胞對抗腎 I/R 損傷，其靶蛋白驅動蛋白家族成員 3B（KIF3B），在細胞內吞過程中作用顯著[47]。在缺氧和缺血狀態下，miRN-687 可通過 HIF-1 誘導產生，進而抑制 PTEN，促進細胞周期活化，促使腎小管細胞增殖和腎臟修復[48]。上述研究表明，miRNA 參與 AKI 的損傷和修復過程，提示調控 miRNA 可能成為缺血性腎損傷疾病的潛在治療途徑。
4 其他組蛋白修飾和 AKI
除了上述的組蛋白修飾，組蛋白磷酸化和小泛素樣修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）化也參與 AKI 過程。組蛋白磷酸化可發生于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上，并參與 DNA 損傷修復、轉錄調控和染色質致密化[49]。有證據表明組蛋白磷酸化與其他修飾方式（乙酰化和甲基化）存在交互對話機制[50]。組蛋白 H3 的 10 和 28 位點絲氨酸殘基，H2B 的 32 位點絲氨酸殘基磷酸化與表皮生長因子-反應性基因轉錄相關[49]。表皮生長因子和表皮生長因子受體在 AKI 后腎臟損傷修復過程中起著非常重要的作用，提示組蛋白磷酸化可能參與腎臟修復和功能改善。
SUMO 化是一種翻譯后修飾形式，其中 SUMO 與靶蛋白共價連接以調節其特性。一項研究發現，在小鼠缺血和順鉑腎毒性 AKI 中，出現蛋白 SUMO 化的動態變化，SUMO 化抑制劑銀杏酚酸可以抑制 SUMO 化，促進順鉑誘導的細胞凋亡，提示 SUMO 化是損傷后腎小管上皮細胞的保護機制之一[51]。
組蛋白巴豆酰化是由巴豆酰基轉移酶催化的一種翻譯后修飾形式，即將巴豆酰輔酶 A 上的巴豆酰基轉移至賴氨酸殘基[52]。賴氨酸巴豆酰化相對保守，其催化酶與乙酰化酶共享，存在于包括腎臟在內的許多組織中，也參與 AKI 的發生發展[52]。共激活因子 P300 具有組蛋白巴豆酰化酶活性，SIRT3 具有去巴豆酰化酶活性[53]。組蛋白巴豆酰化可以通過基因依賴性或環境依賴性激活或抑制基因轉錄。P300 催化的組蛋白巴豆酰化可以較乙酰化能更大程度地直接激活轉錄[53]。有研究發現，組蛋白巴豆酰化參與細菌脂多糖誘導的炎癥因子表達[53]。在腎毒性 AKI 動物模型中，腎小球組蛋白巴豆酰化顯著增加[52]，人類和鼠類 AKI 中，組蛋白巴豆酰化局限于腎小管細胞核中，其可能是由 TWEAK 等炎癥細胞因子誘導的炎癥反應驅動[54]。
其他組蛋白修飾，如泛素化、ADP 核糖基化、脫氨基、羰基化和糖基化在其他疾病[55-57]中均有報道，但在 AKI 中卻鮮有相關的結論。
5 結論與展望
雖然對于 AKI 的分子機制已經取得了很大進展，如果腎功能無法恢復，其治療仍局限于支持治療和腎臟替代治療。表觀遺傳學調控可以把瞬間或偶然出現的環境因素或事件轉化為持續可以傳代的能力，其最新進展有助于我們尋找治療 AKI 的新療法。越來越多的證據表明，至少有 3 種表觀遺傳學修飾（乙酰化、甲基化和 miRNA）參與 AKI，尤其是腎臟損傷后修復的發生發展。表觀遺傳學修飾物在 AKI 中異常表達，提示其可能成為 AKI 的潛在標志物。但尚不完全明確表觀遺傳學修飾在 AKI 發生發展中的分子機制。進一步闡明其作用機制可以為表觀遺傳學治療在 AKI 中的應用提供細胞和分子基礎。雖然這些表觀遺傳機制參與 AKI 的病理生理過程，但其之間的交互對話機制和途徑尚不明確，而在腫瘤中存在明顯的 miRNA 與甲基化和乙酰化的交互對話。這 3 種表觀遺傳修飾形式之間的整合網絡可能構成了乙酰化-甲基化-miRNA 調控環，其與轉錄和轉錄后途徑交織在一起，開啟了潛在的交互對話事件和染色質信號網絡。未來的研究將致力于明確 AKI 過程中表觀遺傳學修飾的靶蛋白和分子機制，從而為開發新的藥物和特異性治療手段打下理論基礎。
急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一類腎功能在短期內急性減退的臨床常見危重病，由多種病因造成，包括缺血/再灌注（ischemia/reperfusion， I/R）損傷、膿毒血癥或腎毒性藥物等。在普通住院患者中 AKI 的發病率普遍報道在 3.2%～9.6%，在危重癥的重癥監護病房患者中其發病率在 5% 至>10%[1-2]。近年來 AKI 的發病率逐年增長，影響全球數百萬患者，可導致死亡率上升或不可逆腎功能損害而需終身透析。在過去的數十年間，盡管 AKI 的發病機制及血液凈化技術不斷進步，但目前仍缺乏行之有效的藥物治療措施，患者病死率仍居高不下，達 50% 以上[1]。因此，研究 AKI 的發病機制及有效治療措施至關重要。
相對于心、腦組織，腎臟具有強大的再生修復能力[3-4]，在一定程度上可從缺血或其他損傷造成的腎小管壞死中恢復。有研究采用基因譜系示蹤研究證實，AKI 后腎臟再生的腎小管細胞主要來源于殘存腎小管上皮細胞的擴增[5-6]。發生 AKI 后，在缺血、毒素等損傷下，腎小管上皮細胞發生變性、凋亡、壞死，上皮細胞脫落、腎小管基底膜裸露，殘存的小管上皮細胞首先發生表型去分化，轉變成為能夠增殖的細胞，進而發生增生、遷移，最后再分化形成成熟的腎小管細胞[7]，在一定程度上可使腎臟上皮恢復其正常功能和結構。盡管目前關于 AKI 后腎小管上皮細胞再生修復的發生機制并不完全明了，有報道顯示，某些分子如波形蛋白、Pax-2 和神經細胞黏附分子，正常情況下這些分子表達在腎臟發育過程中的后腎間質而在成熟的腎臟并不表達，但是在腎小管損傷后修復的過程中，這些分子則在成熟的腎臟發生再表達[8-10]。這提示腎臟損傷后的再生過程可能模擬早期腎臟發育的過程。
表觀遺傳學調節參與腎臟發育過程，在基因轉錄調控中起重要作用。表觀遺傳學是指在不改變基因組 DNA 序列條件下，基因功能發生可遺傳的遺傳信息變化，最終導致可遺傳的表型變化，包括組蛋白和 DNA 甲基化、組蛋白乙酰化等。我們近期研究顯示組蛋白乙酰化參與 AKI 后腎小管上皮細胞的再生修復過程。Ⅰ 型組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）活性具有腎臟保護作用，而抑制 Ⅰ 型 HDAC 活性，加重葉酸或橫紋肌溶解誘導 AKI 小鼠腎功能損害，促進腎小管上皮細胞凋亡，抑制腎小管上皮細胞去分化、增殖的再生修復過程[11]；抑制 HDAC6 活性保護橫紋肌溶解或順鉑誘導的 AKI，減輕腎小管上皮細胞凋亡，減少炎癥因子釋放，改善腎組織氧化應激水平，促進腎小管上皮細胞再生修復[12-13]。DNA 和組蛋白甲基化以及微 RNA（microRNA，miRNA）也參與 AKI、慢性腎臟病（chronic kidney diseases，CKD）以及 AKI-CKD 轉換等病理生理過程[14]。
大量研究顯示表觀遺傳學參與 AKI 發病機制，在本文我們將闡述表觀遺傳學修飾包括乙酰化、甲基化和 miRNA 在 AKI 中的最新研究進展。
1 乙酰化與 AKI
緊密的染色體結構部分依賴于組蛋白上正電荷和 DNA 上負電荷之間的相互作用。組蛋白乙酰化可移除組蛋白的正電荷，從而降低組蛋白對帶負電荷 DNA 的親和性，使染色質結構松弛，有利于各種轉錄因子和協同轉錄因子能與 DNA 結合位點特異性結合，激活基因的轉錄。組蛋白乙酰化和去乙酰化是由組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）和 HDAC 兩種酶所催化。HAT 是一組將乙酰輔酶 A 的乙酰基轉移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上形成-N-乙酰賴氨酸。HDAC 則將乙酰基從組蛋白或非組蛋白的-氨基賴氨酸殘基移除，導致染色質致密卷曲，從而抑制基因的轉錄。目前共發現 18 種 HDAC，根據序列同源性及進化分析，被分為 4 種類型：Ⅰ 型 HDAC 包括 HDAC1～3、8，Ⅱ 型 HDAC 包括 HDAC4～7、9、10，Ⅲ 型 HDAC 包括 SIRT1～7， Ⅳ 型 HDAC 為 HDAC11。
HDAC 活化參與 AKI 后腎臟再生修復過程，在不同腎臟損傷模型中起不同的作用。HDAC 活化導致細胞存活還是細胞死亡，取決于不同細胞類型和不同損傷刺激方式。我們課題組研究發現，在葉酸或橫紋肌溶解誘導 AKI 模型小鼠，應用 MS-275 抑制Ⅰ型 HDAC 活性加重小鼠腎臟損害，表現為腎功能惡化、腎損傷標志物中性粒細胞明膠酶脂質運載蛋白表達增加、腎小管上皮細胞凋亡加重以及 胱天蛋白酶（caspase）-3 表達上升，同時抑制腎小管上皮細胞去分化標志物波形蛋白及增殖標志物增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達。這些結果顯示抑制 Ⅰ 型 HDAC 促進腎小管上皮細胞凋亡，抑制腎小管上皮細胞去分化、增殖的再生修復過程[11]。在體外實驗，應用 MS-275 抑制Ⅰ型 HDAC 活性，或應用小干擾 RNA 沉默 HDAC1、3 和 8 活性，可誘導組蛋白乙酰化水平增加，降低體外腎小管近端小管細胞增殖，減少細胞周期蛋白 cyclin D1 和 PCNA 的表達，提示Ⅰ型 HDAC 介導腎小管細胞增殖[11]。但是其他課題組在脂多糖誘導膿毒癥 AKI 小鼠模型中發現，MS-275 抑制Ⅰ型 HDAC 活性通過抑制活性氧的氧化應激和內皮網應激而起腎臟保護作用；MS-275 的干預緩解了脂多糖-誘導 AKI 小鼠腎臟損害，提高脂多糖-誘導膿毒癥模型的存活率，減輕腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL) -1β、IL-6、環氧化酶-2 的表達和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 的核轉位，并抑制 AKI 小鼠腎組織活性氧的產生。體外應用人腎小管上皮細胞 HK-2 細胞研究也顯示，MS-275 減輕脂多糖-誘導 HK-2 細胞凋亡，抑制活性氧和丙二醛的產生，增加谷胱甘肽生成和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，并減少與內質網應激相關的 C/EBP 同源蛋白、葡萄糖調節蛋白78、caspase-3 和 caspase-12 表達。因此，MS-275 抑制 Ⅰ 型 HDAC 活性可能通過活性氧介導的氧化應激和內質網應激改善腎功能并減輕脂多糖-誘導 AKI [15]。在順鉑-誘導腎素性腎損傷小鼠模型中，Ⅰ 型及 Ⅱ 型 HDAC 抑制劑曲古抑菌素 A 可抑制順鉑-誘導腎損傷、腎臟炎癥及腎上皮細胞凋亡，同時上調腎上皮抗炎蛋白-活化的小膠質細胞/巨噬細胞 WAP 結構域蛋白，后者是 HDAC 發揮腎臟保護作用的重要介質[16-17]。在馬兜鈴酸誘導小鼠腎損傷模型中，HDAC 抑制劑 4-甲基苯硫代丁酸酯可促進腎臟損傷再生修復，減少再生中的腎小管上皮細胞在 G2/M 細胞周期阻滯，并改善 AKI 后腎臟纖維化進展[18]。
Ⅱ 型 HDAC 在 AKI 中也發揮重要的作用。我們近期研究發現，應用 tubastatin A 抑制 HDAC6 活性保護橫紋肌溶解或順鉑誘導的 AKI，緩解腎組織病理損傷，減輕腎小管上皮細胞凋亡，減少炎癥因子釋放，改善腎組織氧化應激水平，促進腎小管上皮細胞再生修復[12-13]。機制研究發現，順鉑干預誘導小鼠腎臟 AKT 活化及上皮鈣黏素（E-cadherin）表達下降，而抑制 HDAC6 活性增加順鉑-誘導小鼠損傷腎臟 AKT 活化進一步增加并維持 E-cadherin 表達，同時增強腎組織自噬及減輕腎臟氧化應激，同時抑制 NF-κB 磷酸化及 TNF-α 和 IL-6 的表達[12]。應用另一種 HDAC6 抑制劑 23BB 化合物抑制 HDAC6 活性同樣對橫紋肌溶解-誘導 AKI 起保護作用，通過抑制內質網應激減少腎小管上皮細胞凋亡[19]。在 I/R 損傷小鼠腎臟，缺血階段 I/R 誘導組蛋白乙酰化短暫下降，隨后在灌注恢復階段 HDAC5 表達下調，從而誘導近端腎小管細胞骨形成蛋白-7 的表達[20]，后者是腎缺血損傷后腎小管上皮細胞再生修復的重要介質[21]。
Ⅲ 型 HDAC 成員 SIRT1 及 SIRT3 活化在盲腸結扎穿孔術誘導膿毒敗血癥大鼠 AKI 模型延緩腎臟損傷[22]。膿毒敗血癥過程中，腎小管上皮細胞 SIRT1/3 活性下降，SOD2 乙酰化增加，氧化應激水平升高，伴有線粒體損傷。而應用白藜蘆醇誘導 SIRT1/3 活化，可有效地減少 SOD2 乙酰化水平，減輕氧化應激和線粒體功能受損，延長小鼠存活時間[22]，提示 SIRT1/3 活化在膿毒血癥相關 AKI 中潛在的治療前景。在 I/R 損傷大鼠 AKI 模型中，白藜蘆醇干預顯著增加 SIRT1 基因表達，聯合應用瘦素可減輕腎小管上皮細胞凋亡，這一過程可能通過改變 JAK/STAT 信號途徑而發揮作用[23]。
2 甲基化與 AKI
甲基化可通過 DNA 甲基化或蛋白甲基化導致表觀遺傳學改變。DNA 甲基化是指從活性甲基化合物（如 S 腺苷基甲硫氨酸）上將甲基催化轉移到胞嘧啶或腺嘌呤 DNA 核苷酸。這個過程是由 DNA 轉移酶家族催化。DNA 甲基化在發育及疾病發生發展基因條件過程中起著重要作用，包括 AKI。Pratt 等[24]2006 年首次報道在 I/R-誘導 AKI 大鼠腎臟 DNA 甲基化狀態的變化。隨后，DNA 啟動子異常超甲基化狀態被認為是 AKI 的腎損傷標志物。例如，腎移植患者與正常健康人群相比較，尿液降鈣素基因啟動子甲基化水平顯著升高。另外，急性腎小管壞死患者尿液降鈣素基因啟動子甲基化水平也明顯升高[25]。血漿尿酸鹽轉運體啟動子 Slc22a12 區域非甲基化 DNA 在基線水平不表達，而在 AKI 后其表達顯著升高[26]。腎內的啟動子激肽釋放酶 1（kallikrein-1，KLK1）CpG 甲基化在血清中的水平高于尿液 DNA，而 AKI 血液 DNA 的 KLK1 甲基化水平高于健康對照者，雖然 AKI 患者尿中 KLK1 甲基化有升高趨勢，但其直接與早期/初期的 KLK1 分泌變化相一致，而不是與后期/晚期的一致[27]。Huang 等[28]進一步發現，腎臟 I/R 損傷可導致小鼠腎小球 5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmc）水平下降。I/R 損傷也可以減少 Cxc110 和 Ifngr2 基因啟動子 5hmc 富集，從而降低腎臟中 Cxc110 和 Ifngr2 mRNA 表達[28]。在順鉑誘導的 AKI 小鼠模型中，發現存在 215 種不同的甲基化 DNA 區域，包括 15 種蛋白編碼的啟動子或啟動子調控區[29]。上述結果均提示在 AKI 過程中存在 DNA 甲基化改變。需要更深入的研究揭示胞嘧啶甲基化與 AKI 的關系。
乙酰化與“開放”的染色質狀態和基因表達活化相關不同，組蛋白甲基化提供了染色質修飾物的錨位點，可以改變轉錄過程而產生不同的后果——染色質和轉錄標志物的活化，靜止和抑制狀態。已知的甲基化位點包括，H3 上的 6 個賴氨酸殘基（K4、K9、K23、K27、K36、K56 和 K79），H4 上的 K20，H1 上的 K26，以及 H3 上的精氨酸（R）殘基（R2、R8、R17、R26），H4 上的 R3，H2A 上的 R11 和 R29。一般情況下，H3K4、H3K36 和 H3K79 促進轉錄活化，而 H3K9、H3K27 和 H4K20 抑制基因轉錄[30]。組蛋白賴氨酸和精氨酸甲基化修飾受甲基轉移酶和去甲基化酶調控。組蛋白甲基化酶包括兩大類，即賴氨酸甲基化酶和精氨酸甲基化酶。賴氨酸特異性去甲基化酶（LSD 和 KDM）包括 KDM1 到 KDM6 等 6 個 LSD 家族。
有關組蛋白甲基化在 AKI 中的作用研究較少。有研究發現，缺血損傷后，腎臟 TNF-α 首尾外顯子上的組蛋白 3 的 4 位點的賴氨酸三甲基化（H3K4m3）水平上升[31]。AKI 患者 HMG-CoA 還原酶（HMG-CoA reductase，HMGCR）基因外顯子 3 水平升高，有助于 HMGCR 活性上調[32]。在 3 種不同 AKI 動物模型中（脂多糖預處理、馬來酸腎毒性和單側輸尿管梗阻），單核細胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）和 TNF-α 基因外顯子 H3K4m3 水平上升，可以促使 RNA 聚合酶Ⅱ聚集至 MCP-1 和 TNF-α 基因[33]。在 I/R 大鼠模型中，C3 基因的啟動子可以出現強烈的去甲基化修飾[34]。我們的研究也發現，Zeste 同源物增強子 2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）可以催化 H3K27me3，參與單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstrucion，UUO）誘導的腎臟纖維化過程[35]。在缺血和葉酸損傷誘導 AKI 小鼠，藥物抑制 EZH2 可改善腎功能、減輕腎組織損傷、促進腎小管細胞再生（個人通信）。提示 EZH2 有可能成為急慢性腎損傷治療的靶點。
越來越多的證據表明，組蛋白甲基化修飾參與調控細胞去分化和增殖。例如，LSD1，可以使 H3K4 和 H3K9 去甲基化，有助于增強胚胎干細胞分化過程中的去化作用，從而能促使胚胎干細胞向新的細胞狀態轉化[36]。H3K27me3、H3K36me3、H3K4me1/2/3 或 H3K9me3 與多梳組蛋白的相互作用是維持表皮干細胞活性和調控分化的關鍵[37]。此外，反式-2-苯基環丙胺，一種 LSD1 抑制劑，促使組蛋白甲基化增強，可以顯著抑制斑馬魚發育過程中神經肥大細胞的增殖，并促進神經細胞凋亡[38]，提示 LSD1 影響神經肥大細胞的生長和生存。腎小管上皮細胞增殖和分化是 AKI 腎臟再生的核心機制，組蛋白甲基化修飾也可能參與其中。甲基化酶 G9a 催化的組蛋白甲基化參與 UUO 誘導的腎臟纖維化[39]，SMYD2 催化的組蛋白甲基化和多種信號蛋白（STAT3、NF-κB、p53）甲基化修飾參與腎囊腫發育和炎癥反應[40]，其是否參與 AKI 均值得深入研究。通過運用藥物和基因技術開展更深入的研究，揭示組蛋白甲基化修飾在 AKI 中的作用。
3 miRNA 與 AKI
miRNA 是一類內源性的、短的非編碼 RNA 分子，在轉錄后水平調控基因表達，從而在不同的細胞過程中暗示自己，包括發育、細胞分化和增殖、細胞周期、細胞凋亡和代謝[41]。已有研究表明 miRNA 參與包括 AKI 在內的腎臟病病理過程。miRNA 在 AKI 中的作用首先是在一個腎小管特異性基因敲除 Dicer（一種調控 miRNA 生成的酶）的小鼠模型中被證實的，大約 80% 的 miRNA 被去除[42]。在急性 I/R 損傷過程中，相對于野生型小鼠，腎皮質中 miRNA 的下調表現出腎臟保護作用，包括改善腎功能，減輕組織損傷，減少腎小管凋亡和提高存活率[42]。與這些觀察相一致，進一步的研究還表明含有微泡的 miRNA 保護腎臟對抗缺血性 AKI[43]。
目前為止，許多特異性 miRNA，包括 miRNA-24、miRNA-494、miRNA-21 和 miRNA-127 在 AKI 中的作用被證實。I/R 損傷后的小鼠腎臟和腎移植后患者腎組織中 miRNA-24 表達上調[44]。在腎臟內皮細胞和腎小管上皮細胞缺氧狀態下，miRNA-24 過表達誘導凋亡和降低功能性參數，而 miRNA-24 基因沉默可以減少凋亡和改善功能性參數[44]。體內實驗也表明，小鼠 I/R 損傷前給予 miRNA-24 基因沉默，有助于提高生存率和改善腎功能，減少凋亡，改善腎小管組織學損傷，減少炎細胞浸潤[44]。上述結果表明，miRNA-24 通過促進內皮和腎小管上皮細胞凋亡加劇腎缺血損傷，提示抑制 miRNA-24 可能成為治療 AKI 的有效手段之一。
I/R 損傷后腎組織中 miRNA-494 表達也上調，其可以顯著降低活化轉錄因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）的水平，促進炎癥介質的表達，包括 IL-6、MCP-1、P-選擇素和 NF-κB 依賴性炎癥反應，促進細胞凋亡和惡化腎功能[45]。與對照組相比，I/R 模型和 AKI 患者尿液中 miRNA-494 水平顯著升高早于血清中[45]。因此，I/R 損傷后，miRNA-494 上調，通過抑制 ATF3 表達，從而促進炎癥和黏附分子誘導的腎臟損傷。且miRNA-494 可成為 AKI 特異性和無創性生物學標志物。
在體外，腎小管上皮細胞中基因敲除 miRNA-21 可以增加細胞死亡，而 miRNA-21 過表達有助于減少細胞死亡[46]。在體內研究還表明，預處理誘導 miRNA-21 表達上調有助于保護腎臟 I/R 損傷，其機制可能與其靶基因程序性細胞死亡 4 基因以及其與低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）之間的相互作用有關。提示 miRNA-21 在 AKI 中具有保護作用。另一種 miRNA，miRNA-127 是細胞和細胞基質黏附的關鍵調節物質，通過 HIF-1 保護近端腎小管細胞對抗腎 I/R 損傷，其靶蛋白驅動蛋白家族成員 3B（KIF3B），在細胞內吞過程中作用顯著[47]。在缺氧和缺血狀態下，miRN-687 可通過 HIF-1 誘導產生，進而抑制 PTEN，促進細胞周期活化，促使腎小管細胞增殖和腎臟修復[48]。上述研究表明，miRNA 參與 AKI 的損傷和修復過程，提示調控 miRNA 可能成為缺血性腎損傷疾病的潛在治療途徑。
4 其他組蛋白修飾和 AKI
除了上述的組蛋白修飾，組蛋白磷酸化和小泛素樣修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）化也參與 AKI 過程。組蛋白磷酸化可發生于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上，并參與 DNA 損傷修復、轉錄調控和染色質致密化[49]。有證據表明組蛋白磷酸化與其他修飾方式（乙酰化和甲基化）存在交互對話機制[50]。組蛋白 H3 的 10 和 28 位點絲氨酸殘基，H2B 的 32 位點絲氨酸殘基磷酸化與表皮生長因子-反應性基因轉錄相關[49]。表皮生長因子和表皮生長因子受體在 AKI 后腎臟損傷修復過程中起著非常重要的作用，提示組蛋白磷酸化可能參與腎臟修復和功能改善。
SUMO 化是一種翻譯后修飾形式，其中 SUMO 與靶蛋白共價連接以調節其特性。一項研究發現，在小鼠缺血和順鉑腎毒性 AKI 中，出現蛋白 SUMO 化的動態變化，SUMO 化抑制劑銀杏酚酸可以抑制 SUMO 化，促進順鉑誘導的細胞凋亡，提示 SUMO 化是損傷后腎小管上皮細胞的保護機制之一[51]。
組蛋白巴豆酰化是由巴豆酰基轉移酶催化的一種翻譯后修飾形式，即將巴豆酰輔酶 A 上的巴豆酰基轉移至賴氨酸殘基[52]。賴氨酸巴豆酰化相對保守，其催化酶與乙酰化酶共享，存在于包括腎臟在內的許多組織中，也參與 AKI 的發生發展[52]。共激活因子 P300 具有組蛋白巴豆酰化酶活性，SIRT3 具有去巴豆酰化酶活性[53]。組蛋白巴豆酰化可以通過基因依賴性或環境依賴性激活或抑制基因轉錄。P300 催化的組蛋白巴豆酰化可以較乙酰化能更大程度地直接激活轉錄[53]。有研究發現，組蛋白巴豆酰化參與細菌脂多糖誘導的炎癥因子表達[53]。在腎毒性 AKI 動物模型中，腎小球組蛋白巴豆酰化顯著增加[52]，人類和鼠類 AKI 中，組蛋白巴豆酰化局限于腎小管細胞核中，其可能是由 TWEAK 等炎癥細胞因子誘導的炎癥反應驅動[54]。
其他組蛋白修飾，如泛素化、ADP 核糖基化、脫氨基、羰基化和糖基化在其他疾病[55-57]中均有報道，但在 AKI 中卻鮮有相關的結論。
5 結論與展望
雖然對于 AKI 的分子機制已經取得了很大進展，如果腎功能無法恢復，其治療仍局限于支持治療和腎臟替代治療。表觀遺傳學調控可以把瞬間或偶然出現的環境因素或事件轉化為持續可以傳代的能力，其最新進展有助于我們尋找治療 AKI 的新療法。越來越多的證據表明，至少有 3 種表觀遺傳學修飾（乙酰化、甲基化和 miRNA）參與 AKI，尤其是腎臟損傷后修復的發生發展。表觀遺傳學修飾物在 AKI 中異常表達，提示其可能成為 AKI 的潛在標志物。但尚不完全明確表觀遺傳學修飾在 AKI 發生發展中的分子機制。進一步闡明其作用機制可以為表觀遺傳學治療在 AKI 中的應用提供細胞和分子基礎。雖然這些表觀遺傳機制參與 AKI 的病理生理過程，但其之間的交互對話機制和途徑尚不明確，而在腫瘤中存在明顯的 miRNA 與甲基化和乙酰化的交互對話。這 3 種表觀遺傳修飾形式之間的整合網絡可能構成了乙酰化-甲基化-miRNA 調控環，其與轉錄和轉錄后途徑交織在一起，開啟了潛在的交互對話事件和染色質信號網絡。未來的研究將致力于明確 AKI 過程中表觀遺傳學修飾的靶蛋白和分子機制，從而為開發新的藥物和特異性治療手段打下理論基礎。