引用本文： 甘奇, 張晗媚, 馬衛朝, 劉翼. 芬戈莫德對大鼠丘腦-腦室出血后繼發性神經損傷的保護作用. 華西醫學, 2018, 33(6): 736-743. doi: 10.7507/1002-0179.201805035 復制
原發性腦出血占腦血管病總體發病的 20%～30%，急性期內的病死率為 30%～40%[1]。過去 10 年，全球因腦出血而入院治療的患者并未減少，其中約有 15% 為丘腦出血[2]。針對中等量丘腦出血破入腦室的患者，尚未能明確有效地改善預后的治療方法。到目前為止，因血腫對丘腦造成結構上的破壞損傷，這類原發性損傷無論通過手術治療還是內科治療都無法修復。因此，對腦出血導致的各種繼發性損傷的機制和干預的探究已經成為目前的研究熱點。
芬戈莫德（FTY720）是近年來合成出的一種新型免疫抑制劑，其在體內具有雙向免疫調節作用，在體內抑制免疫反應的同時，不產生機體對病毒免疫應答和免疫記憶的干擾[3-6]。FTY720 目前已被美國食品藥品監督管理局批準成為治療復發性多發性硬化的口服藥物[7]。近年來關于 FTY720 的研究越來越多，除本身強大的免疫抑制作用外，FTY720 還被發現其通過對腫瘤細胞的凋亡、壞死、自噬的調控發揮抗腫瘤作用[8-10]。目前只有極少量文獻報道 FTY720 在腦出血中可發揮一定的神經保護作用，其機制尚不明確[11-14]。本研究將基于丘腦-腦室出血（thalamic-ventricle hemorrhage，TH-IVH）動物模型構建基礎上，探討 FTY720 對大鼠 TH-IVH 后繼發性神經損傷中的保護作用。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 實驗動物
清潔級成年雄性 Sprague Dawley 大鼠 60 只，鼠齡 5～6 個月，體質量 400～500 g，由成都達碩實驗動物公司提供。
1.1.2 飼養條件
四川大學華西醫院神經外科研究室動物房內分籠喂養。動物房恒溫：20～24℃；濕度環境：45%～55%；光照：12 h 明暗晝夜交替；自由進食及飲水。每只大鼠至少在動物房飼養 1 周后進行實驗，實驗大鼠術前 6 h 禁食、禁飲。
1.2 研究方法
1.2.1 實驗動物分組
將實驗動物隨機分為 3 組，即假手術組（Sham 組）、TH-IVH 組和干預組（FTY720 組），每組 6 只大鼠。TH-IVH 組和 FTY720 組所有大鼠均建立 TH-IVH 模型，注入自體血 60 μL。FTY720 組大鼠在建模后的 0～7 d 均采用 FTY720（25 mg/支，凍干粉，美國 Sigma 公司）進行干預，腹腔注射量為 1 mg/kg，1 次/d。
1.2.2 大鼠 TH-IVH 模型建立
① 消毒相關手術器械及立體定向儀；實驗人員佩戴口罩、洗手、帶無菌手套；嚴格按照無菌要求，恒溫載物臺保持動物體溫在（37.0±0.5）℃。② 大鼠術前 6 h 禁食、禁水，過電子天平稱重后，記錄體質量，采用 10% 水合氯醛，按 3.5 mL/kg 行腹腔注射麻醉，麻醉生效為觸須反射及角膜反射消失，額頂部備皮。③ 將麻醉成功的大鼠，取俯臥位，將其門齒及雙側外耳道固定于腦立體定向儀上，保持前后囟門位于同一水平高度，左右對稱。備皮處消毒，沿矢狀線切開頭皮約 1 cm，鈍性分離肌肉及骨膜，暴露前囟及冠狀縫。④ 用動物顱骨鉆在距中線向右旁開 3 mm，前囟向后 3.6 mm 處鉆孔，孔徑 1 mm。⑤ 使用動脈穿刺針取足量自體股動脈血，并固定于微量注射器固定桿上。調整立體定向儀將針頭對準顱骨鉆孔位置。垂直緩慢進針，進針深度為皮質下 7.0 mm。⑥ 將自體動脈血通過旋轉推進器勻速緩慢注入右側丘腦區域，注射速度：10 μL/min。先以 10 μL/min 的速度通過微泵注入 10 μL，等待 10 min 后，以相同速度注入剩余自體全血量 50 μL，定位點：前囟后 3.5 mm，右側中線旁開 3.0 mm，深度 7.0 mm。留針 15 min 后緩慢退針，醫用骨蠟封閉骨孔，消毒縫合各個切口，置于 37℃溫箱內保溫復蘇。⑦ 在 Sham 組中，只進針，不采血，不注血，針頭留置相同時間。
1.3 觀察指標
觀察時間點選取建模后 1、3、7 d，主要觀察指標為各組神經功能評分、連續體質量變化、腦組織含水量測定、免疫組織化學法測量炎癥細胞活化程度、免疫熒光法測定神經元變性及凋亡水平、蛋白質印跡法測量蛋白表達水平。
1.3.1 體質量變化測量
大鼠建模后分別連續測量體質量，采用百分比法觀察建模后實驗動物模型的體質量變化。繪制體質量變化曲線。選取各組建模后 1、3、7 d 時間點的體質量變化作比較。體質量變化計算公式：體質量變化（%）=（觀察時間點體質量–初始體質量）/初始體質量×100%。
1.3.2 神經功能檢測評分
采用大鼠改良 Voetsch 評分量表[15]。建模后的大鼠連續測量神經功能評分，評估各組大鼠建模后的神經功能損傷變化。選取各組建模后 1、3、7 d 時間點的分值作比較。
1.3.3 腦組織含水量的測定
采用干濕重差值測定大鼠建模后 1、3、7 d 建模側丘腦的腦組織含水量，比較各組大鼠腦組織水腫程度。腦組織含水量計算公式：含水量（%）=（濕重–干重）/濕重×100%。
1.3.4 免疫熒光法測定神經元變性
采用免疫熒光探針（Fluoro-Jade C，FJC）觀察測定各組模型神經元變性情況。FJC 陽性細胞為綠色熒光顯示，提示變性神經元。
1.3.5 細胞凋亡檢測
凋亡神經元中雙鏈 DNA 損傷斷裂，采用 TUNEL 法可以原位標記出這些斷裂的 DNA，借助熒光素從而能夠評估細胞凋亡水平。凋亡神經元細胞核顯示為綠色熒光，呈綠色點狀。有核細胞的細胞核通過 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染，其細胞核呈藍色點狀。
1.3.6 免疫組織化學檢測炎癥細胞活化程度
腦出血等病理條件下，腦組織中處于靜息狀態下的小膠質細胞可迅速活化、增殖。其在清除來自損傷部位的死亡細胞的同時，參與形成繼發性腦損傷，通過小膠質細胞標志物 IBA-1 檢測其活化程度，采用 IBA-1 抗體標示出模型鼠腦組織中的活化小膠質細胞。IBA-1 陽性提示小膠質細胞活化。陽性細胞呈現為綠色熒光，有核細胞的細胞核通過 DAPI 復染，其細胞核呈藍色點狀。
1.3.7 蛋白質印跡法
采用蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達水平。檢測自噬體標記蛋白（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）的表達。采用 LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ比值作為神經元自噬水平高低的反應。檢測Bcl-2與Bax兩種基因表達。采用Bcl-2/Bax比值作為神經元凋亡水平的反應。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示。組間比較采用重復測量資料的方差分析，并采用 Multivariate 過程實現 TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組之間比較。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 體質量變化測量
連續檢測各組大鼠建模后的體質量變化。Sham 組建模后 1 d 體質量下降，此后連續回升，7 d 后超過建模前；FTY720 組與 TH-IVH 組體質量總體呈連續下降趨勢，7 d 時體質量下降趨于穩定。在建模后 1、3、7 d，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組體質量變化差異有統計學意義（P<0.01）。見表 1。
表1
建模后各組相關指標比較（n=6，
）
2.2 神經功能檢測評分
Sham 組建模后 1 d 神經功能評分下降，此后逐漸緩慢回升；FTY720 組與 TH-IVH 組均出現明顯神經功能障礙，評分明顯大幅下降，此后逐步回升。在建模后 1、3、7 d，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組的神經功能評分差異有統計學意義（P<0.01）。見表 1。
2.3 腦組織含水量的測定
Sham 組的腦組織含水量在建模后 1、3、7 d 無明顯變化趨勢；FTY720 組與 TH-IVH 組從建模后 1 d 開始腦組織水腫程度增加，3 d 左右達到水腫高峰，7 d 水腫程度有所回落，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組腦組織含水量差異有統計學意義（P<0.01）。見表 1。
2.4 免疫熒光法測定神經元變性
Sham 組于建模后 1、3、7 d，陽性細胞數均極少，無明顯變化趨勢；FTY720 組與 TH-IVH 組建模 1 d 后，陽性細胞數明顯升高，3 d 后陽性細胞數減少，7 d 后陽性細胞進一步減少但兩組數量仍明顯多于 Sham 組（圖 1）。建模后 1、3 d，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組比較，FJC 陽性細胞數的差異均有統計學意義（P<0.05）；7 d 時，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組差異均無統計學意義。見表 1。
圖1
各組大鼠 FJC 陽性細胞數/視野
2.5 神經元細胞凋亡檢測
建模后 1 d，TH-IVH 組與 FTY720 組血腫周圍 TUNEL 陽性細胞明顯增加，Sham 組數量稀少；建模 3、7 d 后，Sham 組數量緩慢減少，TH-IVH 組與 FTY720 組血腫周圍陽性細胞持續減少（圖 2）。TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組比較，建模后 1、3 d 陽性細胞數差異有統計學意義（P<0.05），建模后 7 d 時差異無統計學意義。見表 1。
圖2
各組大鼠 TUNEL 陽性細胞數/視野
2.6 免疫組織化學檢測炎癥細胞活化程度
Sham 組在建模后 1、3、7 d 陽性細胞數均很少，無明顯變化趨勢。FTY720 組和 TH-IVH 組在建模 1 d 后，血腫周圍區域發現少量陽性細胞聚集，建模 3 d 后兩組陽性細胞數量增加，建模 7 d 后兩組進一步增加，明顯高于 Sham 組（圖 3）。TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組比較， 1、3、7 d 陽性細胞數的差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
圖3
各組大鼠 IBA-1 陽性細胞數/視野
2.7 蛋白質印跡法
FTY720 組與 TH-IVH 組的 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達比值中，建模后 1、3 d 時差異均有統計學意義（1.40±0.15vs.0.31±0.08，1.13±0.17 vs. 0.22±0.02，P<0.05），7 d 時差異無統計學意義（0.17±0.06vs. 0.11±0.03，P=0.31）。FTY720 組與 TH-IVH 組建模后 1、3 d 時 Bcl-2/Bax表達比值差異均有統計學意義（1.16±0.11vs. 0.32±0.07，1.80±0.12vs. 0.73±0.05，P<0.05），7 d 時差異無統計學意義（0.49±0.04vs. 0.45±0.05，P=0.95）。見圖 4。
圖4
蛋白質印跡法檢測 TH-IVH 組與 FTY720 組中 LC3、Bcl-2、Bax的表達
a. LC3 的表達；b. Bcl-2、Bax 的表達
3 討論
FTY720 是從冬蟲夏草的培養液中提取后，經人工化學結構修飾合成的一種免疫抑制劑。在體內可被鞘氨醇激酶 2 磷酸化后與 S1PR 受體結合，發揮生物學作用。S1P 受體分為 S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5 共 5 個亞型，屬于 G 偶聯蛋白受體家族，在體內作為第二信使，其中腦組織中主要表達除 S1PR4 以外的 S1P 受體。FTY720 具有脂溶性，可以直接透過血腦屏障，作用于腦組織內的 S1P 受體，產生不同生物學效應[16-17]。
3.1 FTY720 在 TH-IVH 模型中發揮神經保護功能
在建模后，分別對 3 組大鼠進行了連續 7 d 體質量變化測量，結果發現 Sham 組建模后 1 d 體質量降低，之后體質量逐漸增高。FTY720 組體質量于建模 5 d 內呈持續下降趨勢，建模 5 d 后體質量停止下降，TH-IVH 組體質量持續迅速下降，兩組差異有統計學意義（P<0.05）。說明 FTY720 減緩了大鼠丘腦出血后體質量丟失程度。
神經功能評分方面，Sham 組在建模后各時間點的神經功能評分沒有表現出明顯差別。FTY720 組在各時間點的神經功能評分均明顯好于 TH-IVH 組，差異有統計學意義（P<0.05）。表明 FTY720 改善了丘腦出血大鼠的神經功能損傷程度，產生神經功能保護作用。
腦組織含水量的測定方面，Sham 組在建模后 1、3、7 d 時間點的腦組織含水量無明顯變化。FTY720 組與 TH-IVH 組在建模 1 d 后開始出現腦水腫，建模后 3 d 達到水腫高峰，建模 7 d 時水腫程度有所緩解，兩組相比，FTY720 組水腫程度相對較輕，差異有統計學意義（P<0.05）。提示 FTY720 減輕了丘腦出血大鼠腦組織水腫程度。
以上結果說明，FTY720 在發生丘腦出血的早期，可減輕大鼠體質量丟失、減輕腦水腫程度，改善惡化的神經功能，表現出神經保護作用，這與已有研究[14, 18]結果一致。
3.2 FTY720 減輕 TH-IVH 模型的炎性反應
通過免疫組織化學法熒光雙染，用 IBA-1 標記活化的小膠質細胞，Sham 組建模后針道周圍見少量陽性細胞；TH-IVH 組建模 1 d 后，可見血腫周圍出現少量陽性細胞，建模 3、7 d 后，陽性細胞大量聚集于血腫四周；FTY720 組建模 1 d 局部可見分散的陽性細胞，建模后 3、7 d 時，陽性細胞出現聚集，但數量明顯少于 TH-IVH 組，差異有統計學意義（P<0.05）。提示 FTY720 對小膠質細胞的活化有抑制作用，減少了血腫周圍的炎癥反應。早前的研究表明，FTY720 可以促進外周血液淋巴細胞歸巢，改善血管通透性，減少炎癥介質釋放進入腦組織內的數量，抑制腦組織內炎性細胞的聚集，減輕炎癥反應[13，19-20]。
3.3 FTY720 降低 TH-IVH 模型早期神經元變性與凋亡水平
Sham 組觀察到極個別的變性和凋亡的陽性神經元。在 TH-IVH 組中，變性神經元和凋亡神經元在建模后 1 d 達到高峰，建模后 3、7 d 逐漸減少，FTY720 顯著降低了 FTY720 組陽性細胞的數量，提示 FTY720 可以減少神經元細胞變性死亡數量，對丘腦出血后繼發性腦損傷有潛在改善能力。
為了進一步確定 FTY720 在腦出血中是否誘導神經元凋亡作用，后續篩查了凋亡指標Bcl-2、Bax。凋亡作為一種細胞程序性死亡的方式，分為外源性途徑和內源性途徑，Bcl-2與Bax在細胞凋亡的兩種途徑中，都發揮調控作用。一般認為，Bcl-2具有抑制凋亡作用，而Bax在促進凋亡發生的同時可以拮抗Bcl-2[21-22]。通常以Bcl-2/Bax表達比值來說明凋亡水平，比值升高，凋亡水平降低，比值降低，凋亡水平增加。結果發現，FTY720 組Bcl-2表達在建模后 1、3 d 明顯增加，FTY720 組與 TH-IVH 組Bcl-2/Bax表達比值在 1、3 d 差異有統計學意義，7 d 時差異無統計學意義。提示在建模后 3 d，FTY720 通過上調Bcl-2，提高Bcl-2/Bax比值抑制神經元凋亡水平。
TH-IVH 組與 Sham 組、FTY720 組與 TH-IVH 組建模后 7 d 的神經元變性水平和神經元凋亡數量的差異無統計學意義。既往的研究顯示，神經元凋亡一般在腦損傷后 24～72 h 達到高峰，72 h 后凋亡水平降低[23-24]。本研究中建模后 7 d 觀察到的變化趨勢與先前的研究一致。
3.4 FTY720 提高 TH-IVH 模型自噬水平
自噬是一種細胞自我代謝的現象，由 Ashford 等[25]在 1962 年首先于肝細胞中發現，是對細胞中衰老或錯位的細胞器和細胞質成分的降解與重復利用活動。真核細胞中自噬非常普遍，一方面其參與細胞的正常生命活動，是細胞對缺氧、饑餓、炎癥、損失等不良環境的防御機制；另一方面，自噬在多種疾病的病理生理過程中也扮演著不同角色。因此自噬在細胞生命周期具有兩面性[26]。
LC3 為檢測自噬水平的常規標志物，分為 LC3Ⅰ型和 LC3Ⅱ型。自噬發生時，由處于胞漿中的 LC3Ⅰ型轉化為 LC3Ⅱ型，結合在自噬體膜上啟動自噬發生。常用 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值作為監測自噬水平的指標，比值升高提示自噬水平增加。
為確定 FTY720 的神經保護作用是否涉及到自噬途徑，本研究檢測了 LC3 蛋白的表達。結果發現，FTY720 組與 TH-IVH 組在建模后 1、3 d 的 LC3Ⅱ型蛋白表達增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，差異有統計學意義（P<0.05）；7 d 時兩組 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值相仿，差異無統計學意義（P>0.05）。因此，可推測 FTY720 通過提高神經元自噬水平，達到神經保護作用。
自噬和凋亡的聯系十分緊密。細胞可以通過自噬來清除衰老細胞器和變性蛋白質，從而維持細胞內環境穩態，使細胞避免發生凋亡；當細胞內自噬水平增高，可促進細胞凋亡，進而加快細胞死亡；兩者關系錯綜復雜，有各自不同的信號通路，也有共同的信號途徑相互作用[27-28]。
本研究利用大鼠 TH-IVH 模型，驗證了 FTY720 具有神經保護作用，并從神經元凋亡和自噬水平的改變，推測其神經保護作用可能通過以下 2 個方面發揮：① 在丘腦出血早期，通過提高血腫周圍神經元自噬水平，降低神經元凋亡水平，減少了神經元死亡，從而發揮神經保護作用；② 在丘腦出血恢復期，通過免疫抑制作用，減少血腫周圍的炎性細胞聚集，減輕炎癥反應帶來的繼發性神經損傷。
本研究也存在一些不足。FTY720 有多種不同功能，在多種不同細胞中，具有細胞特異性。本實驗沒有單獨設立自噬抑制劑和自噬誘導劑的對照組，因此，只能從現有結果中單方面推測 FTY720 的神經保護機制與促進自噬、抑制凋亡和免疫抑制有關。然而，FTY720 是否同時通過其他通路和機制產生了神經保護作用，還不得而知，后期可進一步深入研究。
綜上所述，FTY720 能改善大鼠 TH-IVH 模型急性期的神經功能，減輕體質量丟失，減輕腦水腫，減輕炎癥反應，具有一定神經保護作用；FTY720 的神經保護作用機制可能與出血后早期促進神經元自噬水平提高，抑制神經元凋亡有關；另外，FTY720 具有免疫抑制作用，能減少血腫周圍的炎性細胞聚集，減輕炎癥反應帶來的繼發性神經損傷，可能是其神經保護作用的另一機制。
原發性腦出血占腦血管病總體發病的 20%～30%，急性期內的病死率為 30%～40%[1]。過去 10 年，全球因腦出血而入院治療的患者并未減少，其中約有 15% 為丘腦出血[2]。針對中等量丘腦出血破入腦室的患者，尚未能明確有效地改善預后的治療方法。到目前為止，因血腫對丘腦造成結構上的破壞損傷，這類原發性損傷無論通過手術治療還是內科治療都無法修復。因此，對腦出血導致的各種繼發性損傷的機制和干預的探究已經成為目前的研究熱點。
芬戈莫德（FTY720）是近年來合成出的一種新型免疫抑制劑，其在體內具有雙向免疫調節作用，在體內抑制免疫反應的同時，不產生機體對病毒免疫應答和免疫記憶的干擾[3-6]。FTY720 目前已被美國食品藥品監督管理局批準成為治療復發性多發性硬化的口服藥物[7]。近年來關于 FTY720 的研究越來越多，除本身強大的免疫抑制作用外，FTY720 還被發現其通過對腫瘤細胞的凋亡、壞死、自噬的調控發揮抗腫瘤作用[8-10]。目前只有極少量文獻報道 FTY720 在腦出血中可發揮一定的神經保護作用，其機制尚不明確[11-14]。本研究將基于丘腦-腦室出血（thalamic-ventricle hemorrhage，TH-IVH）動物模型構建基礎上，探討 FTY720 對大鼠 TH-IVH 后繼發性神經損傷中的保護作用。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 實驗動物
清潔級成年雄性 Sprague Dawley 大鼠 60 只，鼠齡 5～6 個月，體質量 400～500 g，由成都達碩實驗動物公司提供。
1.1.2 飼養條件
四川大學華西醫院神經外科研究室動物房內分籠喂養。動物房恒溫：20～24℃；濕度環境：45%～55%；光照：12 h 明暗晝夜交替；自由進食及飲水。每只大鼠至少在動物房飼養 1 周后進行實驗，實驗大鼠術前 6 h 禁食、禁飲。
1.2 研究方法
1.2.1 實驗動物分組
將實驗動物隨機分為 3 組，即假手術組（Sham 組）、TH-IVH 組和干預組（FTY720 組），每組 6 只大鼠。TH-IVH 組和 FTY720 組所有大鼠均建立 TH-IVH 模型，注入自體血 60 μL。FTY720 組大鼠在建模后的 0～7 d 均采用 FTY720（25 mg/支，凍干粉，美國 Sigma 公司）進行干預，腹腔注射量為 1 mg/kg，1 次/d。
1.2.2 大鼠 TH-IVH 模型建立
① 消毒相關手術器械及立體定向儀；實驗人員佩戴口罩、洗手、帶無菌手套；嚴格按照無菌要求，恒溫載物臺保持動物體溫在（37.0±0.5）℃。② 大鼠術前 6 h 禁食、禁水，過電子天平稱重后，記錄體質量，采用 10% 水合氯醛，按 3.5 mL/kg 行腹腔注射麻醉，麻醉生效為觸須反射及角膜反射消失，額頂部備皮。③ 將麻醉成功的大鼠，取俯臥位，將其門齒及雙側外耳道固定于腦立體定向儀上，保持前后囟門位于同一水平高度，左右對稱。備皮處消毒，沿矢狀線切開頭皮約 1 cm，鈍性分離肌肉及骨膜，暴露前囟及冠狀縫。④ 用動物顱骨鉆在距中線向右旁開 3 mm，前囟向后 3.6 mm 處鉆孔，孔徑 1 mm。⑤ 使用動脈穿刺針取足量自體股動脈血，并固定于微量注射器固定桿上。調整立體定向儀將針頭對準顱骨鉆孔位置。垂直緩慢進針，進針深度為皮質下 7.0 mm。⑥ 將自體動脈血通過旋轉推進器勻速緩慢注入右側丘腦區域，注射速度：10 μL/min。先以 10 μL/min 的速度通過微泵注入 10 μL，等待 10 min 后，以相同速度注入剩余自體全血量 50 μL，定位點：前囟后 3.5 mm，右側中線旁開 3.0 mm，深度 7.0 mm。留針 15 min 后緩慢退針，醫用骨蠟封閉骨孔，消毒縫合各個切口，置于 37℃溫箱內保溫復蘇。⑦ 在 Sham 組中，只進針，不采血，不注血，針頭留置相同時間。
1.3 觀察指標
觀察時間點選取建模后 1、3、7 d，主要觀察指標為各組神經功能評分、連續體質量變化、腦組織含水量測定、免疫組織化學法測量炎癥細胞活化程度、免疫熒光法測定神經元變性及凋亡水平、蛋白質印跡法測量蛋白表達水平。
1.3.1 體質量變化測量
大鼠建模后分別連續測量體質量，采用百分比法觀察建模后實驗動物模型的體質量變化。繪制體質量變化曲線。選取各組建模后 1、3、7 d 時間點的體質量變化作比較。體質量變化計算公式：體質量變化（%）=（觀察時間點體質量–初始體質量）/初始體質量×100%。
1.3.2 神經功能檢測評分
采用大鼠改良 Voetsch 評分量表[15]。建模后的大鼠連續測量神經功能評分，評估各組大鼠建模后的神經功能損傷變化。選取各組建模后 1、3、7 d 時間點的分值作比較。
1.3.3 腦組織含水量的測定
采用干濕重差值測定大鼠建模后 1、3、7 d 建模側丘腦的腦組織含水量，比較各組大鼠腦組織水腫程度。腦組織含水量計算公式：含水量（%）=（濕重–干重）/濕重×100%。
1.3.4 免疫熒光法測定神經元變性
采用免疫熒光探針（Fluoro-Jade C，FJC）觀察測定各組模型神經元變性情況。FJC 陽性細胞為綠色熒光顯示，提示變性神經元。
1.3.5 細胞凋亡檢測
凋亡神經元中雙鏈 DNA 損傷斷裂，采用 TUNEL 法可以原位標記出這些斷裂的 DNA，借助熒光素從而能夠評估細胞凋亡水平。凋亡神經元細胞核顯示為綠色熒光，呈綠色點狀。有核細胞的細胞核通過 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染，其細胞核呈藍色點狀。
1.3.6 免疫組織化學檢測炎癥細胞活化程度
腦出血等病理條件下，腦組織中處于靜息狀態下的小膠質細胞可迅速活化、增殖。其在清除來自損傷部位的死亡細胞的同時，參與形成繼發性腦損傷，通過小膠質細胞標志物 IBA-1 檢測其活化程度，采用 IBA-1 抗體標示出模型鼠腦組織中的活化小膠質細胞。IBA-1 陽性提示小膠質細胞活化。陽性細胞呈現為綠色熒光，有核細胞的細胞核通過 DAPI 復染，其細胞核呈藍色點狀。
1.3.7 蛋白質印跡法
采用蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達水平。檢測自噬體標記蛋白（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）的表達。采用 LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ比值作為神經元自噬水平高低的反應。檢測Bcl-2與Bax兩種基因表達。采用Bcl-2/Bax比值作為神經元凋亡水平的反應。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示。組間比較采用重復測量資料的方差分析，并采用 Multivariate 過程實現 TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組之間比較。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 體質量變化測量
連續檢測各組大鼠建模后的體質量變化。Sham 組建模后 1 d 體質量下降，此后連續回升，7 d 后超過建模前；FTY720 組與 TH-IVH 組體質量總體呈連續下降趨勢，7 d 時體質量下降趨于穩定。在建模后 1、3、7 d，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組體質量變化差異有統計學意義（P<0.01）。見表 1。
表1
建模后各組相關指標比較（n=6，
）
2.2 神經功能檢測評分
Sham 組建模后 1 d 神經功能評分下降，此后逐漸緩慢回升；FTY720 組與 TH-IVH 組均出現明顯神經功能障礙，評分明顯大幅下降，此后逐步回升。在建模后 1、3、7 d，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組的神經功能評分差異有統計學意義（P<0.01）。見表 1。
2.3 腦組織含水量的測定
Sham 組的腦組織含水量在建模后 1、3、7 d 無明顯變化趨勢；FTY720 組與 TH-IVH 組從建模后 1 d 開始腦組織水腫程度增加，3 d 左右達到水腫高峰，7 d 水腫程度有所回落，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組腦組織含水量差異有統計學意義（P<0.01）。見表 1。
2.4 免疫熒光法測定神經元變性
Sham 組于建模后 1、3、7 d，陽性細胞數均極少，無明顯變化趨勢；FTY720 組與 TH-IVH 組建模 1 d 后，陽性細胞數明顯升高，3 d 后陽性細胞數減少，7 d 后陽性細胞進一步減少但兩組數量仍明顯多于 Sham 組（圖 1）。建模后 1、3 d，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組比較，FJC 陽性細胞數的差異均有統計學意義（P<0.05）；7 d 時，TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組差異均無統計學意義。見表 1。
圖1
各組大鼠 FJC 陽性細胞數/視野
2.5 神經元細胞凋亡檢測
建模后 1 d，TH-IVH 組與 FTY720 組血腫周圍 TUNEL 陽性細胞明顯增加，Sham 組數量稀少；建模 3、7 d 后，Sham 組數量緩慢減少，TH-IVH 組與 FTY720 組血腫周圍陽性細胞持續減少（圖 2）。TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組比較，建模后 1、3 d 陽性細胞數差異有統計學意義（P<0.05），建模后 7 d 時差異無統計學意義。見表 1。
圖2
各組大鼠 TUNEL 陽性細胞數/視野
2.6 免疫組織化學檢測炎癥細胞活化程度
Sham 組在建模后 1、3、7 d 陽性細胞數均很少，無明顯變化趨勢。FTY720 組和 TH-IVH 組在建模 1 d 后，血腫周圍區域發現少量陽性細胞聚集，建模 3 d 后兩組陽性細胞數量增加，建模 7 d 后兩組進一步增加，明顯高于 Sham 組（圖 3）。TH-IVH 組與 Sham 組、TH-IVH 組與 FTY720 組比較， 1、3、7 d 陽性細胞數的差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
圖3
各組大鼠 IBA-1 陽性細胞數/視野
2.7 蛋白質印跡法
FTY720 組與 TH-IVH 組的 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達比值中，建模后 1、3 d 時差異均有統計學意義（1.40±0.15vs.0.31±0.08，1.13±0.17 vs. 0.22±0.02，P<0.05），7 d 時差異無統計學意義（0.17±0.06vs. 0.11±0.03，P=0.31）。FTY720 組與 TH-IVH 組建模后 1、3 d 時 Bcl-2/Bax表達比值差異均有統計學意義（1.16±0.11vs. 0.32±0.07，1.80±0.12vs. 0.73±0.05，P<0.05），7 d 時差異無統計學意義（0.49±0.04vs. 0.45±0.05，P=0.95）。見圖 4。
圖4
蛋白質印跡法檢測 TH-IVH 組與 FTY720 組中 LC3、Bcl-2、Bax的表達
a. LC3 的表達；b. Bcl-2、Bax 的表達
3 討論
FTY720 是從冬蟲夏草的培養液中提取后，經人工化學結構修飾合成的一種免疫抑制劑。在體內可被鞘氨醇激酶 2 磷酸化后與 S1PR 受體結合，發揮生物學作用。S1P 受體分為 S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5 共 5 個亞型，屬于 G 偶聯蛋白受體家族，在體內作為第二信使，其中腦組織中主要表達除 S1PR4 以外的 S1P 受體。FTY720 具有脂溶性，可以直接透過血腦屏障，作用于腦組織內的 S1P 受體，產生不同生物學效應[16-17]。
3.1 FTY720 在 TH-IVH 模型中發揮神經保護功能
在建模后，分別對 3 組大鼠進行了連續 7 d 體質量變化測量，結果發現 Sham 組建模后 1 d 體質量降低，之后體質量逐漸增高。FTY720 組體質量于建模 5 d 內呈持續下降趨勢，建模 5 d 后體質量停止下降，TH-IVH 組體質量持續迅速下降，兩組差異有統計學意義（P<0.05）。說明 FTY720 減緩了大鼠丘腦出血后體質量丟失程度。
神經功能評分方面，Sham 組在建模后各時間點的神經功能評分沒有表現出明顯差別。FTY720 組在各時間點的神經功能評分均明顯好于 TH-IVH 組，差異有統計學意義（P<0.05）。表明 FTY720 改善了丘腦出血大鼠的神經功能損傷程度，產生神經功能保護作用。
腦組織含水量的測定方面，Sham 組在建模后 1、3、7 d 時間點的腦組織含水量無明顯變化。FTY720 組與 TH-IVH 組在建模 1 d 后開始出現腦水腫，建模后 3 d 達到水腫高峰，建模 7 d 時水腫程度有所緩解，兩組相比，FTY720 組水腫程度相對較輕，差異有統計學意義（P<0.05）。提示 FTY720 減輕了丘腦出血大鼠腦組織水腫程度。
以上結果說明，FTY720 在發生丘腦出血的早期，可減輕大鼠體質量丟失、減輕腦水腫程度，改善惡化的神經功能，表現出神經保護作用，這與已有研究[14, 18]結果一致。
3.2 FTY720 減輕 TH-IVH 模型的炎性反應
通過免疫組織化學法熒光雙染，用 IBA-1 標記活化的小膠質細胞，Sham 組建模后針道周圍見少量陽性細胞；TH-IVH 組建模 1 d 后，可見血腫周圍出現少量陽性細胞，建模 3、7 d 后，陽性細胞大量聚集于血腫四周；FTY720 組建模 1 d 局部可見分散的陽性細胞，建模后 3、7 d 時，陽性細胞出現聚集，但數量明顯少于 TH-IVH 組，差異有統計學意義（P<0.05）。提示 FTY720 對小膠質細胞的活化有抑制作用，減少了血腫周圍的炎癥反應。早前的研究表明，FTY720 可以促進外周血液淋巴細胞歸巢，改善血管通透性，減少炎癥介質釋放進入腦組織內的數量，抑制腦組織內炎性細胞的聚集，減輕炎癥反應[13，19-20]。
3.3 FTY720 降低 TH-IVH 模型早期神經元變性與凋亡水平
Sham 組觀察到極個別的變性和凋亡的陽性神經元。在 TH-IVH 組中，變性神經元和凋亡神經元在建模后 1 d 達到高峰，建模后 3、7 d 逐漸減少，FTY720 顯著降低了 FTY720 組陽性細胞的數量，提示 FTY720 可以減少神經元細胞變性死亡數量，對丘腦出血后繼發性腦損傷有潛在改善能力。
為了進一步確定 FTY720 在腦出血中是否誘導神經元凋亡作用，后續篩查了凋亡指標Bcl-2、Bax。凋亡作為一種細胞程序性死亡的方式，分為外源性途徑和內源性途徑，Bcl-2與Bax在細胞凋亡的兩種途徑中，都發揮調控作用。一般認為，Bcl-2具有抑制凋亡作用，而Bax在促進凋亡發生的同時可以拮抗Bcl-2[21-22]。通常以Bcl-2/Bax表達比值來說明凋亡水平，比值升高，凋亡水平降低，比值降低，凋亡水平增加。結果發現，FTY720 組Bcl-2表達在建模后 1、3 d 明顯增加，FTY720 組與 TH-IVH 組Bcl-2/Bax表達比值在 1、3 d 差異有統計學意義，7 d 時差異無統計學意義。提示在建模后 3 d，FTY720 通過上調Bcl-2，提高Bcl-2/Bax比值抑制神經元凋亡水平。
TH-IVH 組與 Sham 組、FTY720 組與 TH-IVH 組建模后 7 d 的神經元變性水平和神經元凋亡數量的差異無統計學意義。既往的研究顯示，神經元凋亡一般在腦損傷后 24～72 h 達到高峰，72 h 后凋亡水平降低[23-24]。本研究中建模后 7 d 觀察到的變化趨勢與先前的研究一致。
3.4 FTY720 提高 TH-IVH 模型自噬水平
自噬是一種細胞自我代謝的現象，由 Ashford 等[25]在 1962 年首先于肝細胞中發現，是對細胞中衰老或錯位的細胞器和細胞質成分的降解與重復利用活動。真核細胞中自噬非常普遍，一方面其參與細胞的正常生命活動，是細胞對缺氧、饑餓、炎癥、損失等不良環境的防御機制；另一方面，自噬在多種疾病的病理生理過程中也扮演著不同角色。因此自噬在細胞生命周期具有兩面性[26]。
LC3 為檢測自噬水平的常規標志物，分為 LC3Ⅰ型和 LC3Ⅱ型。自噬發生時，由處于胞漿中的 LC3Ⅰ型轉化為 LC3Ⅱ型，結合在自噬體膜上啟動自噬發生。常用 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值作為監測自噬水平的指標，比值升高提示自噬水平增加。
為確定 FTY720 的神經保護作用是否涉及到自噬途徑，本研究檢測了 LC3 蛋白的表達。結果發現，FTY720 組與 TH-IVH 組在建模后 1、3 d 的 LC3Ⅱ型蛋白表達增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，差異有統計學意義（P<0.05）；7 d 時兩組 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值相仿，差異無統計學意義（P>0.05）。因此，可推測 FTY720 通過提高神經元自噬水平，達到神經保護作用。
自噬和凋亡的聯系十分緊密。細胞可以通過自噬來清除衰老細胞器和變性蛋白質，從而維持細胞內環境穩態，使細胞避免發生凋亡；當細胞內自噬水平增高，可促進細胞凋亡，進而加快細胞死亡；兩者關系錯綜復雜，有各自不同的信號通路，也有共同的信號途徑相互作用[27-28]。
本研究利用大鼠 TH-IVH 模型，驗證了 FTY720 具有神經保護作用，并從神經元凋亡和自噬水平的改變，推測其神經保護作用可能通過以下 2 個方面發揮：① 在丘腦出血早期，通過提高血腫周圍神經元自噬水平，降低神經元凋亡水平，減少了神經元死亡，從而發揮神經保護作用；② 在丘腦出血恢復期，通過免疫抑制作用，減少血腫周圍的炎性細胞聚集，減輕炎癥反應帶來的繼發性神經損傷。
本研究也存在一些不足。FTY720 有多種不同功能，在多種不同細胞中，具有細胞特異性。本實驗沒有單獨設立自噬抑制劑和自噬誘導劑的對照組，因此，只能從現有結果中單方面推測 FTY720 的神經保護機制與促進自噬、抑制凋亡和免疫抑制有關。然而，FTY720 是否同時通過其他通路和機制產生了神經保護作用，還不得而知，后期可進一步深入研究。
綜上所述，FTY720 能改善大鼠 TH-IVH 模型急性期的神經功能，減輕體質量丟失，減輕腦水腫，減輕炎癥反應，具有一定神經保護作用；FTY720 的神經保護作用機制可能與出血后早期促進神經元自噬水平提高，抑制神經元凋亡有關；另外，FTY720 具有免疫抑制作用，能減少血腫周圍的炎性細胞聚集，減輕炎癥反應帶來的繼發性神經損傷，可能是其神經保護作用的另一機制。
