引用本文： 劉健剛, 汪求精, 劉明剛, 宋昭, 陳乾. 酶切法去除熒光定量聚合酶鏈反應體系中內源性核酸污染. 華西醫學, 2018, 33(6): 744-747. doi: 10.7507/1002-0179.201803109 復制
顱內感染是神經外科開顱手術后常見的嚴重并發癥之一，可引起神經系統功能的損害，其發生率為 2.6%～30.0%[1-3]。顱內感染一旦發生不僅嚴重影響患者的預后，而且癥狀不易控制，常常危及生命[4-5]。顱內感染常見革蘭陽性（G+）菌如金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌，革蘭陰性（G–）菌如大腸埃希菌、綠膿假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌等[6-7]。本研究使用通用引物和探針檢測顱內感染源，為了更加精準地檢測腦脊液中的細菌，必須盡可能有效地提取細菌 DNA，而熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑中也不能存在內源性核酸污染。DNA 提取效率低可能會限制檢測的靈敏度，而熒光定量 PCR 試劑中的核酸污染可以作為反應體系中的模板，產生假陽性結果，從而直接影響檢測的準確性。
PCR 反應體系的核酸污染主要來源于 2 個方面：環境中的污染和 Taq DNA 聚合酶自身攜帶的污染[8-9]。如果環境本身存在細菌污染，在配制或分裝熒光定量 PCR 試劑的過程中也就存在污染的可能性；Taq DNA 聚合酶是一種從嗜熱真細菌中提取分離出的天然酶或者是從大腸桿菌中合成的基因工程酶，在酶的提取分離及純化過程中也存在細菌 DNA 污染的可能性。因此本研究建立一種快速、靈敏的基于熒光探針（TaqMan） PCR 檢測的去除內源性污染的方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 材料
供試菌株，金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌均由上海市疾病預防控制中心惠贈。所有菌株均接種于牛肉膏蛋白胨培養基，37℃ 培養 18 h，轉接 3 次后備用。
1.1.2 試劑與儀器
Taq DNA 聚合酶、10×PCR 緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、氯化鎂購自上海兆維科技發展有限公司；EcoRⅠ、DNaseⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR 引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成；聚苯乙烯二乙烯螯合樹脂（Chelex-100）購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；裂解液（NP-40）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、溶菌酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）購自國藥集團化學試劑有限公司，為分析純。ABI 7500 Real-Time PCR System 為美國 Thermo Fisher 公司產品。
1.2 實驗方法
1.2.1 菌株 DNA 的提取
① 取 1 mL 菌液于 1.5 mL 離心管中，室溫下以 12 000 r/min 轉速離心 2 min，棄上清液。向離心管中加入 100 μL 核酸提取液（5% Chelex-100，0.5% NP-40，0.5% Triton X-100，1 mmol/L EDTA），重懸菌體。② 加入 50 mg/mL 溶菌酶 6 μL，37℃ 水浴 30 min 后，85℃ 水浴 10 min。③ 以 12 000 r/min 轉速離心 2 min，上清液用于 PCR 檢測。按照上述步驟提取所有菌株 DNA，并將提取 DNA 進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳。
1.2.2 熒光定量 PCR 引物和探針
G+ 菌和 G– 菌通用引物和探針序列見表 1，目的片段長度為 69 bp。
表1
第 1 組反應液中引物和探針序列
1.2.3 去除反應體系中內源性核酸污染
配制熒光定量 PCR 反應體系：鎂離子（Mg2+）4 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L、10×PCR 緩沖液、上下游引物各 200 nmol/L、探針 100 nmol/L、Taq DNA 聚合酶 3.5 U。分別以綠膿假單胞菌 DNA 和無菌水為模板，進行熒光定量 PCR 擴增，檢測各組閾值循環數（cycle threshold，Ct ）和熒光強度 ΔRn。
用限制性內切酶（EcoRⅠ）和核酸內切酶（DNaseⅠ）酶切處理熒光定量 PCR 反應液，分 2 個部分，反應液 A：Mg2+ 4 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L、10×Hot Start PCR 緩沖液、DNaseⅠ 1.5 U；反應液 B：上下游引物各 200 nmol/L、探針 100 nmol/L、Hot Start Taq DNA 聚合酶 3.5 U、EcoRⅠ 2 U。A 反應液 37℃ 水浴 60 min 后，75℃ 水浴 15 min；同時，B 反應液 37℃ 水浴 60 min，80℃ 水浴 5 min。按上述步驟去除反應體系中內源性核酸污染后，30 μL 反應液 A 和 15 μL 反應液 B 混勻，分別以綠膿假單胞菌 DNA 和無菌水為模板，進行熒光定量 PCR 擴增。
用 0.22 μm 濾膜過濾熒光定量 PCR 反應液：Mg2+ 4 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L、10×Hot Start PCR 緩沖液、上下游引物各 200 nmol/L、探針 100 nmol/L、HotStart Taq DNA 聚合酶 3.5 U。取過濾后反應液，分別以綠膿假單胞菌 DNA 和無菌水為模板，進行熒光定量 PCR 擴增。對比未去除內源性核酸污染組和兩種去除內源性核酸污染組間熒光定量 PCR 結果。
1.2.4 熒光定量 PCR 反應
取 45 μL 反應液，加入 5 μL 模板。擴增程序為：95℃ 預變性 5 min 后進行 45 個循環，每個循環包括 95℃ 變性 5 s，60℃ 退火延伸 90 s。
1.2.5 多重 PCR 特異性驗證
分別用酶切法和過濾法處理含 G+ 菌和 G– 菌引物探針的熒光定量 PCR 反應液，分別檢測金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌混合 DNA。
1.2.6 去除核酸污染方法靈敏度檢測
用無菌生理鹽水調整金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌液的濃度為 104、103、102、101 CFU/mL，各取 200 μL 菌液分別加入等體積經驗證無菌的腦脊液，即為腦脊液模擬樣本。按國標法對所有濃度腦脊液模擬樣本進行培養檢測。金黃色葡萄球菌的檢測方法參照文獻[10]，綠膿假單胞菌的檢測方法參照相關國家標準[11]。同時，按 1.2.1 對所有濃度的模擬腦脊液樣本進行核酸提取，熒光定量多重 PCR 檢測。對比熒光定量 PCR 檢測結果與培養法檢測結果，驗證多重 PCR 技術檢測顱內術后易感染細菌的靈敏度和特異度。用酶切法處理 PCR 反應液，將上述模板金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌 DNA 進行檢測。
2 結果
2.1 菌株 DNA 的提取結果
按照 1.2.1 步驟提取細菌 DNA 后，DNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖 1，所有泳道條帶均較亮且清晰，用核酸提取液（5% Chelex-100，0.5% NP-40，0.5% Triton X-100，1 mmol/L EDTA）熱裂解法提取的細菌 DNA 純度高，符合熒光定量 PCR 要求。
圖1
細菌 DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖
M：Marker；1：金黃色葡萄球菌；2：綠膿假單胞菌
2.2 去除反應體系中內源性核酸污染
未去除內源性核酸污染組擴增無菌水的結果為陽性（Ct=30，ΔRn=150）；去除內源性核酸污染組擴增無菌水的結果為陰性，無熒光信號（ΔRn=0）。可見反應體系若不去除內源性核酸污染，會導致假陽性結果產生。酶切法對 PCR 體系中酶的活性及擴增效率均無明顯影響（Ct=32，ΔRn=200），而過濾法使 PCR 擴增效率顯著下降（Ct=32，ΔRn=150），故酶切法更適用于去除內源性核酸污染。見圖 2。
圖2
反應體系中內源性核酸污染去除前后擴增綠膿假單胞菌 DNA 和無菌水的擴增結果圖
a. 未去除內源性核酸污染組；b. 酶切法去除內源性核酸污染組；c. 過濾法去除內源性核酸污染組
2.3 多重 PCR 特異性驗證結果
FAM 通道有擴增曲線且 Ct<40 表明為 G+ 菌陽性，VIC 通道有擴增曲線且 Ct<40 表明為 G– 菌陽性。未去除內源性核酸污染組擴增無菌水的結果為陽性，而去除內源性核酸污染組擴增無菌水的結果為陰性。酶切法對 PCR 反應體系及引物特異性無影響。見圖 3。
圖3
G+ 菌引物探針特異性驗證結果圖
a. 酶切法去除內源性核酸污染組擴增金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌混合 DNA 和無菌水的擴增結果；b. 未去除內源性核酸污染組擴增金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌混合 DNA 和無菌水的擴增結果
2.4 去除核酸污染方法檢測限和靈敏度檢測
對比培養法和酶切法去除內源性核酸污染的熒光定量多重 PCR 檢測結果，見圖 4、表 2。FAM 通道有擴增曲線且 Ct<40 表明為 G+ 菌陽性，VIC 通道有擴增曲線且 Ct<40 表明為 G– 菌陽性。酶切法去除內源性核酸污染對熒光定量 PCR 檢測限及靈敏度均無影響。
表2
培養法和熒光定量多重 PCR 檢測限測試結果
圖4
酶切法去除內源核酸污染后混合 DNA 的擴增結果圖
3 討論
顱內感染是一種神經外科手術中較為常見但嚴重的并發癥，顱內術后常見的感染細菌包含多種 G+ 菌和 G– 菌，而熒光定量 PCR 反應體系的內源性核酸污染容易導致假陽性的出現，從而產生誤診，因此 PCR 體系內源核酸污染的去除就十分必要[12]。
目前文獻報道的去除熒光定量 PCR 反應體系內源核酸污染的最有效方法是過濾法和核酸內切酶消化法[13]。本研究用于去除 PCR 反應體系內源核酸污染的方法為 EcoRⅠ和 DNase Ⅰ酶切法，以及過濾法。EcoRⅠ和 DNase Ⅰ酶切法僅需前處理 75 min，就可去除 PCR 反應體系中的內源性核酸污染。該法對 Taq DNA 聚合酶活性及擴增效率均無明顯影響，對 PCR 體系檢測的靈敏度 Ct 值也無明顯影響。而過濾法雖操作簡單，但對 DNA 酶活性以及擴增效率有明顯的抑制作用，Ct 值重復性差，熒光信號明顯降低。因此本研究選用 EcoRⅠ和 DNase Ⅰ酶切法去除 PCR 體系內源核酸污染。
近年來，熒光定量 PCR 技術常用于檢測顱內術后 G– 菌和 G+ 菌的感染，如大腸桿菌等[14]。本研究中首先去除 PCR 反應體系內的核酸污染，再采用 G– 菌和 G+ 菌通用引物探針進行 PCR 擴增，從而區分種屬。本研究中使用的探針引物特異性好，只針對相應的 G– 菌和 G+ 菌有擴增。
顱內感染是目前長期困擾神經外科醫生的重要并發癥。本研究建立的細菌熒光定量 PCR 體系內源性核酸污染去除方法可為降低或排除顱內感染細菌假陽性結果提供快速、可靠的實驗依據，為臨床診斷提供可靠的保障。
顱內感染是神經外科開顱手術后常見的嚴重并發癥之一，可引起神經系統功能的損害，其發生率為 2.6%～30.0%[1-3]。顱內感染一旦發生不僅嚴重影響患者的預后，而且癥狀不易控制，常常危及生命[4-5]。顱內感染常見革蘭陽性（G+）菌如金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌，革蘭陰性（G–）菌如大腸埃希菌、綠膿假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌等[6-7]。本研究使用通用引物和探針檢測顱內感染源，為了更加精準地檢測腦脊液中的細菌，必須盡可能有效地提取細菌 DNA，而熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑中也不能存在內源性核酸污染。DNA 提取效率低可能會限制檢測的靈敏度，而熒光定量 PCR 試劑中的核酸污染可以作為反應體系中的模板，產生假陽性結果，從而直接影響檢測的準確性。
PCR 反應體系的核酸污染主要來源于 2 個方面：環境中的污染和 Taq DNA 聚合酶自身攜帶的污染[8-9]。如果環境本身存在細菌污染，在配制或分裝熒光定量 PCR 試劑的過程中也就存在污染的可能性；Taq DNA 聚合酶是一種從嗜熱真細菌中提取分離出的天然酶或者是從大腸桿菌中合成的基因工程酶，在酶的提取分離及純化過程中也存在細菌 DNA 污染的可能性。因此本研究建立一種快速、靈敏的基于熒光探針（TaqMan） PCR 檢測的去除內源性污染的方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 材料
供試菌株，金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌均由上海市疾病預防控制中心惠贈。所有菌株均接種于牛肉膏蛋白胨培養基，37℃ 培養 18 h，轉接 3 次后備用。
1.1.2 試劑與儀器
Taq DNA 聚合酶、10×PCR 緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、氯化鎂購自上海兆維科技發展有限公司；EcoRⅠ、DNaseⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR 引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成；聚苯乙烯二乙烯螯合樹脂（Chelex-100）購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；裂解液（NP-40）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、溶菌酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）購自國藥集團化學試劑有限公司，為分析純。ABI 7500 Real-Time PCR System 為美國 Thermo Fisher 公司產品。
1.2 實驗方法
1.2.1 菌株 DNA 的提取
① 取 1 mL 菌液于 1.5 mL 離心管中，室溫下以 12 000 r/min 轉速離心 2 min，棄上清液。向離心管中加入 100 μL 核酸提取液（5% Chelex-100，0.5% NP-40，0.5% Triton X-100，1 mmol/L EDTA），重懸菌體。② 加入 50 mg/mL 溶菌酶 6 μL，37℃ 水浴 30 min 后，85℃ 水浴 10 min。③ 以 12 000 r/min 轉速離心 2 min，上清液用于 PCR 檢測。按照上述步驟提取所有菌株 DNA，并將提取 DNA 進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳。
1.2.2 熒光定量 PCR 引物和探針
G+ 菌和 G– 菌通用引物和探針序列見表 1，目的片段長度為 69 bp。
表1
第 1 組反應液中引物和探針序列
1.2.3 去除反應體系中內源性核酸污染
配制熒光定量 PCR 反應體系：鎂離子（Mg2+）4 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L、10×PCR 緩沖液、上下游引物各 200 nmol/L、探針 100 nmol/L、Taq DNA 聚合酶 3.5 U。分別以綠膿假單胞菌 DNA 和無菌水為模板，進行熒光定量 PCR 擴增，檢測各組閾值循環數（cycle threshold，Ct ）和熒光強度 ΔRn。
用限制性內切酶（EcoRⅠ）和核酸內切酶（DNaseⅠ）酶切處理熒光定量 PCR 反應液，分 2 個部分，反應液 A：Mg2+ 4 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L、10×Hot Start PCR 緩沖液、DNaseⅠ 1.5 U；反應液 B：上下游引物各 200 nmol/L、探針 100 nmol/L、Hot Start Taq DNA 聚合酶 3.5 U、EcoRⅠ 2 U。A 反應液 37℃ 水浴 60 min 后，75℃ 水浴 15 min；同時，B 反應液 37℃ 水浴 60 min，80℃ 水浴 5 min。按上述步驟去除反應體系中內源性核酸污染后，30 μL 反應液 A 和 15 μL 反應液 B 混勻，分別以綠膿假單胞菌 DNA 和無菌水為模板，進行熒光定量 PCR 擴增。
用 0.22 μm 濾膜過濾熒光定量 PCR 反應液：Mg2+ 4 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L、10×Hot Start PCR 緩沖液、上下游引物各 200 nmol/L、探針 100 nmol/L、HotStart Taq DNA 聚合酶 3.5 U。取過濾后反應液，分別以綠膿假單胞菌 DNA 和無菌水為模板，進行熒光定量 PCR 擴增。對比未去除內源性核酸污染組和兩種去除內源性核酸污染組間熒光定量 PCR 結果。
1.2.4 熒光定量 PCR 反應
取 45 μL 反應液，加入 5 μL 模板。擴增程序為：95℃ 預變性 5 min 后進行 45 個循環，每個循環包括 95℃ 變性 5 s，60℃ 退火延伸 90 s。
1.2.5 多重 PCR 特異性驗證
分別用酶切法和過濾法處理含 G+ 菌和 G– 菌引物探針的熒光定量 PCR 反應液，分別檢測金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌混合 DNA。
1.2.6 去除核酸污染方法靈敏度檢測
用無菌生理鹽水調整金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌液的濃度為 104、103、102、101 CFU/mL，各取 200 μL 菌液分別加入等體積經驗證無菌的腦脊液，即為腦脊液模擬樣本。按國標法對所有濃度腦脊液模擬樣本進行培養檢測。金黃色葡萄球菌的檢測方法參照文獻[10]，綠膿假單胞菌的檢測方法參照相關國家標準[11]。同時，按 1.2.1 對所有濃度的模擬腦脊液樣本進行核酸提取，熒光定量多重 PCR 檢測。對比熒光定量 PCR 檢測結果與培養法檢測結果，驗證多重 PCR 技術檢測顱內術后易感染細菌的靈敏度和特異度。用酶切法處理 PCR 反應液，將上述模板金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌 DNA 進行檢測。
2 結果
2.1 菌株 DNA 的提取結果
按照 1.2.1 步驟提取細菌 DNA 后，DNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖 1，所有泳道條帶均較亮且清晰，用核酸提取液（5% Chelex-100，0.5% NP-40，0.5% Triton X-100，1 mmol/L EDTA）熱裂解法提取的細菌 DNA 純度高，符合熒光定量 PCR 要求。
圖1
細菌 DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖
M：Marker；1：金黃色葡萄球菌；2：綠膿假單胞菌
2.2 去除反應體系中內源性核酸污染
未去除內源性核酸污染組擴增無菌水的結果為陽性（Ct=30，ΔRn=150）；去除內源性核酸污染組擴增無菌水的結果為陰性，無熒光信號（ΔRn=0）。可見反應體系若不去除內源性核酸污染，會導致假陽性結果產生。酶切法對 PCR 體系中酶的活性及擴增效率均無明顯影響（Ct=32，ΔRn=200），而過濾法使 PCR 擴增效率顯著下降（Ct=32，ΔRn=150），故酶切法更適用于去除內源性核酸污染。見圖 2。
圖2
反應體系中內源性核酸污染去除前后擴增綠膿假單胞菌 DNA 和無菌水的擴增結果圖
a. 未去除內源性核酸污染組；b. 酶切法去除內源性核酸污染組；c. 過濾法去除內源性核酸污染組
2.3 多重 PCR 特異性驗證結果
FAM 通道有擴增曲線且 Ct<40 表明為 G+ 菌陽性，VIC 通道有擴增曲線且 Ct<40 表明為 G– 菌陽性。未去除內源性核酸污染組擴增無菌水的結果為陽性，而去除內源性核酸污染組擴增無菌水的結果為陰性。酶切法對 PCR 反應體系及引物特異性無影響。見圖 3。
圖3
G+ 菌引物探針特異性驗證結果圖
a. 酶切法去除內源性核酸污染組擴增金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌混合 DNA 和無菌水的擴增結果；b. 未去除內源性核酸污染組擴增金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌混合 DNA 和無菌水的擴增結果
2.4 去除核酸污染方法檢測限和靈敏度檢測
對比培養法和酶切法去除內源性核酸污染的熒光定量多重 PCR 檢測結果，見圖 4、表 2。FAM 通道有擴增曲線且 Ct<40 表明為 G+ 菌陽性，VIC 通道有擴增曲線且 Ct<40 表明為 G– 菌陽性。酶切法去除內源性核酸污染對熒光定量 PCR 檢測限及靈敏度均無影響。
表2
培養法和熒光定量多重 PCR 檢測限測試結果
圖4
酶切法去除內源核酸污染后混合 DNA 的擴增結果圖
3 討論
顱內感染是一種神經外科手術中較為常見但嚴重的并發癥，顱內術后常見的感染細菌包含多種 G+ 菌和 G– 菌，而熒光定量 PCR 反應體系的內源性核酸污染容易導致假陽性的出現，從而產生誤診，因此 PCR 體系內源核酸污染的去除就十分必要[12]。
目前文獻報道的去除熒光定量 PCR 反應體系內源核酸污染的最有效方法是過濾法和核酸內切酶消化法[13]。本研究用于去除 PCR 反應體系內源核酸污染的方法為 EcoRⅠ和 DNase Ⅰ酶切法，以及過濾法。EcoRⅠ和 DNase Ⅰ酶切法僅需前處理 75 min，就可去除 PCR 反應體系中的內源性核酸污染。該法對 Taq DNA 聚合酶活性及擴增效率均無明顯影響，對 PCR 體系檢測的靈敏度 Ct 值也無明顯影響。而過濾法雖操作簡單，但對 DNA 酶活性以及擴增效率有明顯的抑制作用，Ct 值重復性差，熒光信號明顯降低。因此本研究選用 EcoRⅠ和 DNase Ⅰ酶切法去除 PCR 體系內源核酸污染。
近年來，熒光定量 PCR 技術常用于檢測顱內術后 G– 菌和 G+ 菌的感染，如大腸桿菌等[14]。本研究中首先去除 PCR 反應體系內的核酸污染，再采用 G– 菌和 G+ 菌通用引物探針進行 PCR 擴增，從而區分種屬。本研究中使用的探針引物特異性好，只針對相應的 G– 菌和 G+ 菌有擴增。
顱內感染是目前長期困擾神經外科醫生的重要并發癥。本研究建立的細菌熒光定量 PCR 體系內源性核酸污染去除方法可為降低或排除顱內感染細菌假陽性結果提供快速、可靠的實驗依據，為臨床診斷提供可靠的保障。
