調節性 T 細胞（regulatory T cell，Treg）在免疫耐受中發揮著至關重要的作用，可以通過控制對自身抗原的免疫反應來預防自身免疫性疾病的發生，同時能夠抑制免疫系統對外來抗原的應答，從而減少 T 細胞介導的病理性免疫應答。近年來研究顯示器官特異性自身免疫的抑制作用依賴于 Treg 的抗原特異性。一種新興的 Treg 作用模式是表達特異性抗原的樹突狀細胞激活抗原特異性 Treg 并使其獲得抑制活性。因此，抗原特異性 Treg 的過繼治療比多克隆 Treg 更為有效，確定相關抗原，并從多克隆 Treg 中擴增出抗原特異性 Treg。該文對抗原特異性 Treg 的擴增技術、功能、抗原特異性以及 Treg 在臨床中的潛在治療進行了綜述。
引用本文： 金熙, 李虹. 抗原特異性調節性 T 細胞的研究進展及其在臨床中的應用前景. 華西醫學, 2018, 33(5): 616-622. doi: 10.7507/1002-0179.201707024 復制
適應性免疫應答是通過識別“自身”和“非己”，有效地排除體內異物抗原，以維持機體對自身抗原的耐受。達到對自身抗原的外周免疫耐受可以通過多種不同的機制，但是主要的途徑是通過調節性 T 細胞（regulatory T cell，Treg）對免疫應答的抑制作用[1-2]。Treg 可以通過控制對自身抗原的免疫反應來預防自身免疫性疾病的發生，同時能夠抑制免疫系統對外來抗原的應答，從而減少 T 細胞介導的病理性免疫應答。Treg 的免疫抑制機制主要是對 CD4+、CD8+ T 細胞以及 B 細胞的活化反應作出抑制調節。Treg 還能抑制 CD4+CD25-細胞以及樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的活化增殖[3]。Treg 的抑制特性使得其成為免疫治療的最佳候選方案。大量實驗研究證實 Treg 能夠控制自身免疫性疾病，誘導移植耐受以及預防移植物抗宿主疾病（graft-versus-host disease，GVHD）[4-6]等。
小鼠模型的相關研究顯示多克隆 Treg 能夠預防各種自身免疫疾病[7]。體外實驗顯示 Treg 抑制功能的激活需要通過 T 細胞受體（T cell receptor，TCR）將 Treg 活化，一旦活化，Treg 能夠抑制 T 細胞，其抑制作用是非抗原特異性的。有研究分析 Treg 的 TCR，結果顯示大部分該群細胞能夠識別外周自身抗原[8]。Treg 在廣表達外周自身抗原的長期刺激下，形成了 Treg 的廣泛抑制作用，而建立抗原特異性免疫應答能夠克服這個問題。近年有文獻報道 Treg 的功能和器官特異性耐受主要與抗原特異性 Treg 相關[9-10]。首先，早期的 Treg 治療研究提到 Treg 的體外回輸需要擴增大量的多克隆 Treg，并且要在淋巴細胞減少的情況下實施，這樣能夠驅使回輸 Treg 的擴增以及激活抑制能力[11-13]。其次，最近研究報道顯示在小鼠異種 GVHD 模型中，抗原特異性 Treg 比多克隆擴增 Treg 能夠更有效地控制 GVHD 的發生[14]。這些結果提示抗原特異性是 Treg 發揮其最佳功能的關鍵，同時也預測有效的 Treg 細胞治療受益于從多克隆 Treg 中獲得能夠識別和選擇性擴增的器官特異性 Treg。抗原特異性 Treg 的使用可能會避免回輸大量多克隆 Treg 帶來的副作用，例如腫瘤與感染的發生。本文將對抗原特異性 Treg 的擴增技術、功能、抗原特異性以及 Treg 在臨床中的潛在治療進行綜述。
1 抗原特異性 Treg 的體外擴增
在體內回輸治療中如何獲得足夠數量的 Treg 細胞是早期研究的障礙。在小鼠和人中，CD4+CD25+ Treg 在 CD4+ T 細胞中占 3%～5%[14]，因此有大量實驗研究建立了體外擴增多克隆 Treg 的方案[15-16]。體外研究發現 Treg 具有免疫無能性，它對效應 T 細胞的刺激源表現出無應答狀態[17]。當經 TCR 介導信號刺激并有高濃度外源性白細胞介素（interleukin，IL）-2 存在的情況下，Treg 細胞可活化并增殖[18]。IL-2 最早被稱為 T 細胞生長因子，在體外能夠促進 T 細胞的生長和擴增。有研究發現 IL-2 不僅能夠增強 Treg 的表型和功能，還可能是 Treg 的生存因子[19]。
Treg 的擴增依賴于 TCR 和 CD28 信號途徑[15, 20]。擴增多克隆 Treg 需要外源性添加 IL-2 與通過 TCR 和 CD28 對 Treg 進行刺激。Treg 的擴增方案一般先通過 CD4、CD25 表面分子分選純化出 Treg，然后用 CD3/CD28 抗體包被磁珠刺激純化的 Treg，同時添加外源性的高劑量 IL-2[18, 21-22]。Treg 經過擴增后仍然維持其抑制作用，與新鮮分離 Treg 相比，擴增后的 Treg 甚至獲得較強的抑制能力。
高效能的抗原特異性 Treg 的應用能夠減少 Treg 回輸的數量，而目前抗原特異性 Treg 的細胞頻率還尚不明確，但似乎與抗原特異性 T 細胞在 CD4+效應細胞中的細胞頻率相似[23]。盡管細胞頻率很低，抗原特異性 Treg 從多克隆 Treg 中擴增還是能夠實現。Peters 等[20]將人 Treg 分別經過 2 輪擴克隆刺激（抗 CD3/CD28 磁珠）和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）不匹配的異基因外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）刺激聯合重組 IL-2 和重組 IL-15 來誘導異基因抗原特異性 Treg。經過 2 輪刺激后，Treg 擴增倍數能夠達到 780 倍，并具有抑制功能以及抗原特異性。抗原特異性 Treg 的成功誘導取決于抗原刺激的順序。當 Treg 先用異基因抗原刺激，后用多克隆刺激，2 輪刺激后可獲得大量 Treg 并具有抗原特異性抑制作用。而 Treg 在體外先經過多克隆刺激后，再接受異基因抗原刺激，雖然能夠獲得大量細胞，抑制作用具有抗原特異性，但是對第三方抗原刺激仍有抑制作用。而在我們的研究中，人的 Treg 在 CD3/CD28 抗體包被磁珠刺激聯合雷帕霉素和高劑量 IL-2 在體外培養 1 個周期（7 d），以富集 Treg 數，擴增后的 Treg 再與異種抗原（豬 PBMC）共培養 2 個周期以獲得異種抗原特異性 Treg[18, 24]。研究結果顯示，Treg 經過 1 個周期異種抗原刺激后，Treg 表型沒有發生改變且具有抑制作用，但是擴增倍數只有 14.2 倍，并且沒有獲得異種抗原特異性。經過 3 個周期異種抗原刺激后，Treg 的異種抗原特異性顯著增強，其擴增倍數達到 1 329 倍，但 Treg 抑制能力較第 2 周期時有所下降。經過 2 個周期異種抗原刺激后，Treg 的擴增倍數達到 814 倍，在異種抗原刺激的混合淋巴細胞反應中，異種抗原特異性 Treg 在反應細胞與 Treg 比例為 8∶1、16∶1 和 32∶1 時的抑制率都遠高于多克隆 Treg 在相同比例下的抑制率。結果提示異種抗原刺激 2 個周期，Treg 在異種抗原反應中的抑制作用增強，具有異種抗原特異性。
除此之外，也有其他方法用來擴增 Treg。利用異基因 DC 聯合 IL-2，能夠從多克隆 Treg 中擴增出抗原特異性 Treg，并且能夠抑制 CD4+CD25-細胞增殖以及 GVHD 的發生[25]。Litjens 等[26]利用異基因 DC 聯合 IL-15 擴增出抗原特異性 Treg。在胰島表達溶血素的轉基因小鼠模型中，DC 細胞能夠向多克隆 Treg 遞呈胰島溶血素肽，從而擴增出抗原特異性 Treg，并且具有抑制功能[27]。同時也有大量研究顯示，在體外各種條件刺激下能夠誘導 CD4+CD25-細胞表達叉頭框蛋白 P3（forkhead box P3，Foxp3），從而轉變為 Treg[28-29]。Long 等[30]研究報道能夠通過谷氨酸脫羧酶、葡糖-6-磷酸催化亞基相關蛋白肽和 1 型糖尿病相關 HLA-DRbeta 等位基因將 CD4+Foxp3- T 細胞誘導成胰島抗原特異性 Treg。Tu 等[31]報道在沒有外源細胞因子的刺激下，將 CD40 活化 B 細胞與 CD4+CD25- T 細胞共培養 3 周后，能誘導出抗原特異性 Treg。這種誘導的異基因抗原特異性 Treg 屬于 CD45RO+CCR7-記憶細胞，表達 CD4、CD25、Foxp3 以及 CD62L。盡管 CD4+CD25+Foxp3+抗原特異性 Treg 沒有細胞毒性作用，但是他們通過細胞間接觸來發揮其抑制功能并依賴于細胞毒 T 淋巴細胞相關抗原 4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）。Zheng 等[32]用 CD40 活化 B 細胞誘導和擴增 CD8 Treg，使其具有抗原特異性，其發揮抑制功能依賴于干擾素 γ、IL-2、IL-4 和 CTLA-4。
2 Treg 的抗原特異性
Treg 對器官特異性自身免疫的治療依賴于 Treg 對相關抗原的識別能力，研究發現 Treg 和 CD4+CD25- T 細胞一樣都能表達 TCR 家族多種基因，提示 Treg 能夠識別多種抗原[33-34]。在胸腺中發育，Treg 在陽性和陰性選擇的親和范圍內對自身抗原作出應答，因此使 Treg 的 TCR 對自身抗原具有高度親和力[35]。但是近來有研究提出親和力的重要性[36]，提示嵌合抗原受體在 T 細胞中更重要。一種 Treg 發育模式表明未成熟的胸腺細胞上的 TCR 與特異性的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子抗原肽復合物結合誘導 Foxp3 表達，這種親和力的范圍在陽性選擇和陰性選擇之間[36]。分析 Treg 的 TCR 證實與 CD4+CD25-細胞相比，這群細胞對自身抗原具有高度親和力，而 Treg 的 TCR 與 CD4+CD25-細胞的 TCR 只有小部分的重疊[8]。
抗原特異性 Treg 通過識別靶抗原或表位對治療自身免疫性疾病有潛在作用。不同自身免疫性疾病的致病抗原被發現，如 1 型糖尿病中的胰島素和谷氨酸脫羧酶，多發性硬化癥的髓磷脂堿基蛋白以及風濕性關節炎中的Ⅱ型膠原等。抗原特異性 Treg 的過繼轉移治療能夠針對特異性抗原發揮抑制作用，而不影響機體其他免疫功能。非肥胖型糖尿病（non-obese diabetic，NOD）小鼠模型實驗數據表明胰島抗原特異性 Treg 具有抑制功能并且能夠控制糖尿病的發生[37]。Karim 等[38]將 CBA 小鼠的 Treg 分離后用供者特異性抗原（B10 小鼠血液）和抗 CD4 單克隆抗體預處理，再與 CD45RBhighCD4+細胞共同回輸到 CBA Rag-/- 小鼠，1 d 后將 B10 小鼠的皮膚移植到細胞回輸的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，結果發現這種方式誘導的抗原特異性 Treg 能夠預防供者來源皮膚移植排斥的發生，長達 100 d。為了證明 Treg 的抗原特異性，作者將 CBA 小鼠的 Treg 分離后用第三方來源抗原（BALB/c 小鼠血液）和抗 CD4 單克隆抗體預處理，再與 CD45RBhighCD4+細胞共同回輸到 CBA Rag-/-小鼠，1 d 后將 B10 小鼠的皮膚移植到細胞回輸的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，結果發現誘導的第三方抗原特異性 Treg 不能有效地預防供者來源皮膚移植，B10 小鼠的皮膚在 25 d 被完全排斥。此外，作者用抗 CD4 單克隆抗體和 BALB/c 小鼠血液注射到 CBA 小鼠體內，將 Treg 從該小鼠脾臟中分離同時和 CD45RBhighCD4+細胞回輸到 CBA Rag-/-小鼠，1 d 后將 BALB/c 小鼠的皮膚移植到細胞回輸的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，結果發現 Treg 能夠有效防止 BALB/c 小鼠的皮膚移植排斥的發生。但是用 BALB/c 小鼠抗原誘導出的 Treg 并不能阻止 B10 小鼠皮膚移植排斥反應的發生。這些結果提示用抗 CD4 單克隆抗體和供者特異性抗原能夠在體內和體外誘導出具有抗原特異性的 Treg，并且能夠發揮抗原特異性的抑制作用。
3 抗原特異性 Treg 的抑制機制
目前 Treg 機制的研究有很多，而且對 Treg 抑制免疫應答的機制仍然存在很多爭論。我們的體外研究表明抗原特異性 Treg 不僅通過細胞與細胞之間的接觸來發揮其抑制作用，還通過細胞因子的分泌來發揮其抑制功能[18, 24]。體外擴增的抗原特異性 Treg 比非特異性 Treg 分泌更多的 IL-10、IL-35 和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），并且表達更多的 CTLA-4 和可誘導共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）[18, 24]，提示這些分子可能與 Treg 免疫調節的增強有關。當在體外培養體系中封閉 IL-10 和 IL-35 后，Treg 保持抑制功能但其功能下降。當用 Transwell 小室將 Treg 與反應細胞分開后，再向該培養體系中加入抗體封閉 IL-10 和 IL-35，則能阻斷 Treg 的抑制功能。盡管 Treg 依賴于細胞表面分子 Foxp3 和 CTLA-4 以及表面活化因子 ICOS 和 HLA-DR 發揮抑制作用，但依賴細胞因子的抑制作用仍是其發揮功能的重要機制之一。而在體內，Treg 可能不止通過一種機制來發揮抑制作用。Yi 等[39]的體內研究表明 IL-10 在 Treg 介導的異種抗原免疫應答的抑制作用中扮演著重要的角色。不同機制的發揮可能取決于 Treg 是否抑制自身免疫性疾病的起始應答還是對疾病中活化 T 細胞的控制。局部細胞因子環境或疾病病理環境可能都對 Treg 的抑制功能有影響。
為了更好地了解抗原特異性 Treg 在體內的機制，Tang 等[40]使用雙光子掃描顯微鏡觀察淋巴結內 Treg 和糖尿病致病 T 細胞以及 DC 之間的動態變化。當胰島反應性 T 細胞過繼到 CD28 缺陷 NOD 小鼠中，這些輔助性 T 細胞（T helper cell，Th）起初在胰腺淋巴結與 DC 短暫性地相互作用，并且在胰腺淋巴結集結成簇[41-43]，Th 細胞識別 DC 呈遞的抗原，形成一個比較穩定的結合狀態，促使 T 細胞的活化與增殖。當胰島抗原特異性 Treg 與胰島反應性 T 細胞同時過繼到 CD28 缺陷 NOD 小鼠中時，在胰腺淋巴結中卻表現為不規則和大幅度的運動狀態。這表明 Treg 可在胰腺淋巴結內阻止糖尿病致病性 T 細胞與 DC 接觸從而抑制其活化。Treg 和 Th 之間的作用不如二者與 DC 之間的作用穩定。雖然 Treg 在胰腺淋巴結內可以部分抑制活化前的 Th 與 DC 的相互作用，但卻無法完全阻斷這種作用。實際上，在淋巴結內無論是 Treg 還是 Th 都與 DC 間存在著穩固的相互作用，雖然 Treg 與 Th 相互間的接觸并不穩定，但由于 DC 的存在，Treg 與 DC 相互作用，使其活化并分泌可溶性細胞因子，從而發揮抑制功能[40]。
4 抗原特異性 Treg 在臨床中的應用前景
4.1 抗原特異性 Treg 與自身免疫性疾病
近幾年 Treg 在自身免疫疾病中的作用得到了廣泛的重視和研究，Treg 數量的缺乏或者功能的缺乏與人器官特異性自身免疫性疾病的發生相關。在 1 型糖尿病患者中發現，Treg 在外周血中的數量減少[44]，而在另一些研究中發現 1 型糖尿病患者中 Treg 在外周血的數量并沒有減少，但是其抑制增殖和炎性細胞因子分泌的功能顯著下降[45]。Tang 等[46]首次采用有效方法從 NOD 小鼠中擴增出抗原特異性 Treg，并具有抑制效應 T 細胞增殖的作用。將其回輸到 NOD 小鼠體內，能有效地阻止糖尿病的發展，逆轉糖尿病并長期維持免疫穩定。Masteller 等[47]研究也顯示擴增出的胰島抗原特異性 Treg 具有免疫抑制功能，與多克隆 Treg 相比具有更好控制 NOD 小鼠糖尿病的作用。Tran 等[48]將 CD4+CD25+ Treg 與 IL-4 和表達 IL5Rα 的自身抗原共培養，誘導抗原特異性 Treg。rIL-5 治療實驗性自身免疫性神經炎能夠顯著減少臨床癱瘓，減輕體質量，減少脫髓鞘以及 CD4+、CD8+ T 細胞和巨噬細胞在神經中的浸潤。實驗中通過 rIL-5 擴增出自身抗原特異性 Treg，而這些細胞能有效控制自身免疫性疾病。最近有研究報道用自身免疫疾病相關肽結合 MHCⅡ類分子包被的納米顆粒能夠誘導出類似抗原特異性 1 型 Treg，將其回輸到不同自身免疫疾病的小鼠模型中，能夠抑制自身免疫反應[49]。
4.2 抗原特異性 Treg 與 GVHD
異基因造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）已經被廣泛用于治療惡性和非惡性血液系統疾病，但 GVHD 是 HSCT 的主要障礙，也是移植后主要并發癥和死亡原因。GVHD 是由供者 T 細胞特異性識別受者異基因抗原后發生的多階段病理過程而造成。在鼠類 HSCT 模型中，共移植多克隆擴增 Treg 能夠有效減少 GVHD 的發生，促進免疫重建，保留抗腫瘤的活性[50-52]。抗原特異性 Treg 可選擇性清除對供者有特異性反應的效應 T 細胞，使對宿主的影響減到最小，促進移植后免疫重建，推測其控制 GVHD 更為有效。而多項實驗研究證明體外誘導擴增的抗原特異性 Treg 比多克隆擴增 Treg 能更有效地控制 GVHD 的發生，并保留移植物抗腫瘤效應[53]。Trenado 等[54]將異體抗原特異性 Treg 與多克隆 Treg 相比發現，兩種 Treg 都能預防 GVHD，但在接受多克隆 Treg 回輸小鼠組中，在脾臟、肺和肝臟中出現 GVHD 病理征兆，而在接受異體抗原特異性 Treg 小鼠中未發現 GVHD 的征兆。因此抗原特異性 Treg 可能更有效地改善 GVHD。Veerapathran 等[55]研究發現，異體抗原特異性 Treg 能夠選擇性地對異基因抗原作出應答，其作用效率是多克隆 Treg 和新鮮分離 Treg 的 100 倍。抗原特異性 Treg 高表達 Foxp3、Bcl-2、CD62L 以及 CCR7，并且遷移到淋巴組織中。與非特異性 Treg 相比，抗原特異性 Treg 分泌更多的 TGF-β 和 IL-10，表達更多的 CTLA-4，提示用 HLA 不匹配的抗原選擇性擴增 Treg 能夠有效地預防 GVHD 并保留移植物抗腫瘤效應[55]。但是在 Koenecke 等[56]的研究中，他們的觀點與上述報道不盡相同。他們通過 DC 誘導的抗原特異性 Foxp3+ Treg 主要表達 CD62L，在體外具有有效的抑制作用。但是與天然調節性 T 細胞（nature Treg, nTreg）相比，抗原特異性 Foxp3+ Treg 過繼治療并不能預防 GVHD。在體內，回輸的抗原特異性 Foxp3+CD4+ Treg 很快轉變成 Foxp3-CD4+ T 細胞。因此他們提出在 GVHD 治療中只能采用 nTreg 的過繼治療，而對抗原特異性 Treg 的使用需要謹慎，誘導的抗原特異性 Treg 的調節表型的穩定性值得關注[56]。
4.3 抗原特異性 Treg 與移植耐受
nTreg 可對自身和非自身抗原進行免疫調節，并廣泛運用于誘導移植耐受。有研究小組發現在人源化小鼠模型中輸注體外多克隆擴增的 Treg 能通過抑制效應 T 細胞的免疫反應，有效預防異種胰島移植物的排斥和異種 GVHD，誘導移植物耐受[39]。這些數據證實了 Treg 過繼治療的潛在可能，這種免疫療法可抑制免疫排斥反應，也能減少免疫抑制劑的使用負擔。nTreg 和多克隆活化的 Treg 被廣泛應用，但同時他們會導致全身性免疫抑制，增加感染和腫瘤發生的風險。抗原特異性 Treg 能達到有效免疫，同時又能減少免疫抑制劑或多克隆 Treg 帶來的副作用。多個實驗抑制模型證明供者特異性 Treg 比多克隆 Treg 更有效，能延長移植物存活，誘導耐受。Sagoo 等[57]通過 DC 在體外擴增出異基因抗原特異性人 Treg，共表達 CD69 和 CD71 兩種活化表型。在人源化小鼠皮膚移植的異基因免疫損傷模型中，與多克隆 Treg 相比，回輸異基因抗原特異性 Treg 能顯著減少臨床相關的皮膚組織損傷指標，能更有效地保護皮膚移植物不受免疫損傷，誘導移植物耐受。在 Treg 過繼治療后 3 d，不管是抗原特異性 Treg 還是多克隆 Treg 都被招募到皮膚移植物處，但抗原特異性 Treg 的數量大于多克隆 Treg，并在移植處與供者細胞相互作用。實驗結果提示供者特異性 Treg 介導的抑制作用發生在異體抗原表達的部位和效應細胞的靶組織處，并可能通過早期的相互作用，影響抗原遞呈細胞的功能和效應細胞的募集。Takasato 等[58]研究中發現回輸體外擴增的抗原特異性 Treg 至心臟移植的小鼠模型中，能預防心臟移植物排斥反應的發生并能延長移植物存活時間，同時他們證明了在臨床細胞治療中回輸體外擴增的抗原特異性 Treg 誘導心臟同種異體移植終生免疫耐受的潛在可能。臨床預實驗顯示人或小鼠抗原特異性 Treg 能從多克隆 Treg 中選擇性擴增，而這些抗原特異性 Treg 比多克隆 Treg 在預防移植物排斥和誘導耐受中更為有效[59]。
5 對抗原特異性 Treg 治療疾病的展望
Treg 是一種重要的具有免疫調節功能的細胞，在體內外得到廣泛研究并取得較大進展，但其能否在臨床中得以應用仍需進一步研究與改善。例如探尋識別鑒定 Treg 更好的方法，建立更有效的方法來擴增抗原特異性 Treg，檢測 Treg 在體內功能的方法需要進一步開發。如何在體內誘導 Treg 以及功能的發揮需要進一步研究，而在體內誘導和擴增抗原特異性 Treg 的研究不多。因此，在體內外誘導擴增抗原特異性 Treg 是治療自身免疫性疾病和誘導移植耐受的重要目標。
適應性免疫應答是通過識別“自身”和“非己”，有效地排除體內異物抗原，以維持機體對自身抗原的耐受。達到對自身抗原的外周免疫耐受可以通過多種不同的機制，但是主要的途徑是通過調節性 T 細胞（regulatory T cell，Treg）對免疫應答的抑制作用[1-2]。Treg 可以通過控制對自身抗原的免疫反應來預防自身免疫性疾病的發生，同時能夠抑制免疫系統對外來抗原的應答，從而減少 T 細胞介導的病理性免疫應答。Treg 的免疫抑制機制主要是對 CD4+、CD8+ T 細胞以及 B 細胞的活化反應作出抑制調節。Treg 還能抑制 CD4+CD25-細胞以及樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的活化增殖[3]。Treg 的抑制特性使得其成為免疫治療的最佳候選方案。大量實驗研究證實 Treg 能夠控制自身免疫性疾病，誘導移植耐受以及預防移植物抗宿主疾病（graft-versus-host disease，GVHD）[4-6]等。
小鼠模型的相關研究顯示多克隆 Treg 能夠預防各種自身免疫疾病[7]。體外實驗顯示 Treg 抑制功能的激活需要通過 T 細胞受體（T cell receptor，TCR）將 Treg 活化，一旦活化，Treg 能夠抑制 T 細胞，其抑制作用是非抗原特異性的。有研究分析 Treg 的 TCR，結果顯示大部分該群細胞能夠識別外周自身抗原[8]。Treg 在廣表達外周自身抗原的長期刺激下，形成了 Treg 的廣泛抑制作用，而建立抗原特異性免疫應答能夠克服這個問題。近年有文獻報道 Treg 的功能和器官特異性耐受主要與抗原特異性 Treg 相關[9-10]。首先，早期的 Treg 治療研究提到 Treg 的體外回輸需要擴增大量的多克隆 Treg，并且要在淋巴細胞減少的情況下實施，這樣能夠驅使回輸 Treg 的擴增以及激活抑制能力[11-13]。其次，最近研究報道顯示在小鼠異種 GVHD 模型中，抗原特異性 Treg 比多克隆擴增 Treg 能夠更有效地控制 GVHD 的發生[14]。這些結果提示抗原特異性是 Treg 發揮其最佳功能的關鍵，同時也預測有效的 Treg 細胞治療受益于從多克隆 Treg 中獲得能夠識別和選擇性擴增的器官特異性 Treg。抗原特異性 Treg 的使用可能會避免回輸大量多克隆 Treg 帶來的副作用，例如腫瘤與感染的發生。本文將對抗原特異性 Treg 的擴增技術、功能、抗原特異性以及 Treg 在臨床中的潛在治療進行綜述。
1 抗原特異性 Treg 的體外擴增
在體內回輸治療中如何獲得足夠數量的 Treg 細胞是早期研究的障礙。在小鼠和人中，CD4+CD25+ Treg 在 CD4+ T 細胞中占 3%～5%[14]，因此有大量實驗研究建立了體外擴增多克隆 Treg 的方案[15-16]。體外研究發現 Treg 具有免疫無能性，它對效應 T 細胞的刺激源表現出無應答狀態[17]。當經 TCR 介導信號刺激并有高濃度外源性白細胞介素（interleukin，IL）-2 存在的情況下，Treg 細胞可活化并增殖[18]。IL-2 最早被稱為 T 細胞生長因子，在體外能夠促進 T 細胞的生長和擴增。有研究發現 IL-2 不僅能夠增強 Treg 的表型和功能，還可能是 Treg 的生存因子[19]。
Treg 的擴增依賴于 TCR 和 CD28 信號途徑[15, 20]。擴增多克隆 Treg 需要外源性添加 IL-2 與通過 TCR 和 CD28 對 Treg 進行刺激。Treg 的擴增方案一般先通過 CD4、CD25 表面分子分選純化出 Treg，然后用 CD3/CD28 抗體包被磁珠刺激純化的 Treg，同時添加外源性的高劑量 IL-2[18, 21-22]。Treg 經過擴增后仍然維持其抑制作用，與新鮮分離 Treg 相比，擴增后的 Treg 甚至獲得較強的抑制能力。
高效能的抗原特異性 Treg 的應用能夠減少 Treg 回輸的數量，而目前抗原特異性 Treg 的細胞頻率還尚不明確，但似乎與抗原特異性 T 細胞在 CD4+效應細胞中的細胞頻率相似[23]。盡管細胞頻率很低，抗原特異性 Treg 從多克隆 Treg 中擴增還是能夠實現。Peters 等[20]將人 Treg 分別經過 2 輪擴克隆刺激（抗 CD3/CD28 磁珠）和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）不匹配的異基因外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）刺激聯合重組 IL-2 和重組 IL-15 來誘導異基因抗原特異性 Treg。經過 2 輪刺激后，Treg 擴增倍數能夠達到 780 倍，并具有抑制功能以及抗原特異性。抗原特異性 Treg 的成功誘導取決于抗原刺激的順序。當 Treg 先用異基因抗原刺激，后用多克隆刺激，2 輪刺激后可獲得大量 Treg 并具有抗原特異性抑制作用。而 Treg 在體外先經過多克隆刺激后，再接受異基因抗原刺激，雖然能夠獲得大量細胞，抑制作用具有抗原特異性，但是對第三方抗原刺激仍有抑制作用。而在我們的研究中，人的 Treg 在 CD3/CD28 抗體包被磁珠刺激聯合雷帕霉素和高劑量 IL-2 在體外培養 1 個周期（7 d），以富集 Treg 數，擴增后的 Treg 再與異種抗原（豬 PBMC）共培養 2 個周期以獲得異種抗原特異性 Treg[18, 24]。研究結果顯示，Treg 經過 1 個周期異種抗原刺激后，Treg 表型沒有發生改變且具有抑制作用，但是擴增倍數只有 14.2 倍，并且沒有獲得異種抗原特異性。經過 3 個周期異種抗原刺激后，Treg 的異種抗原特異性顯著增強，其擴增倍數達到 1 329 倍，但 Treg 抑制能力較第 2 周期時有所下降。經過 2 個周期異種抗原刺激后，Treg 的擴增倍數達到 814 倍，在異種抗原刺激的混合淋巴細胞反應中，異種抗原特異性 Treg 在反應細胞與 Treg 比例為 8∶1、16∶1 和 32∶1 時的抑制率都遠高于多克隆 Treg 在相同比例下的抑制率。結果提示異種抗原刺激 2 個周期，Treg 在異種抗原反應中的抑制作用增強，具有異種抗原特異性。
除此之外，也有其他方法用來擴增 Treg。利用異基因 DC 聯合 IL-2，能夠從多克隆 Treg 中擴增出抗原特異性 Treg，并且能夠抑制 CD4+CD25-細胞增殖以及 GVHD 的發生[25]。Litjens 等[26]利用異基因 DC 聯合 IL-15 擴增出抗原特異性 Treg。在胰島表達溶血素的轉基因小鼠模型中，DC 細胞能夠向多克隆 Treg 遞呈胰島溶血素肽，從而擴增出抗原特異性 Treg，并且具有抑制功能[27]。同時也有大量研究顯示，在體外各種條件刺激下能夠誘導 CD4+CD25-細胞表達叉頭框蛋白 P3（forkhead box P3，Foxp3），從而轉變為 Treg[28-29]。Long 等[30]研究報道能夠通過谷氨酸脫羧酶、葡糖-6-磷酸催化亞基相關蛋白肽和 1 型糖尿病相關 HLA-DRbeta 等位基因將 CD4+Foxp3- T 細胞誘導成胰島抗原特異性 Treg。Tu 等[31]報道在沒有外源細胞因子的刺激下，將 CD40 活化 B 細胞與 CD4+CD25- T 細胞共培養 3 周后，能誘導出抗原特異性 Treg。這種誘導的異基因抗原特異性 Treg 屬于 CD45RO+CCR7-記憶細胞，表達 CD4、CD25、Foxp3 以及 CD62L。盡管 CD4+CD25+Foxp3+抗原特異性 Treg 沒有細胞毒性作用，但是他們通過細胞間接觸來發揮其抑制功能并依賴于細胞毒 T 淋巴細胞相關抗原 4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）。Zheng 等[32]用 CD40 活化 B 細胞誘導和擴增 CD8 Treg，使其具有抗原特異性，其發揮抑制功能依賴于干擾素 γ、IL-2、IL-4 和 CTLA-4。
2 Treg 的抗原特異性
Treg 對器官特異性自身免疫的治療依賴于 Treg 對相關抗原的識別能力，研究發現 Treg 和 CD4+CD25- T 細胞一樣都能表達 TCR 家族多種基因，提示 Treg 能夠識別多種抗原[33-34]。在胸腺中發育，Treg 在陽性和陰性選擇的親和范圍內對自身抗原作出應答，因此使 Treg 的 TCR 對自身抗原具有高度親和力[35]。但是近來有研究提出親和力的重要性[36]，提示嵌合抗原受體在 T 細胞中更重要。一種 Treg 發育模式表明未成熟的胸腺細胞上的 TCR 與特異性的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子抗原肽復合物結合誘導 Foxp3 表達，這種親和力的范圍在陽性選擇和陰性選擇之間[36]。分析 Treg 的 TCR 證實與 CD4+CD25-細胞相比，這群細胞對自身抗原具有高度親和力，而 Treg 的 TCR 與 CD4+CD25-細胞的 TCR 只有小部分的重疊[8]。
抗原特異性 Treg 通過識別靶抗原或表位對治療自身免疫性疾病有潛在作用。不同自身免疫性疾病的致病抗原被發現，如 1 型糖尿病中的胰島素和谷氨酸脫羧酶，多發性硬化癥的髓磷脂堿基蛋白以及風濕性關節炎中的Ⅱ型膠原等。抗原特異性 Treg 的過繼轉移治療能夠針對特異性抗原發揮抑制作用，而不影響機體其他免疫功能。非肥胖型糖尿病（non-obese diabetic，NOD）小鼠模型實驗數據表明胰島抗原特異性 Treg 具有抑制功能并且能夠控制糖尿病的發生[37]。Karim 等[38]將 CBA 小鼠的 Treg 分離后用供者特異性抗原（B10 小鼠血液）和抗 CD4 單克隆抗體預處理，再與 CD45RBhighCD4+細胞共同回輸到 CBA Rag-/- 小鼠，1 d 后將 B10 小鼠的皮膚移植到細胞回輸的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，結果發現這種方式誘導的抗原特異性 Treg 能夠預防供者來源皮膚移植排斥的發生，長達 100 d。為了證明 Treg 的抗原特異性，作者將 CBA 小鼠的 Treg 分離后用第三方來源抗原（BALB/c 小鼠血液）和抗 CD4 單克隆抗體預處理，再與 CD45RBhighCD4+細胞共同回輸到 CBA Rag-/-小鼠，1 d 后將 B10 小鼠的皮膚移植到細胞回輸的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，結果發現誘導的第三方抗原特異性 Treg 不能有效地預防供者來源皮膚移植，B10 小鼠的皮膚在 25 d 被完全排斥。此外，作者用抗 CD4 單克隆抗體和 BALB/c 小鼠血液注射到 CBA 小鼠體內，將 Treg 從該小鼠脾臟中分離同時和 CD45RBhighCD4+細胞回輸到 CBA Rag-/-小鼠，1 d 后將 BALB/c 小鼠的皮膚移植到細胞回輸的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，結果發現 Treg 能夠有效防止 BALB/c 小鼠的皮膚移植排斥的發生。但是用 BALB/c 小鼠抗原誘導出的 Treg 并不能阻止 B10 小鼠皮膚移植排斥反應的發生。這些結果提示用抗 CD4 單克隆抗體和供者特異性抗原能夠在體內和體外誘導出具有抗原特異性的 Treg，并且能夠發揮抗原特異性的抑制作用。
3 抗原特異性 Treg 的抑制機制
目前 Treg 機制的研究有很多，而且對 Treg 抑制免疫應答的機制仍然存在很多爭論。我們的體外研究表明抗原特異性 Treg 不僅通過細胞與細胞之間的接觸來發揮其抑制作用，還通過細胞因子的分泌來發揮其抑制功能[18, 24]。體外擴增的抗原特異性 Treg 比非特異性 Treg 分泌更多的 IL-10、IL-35 和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），并且表達更多的 CTLA-4 和可誘導共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）[18, 24]，提示這些分子可能與 Treg 免疫調節的增強有關。當在體外培養體系中封閉 IL-10 和 IL-35 后，Treg 保持抑制功能但其功能下降。當用 Transwell 小室將 Treg 與反應細胞分開后，再向該培養體系中加入抗體封閉 IL-10 和 IL-35，則能阻斷 Treg 的抑制功能。盡管 Treg 依賴于細胞表面分子 Foxp3 和 CTLA-4 以及表面活化因子 ICOS 和 HLA-DR 發揮抑制作用，但依賴細胞因子的抑制作用仍是其發揮功能的重要機制之一。而在體內，Treg 可能不止通過一種機制來發揮抑制作用。Yi 等[39]的體內研究表明 IL-10 在 Treg 介導的異種抗原免疫應答的抑制作用中扮演著重要的角色。不同機制的發揮可能取決于 Treg 是否抑制自身免疫性疾病的起始應答還是對疾病中活化 T 細胞的控制。局部細胞因子環境或疾病病理環境可能都對 Treg 的抑制功能有影響。
為了更好地了解抗原特異性 Treg 在體內的機制，Tang 等[40]使用雙光子掃描顯微鏡觀察淋巴結內 Treg 和糖尿病致病 T 細胞以及 DC 之間的動態變化。當胰島反應性 T 細胞過繼到 CD28 缺陷 NOD 小鼠中，這些輔助性 T 細胞（T helper cell，Th）起初在胰腺淋巴結與 DC 短暫性地相互作用，并且在胰腺淋巴結集結成簇[41-43]，Th 細胞識別 DC 呈遞的抗原，形成一個比較穩定的結合狀態，促使 T 細胞的活化與增殖。當胰島抗原特異性 Treg 與胰島反應性 T 細胞同時過繼到 CD28 缺陷 NOD 小鼠中時，在胰腺淋巴結中卻表現為不規則和大幅度的運動狀態。這表明 Treg 可在胰腺淋巴結內阻止糖尿病致病性 T 細胞與 DC 接觸從而抑制其活化。Treg 和 Th 之間的作用不如二者與 DC 之間的作用穩定。雖然 Treg 在胰腺淋巴結內可以部分抑制活化前的 Th 與 DC 的相互作用，但卻無法完全阻斷這種作用。實際上，在淋巴結內無論是 Treg 還是 Th 都與 DC 間存在著穩固的相互作用，雖然 Treg 與 Th 相互間的接觸并不穩定，但由于 DC 的存在，Treg 與 DC 相互作用，使其活化并分泌可溶性細胞因子，從而發揮抑制功能[40]。
4 抗原特異性 Treg 在臨床中的應用前景
4.1 抗原特異性 Treg 與自身免疫性疾病
近幾年 Treg 在自身免疫疾病中的作用得到了廣泛的重視和研究，Treg 數量的缺乏或者功能的缺乏與人器官特異性自身免疫性疾病的發生相關。在 1 型糖尿病患者中發現，Treg 在外周血中的數量減少[44]，而在另一些研究中發現 1 型糖尿病患者中 Treg 在外周血的數量并沒有減少，但是其抑制增殖和炎性細胞因子分泌的功能顯著下降[45]。Tang 等[46]首次采用有效方法從 NOD 小鼠中擴增出抗原特異性 Treg，并具有抑制效應 T 細胞增殖的作用。將其回輸到 NOD 小鼠體內，能有效地阻止糖尿病的發展，逆轉糖尿病并長期維持免疫穩定。Masteller 等[47]研究也顯示擴增出的胰島抗原特異性 Treg 具有免疫抑制功能，與多克隆 Treg 相比具有更好控制 NOD 小鼠糖尿病的作用。Tran 等[48]將 CD4+CD25+ Treg 與 IL-4 和表達 IL5Rα 的自身抗原共培養，誘導抗原特異性 Treg。rIL-5 治療實驗性自身免疫性神經炎能夠顯著減少臨床癱瘓，減輕體質量，減少脫髓鞘以及 CD4+、CD8+ T 細胞和巨噬細胞在神經中的浸潤。實驗中通過 rIL-5 擴增出自身抗原特異性 Treg，而這些細胞能有效控制自身免疫性疾病。最近有研究報道用自身免疫疾病相關肽結合 MHCⅡ類分子包被的納米顆粒能夠誘導出類似抗原特異性 1 型 Treg，將其回輸到不同自身免疫疾病的小鼠模型中，能夠抑制自身免疫反應[49]。
4.2 抗原特異性 Treg 與 GVHD
異基因造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）已經被廣泛用于治療惡性和非惡性血液系統疾病，但 GVHD 是 HSCT 的主要障礙，也是移植后主要并發癥和死亡原因。GVHD 是由供者 T 細胞特異性識別受者異基因抗原后發生的多階段病理過程而造成。在鼠類 HSCT 模型中，共移植多克隆擴增 Treg 能夠有效減少 GVHD 的發生，促進免疫重建，保留抗腫瘤的活性[50-52]。抗原特異性 Treg 可選擇性清除對供者有特異性反應的效應 T 細胞，使對宿主的影響減到最小，促進移植后免疫重建，推測其控制 GVHD 更為有效。而多項實驗研究證明體外誘導擴增的抗原特異性 Treg 比多克隆擴增 Treg 能更有效地控制 GVHD 的發生，并保留移植物抗腫瘤效應[53]。Trenado 等[54]將異體抗原特異性 Treg 與多克隆 Treg 相比發現，兩種 Treg 都能預防 GVHD，但在接受多克隆 Treg 回輸小鼠組中，在脾臟、肺和肝臟中出現 GVHD 病理征兆，而在接受異體抗原特異性 Treg 小鼠中未發現 GVHD 的征兆。因此抗原特異性 Treg 可能更有效地改善 GVHD。Veerapathran 等[55]研究發現，異體抗原特異性 Treg 能夠選擇性地對異基因抗原作出應答，其作用效率是多克隆 Treg 和新鮮分離 Treg 的 100 倍。抗原特異性 Treg 高表達 Foxp3、Bcl-2、CD62L 以及 CCR7，并且遷移到淋巴組織中。與非特異性 Treg 相比，抗原特異性 Treg 分泌更多的 TGF-β 和 IL-10，表達更多的 CTLA-4，提示用 HLA 不匹配的抗原選擇性擴增 Treg 能夠有效地預防 GVHD 并保留移植物抗腫瘤效應[55]。但是在 Koenecke 等[56]的研究中，他們的觀點與上述報道不盡相同。他們通過 DC 誘導的抗原特異性 Foxp3+ Treg 主要表達 CD62L，在體外具有有效的抑制作用。但是與天然調節性 T 細胞（nature Treg, nTreg）相比，抗原特異性 Foxp3+ Treg 過繼治療并不能預防 GVHD。在體內，回輸的抗原特異性 Foxp3+CD4+ Treg 很快轉變成 Foxp3-CD4+ T 細胞。因此他們提出在 GVHD 治療中只能采用 nTreg 的過繼治療，而對抗原特異性 Treg 的使用需要謹慎，誘導的抗原特異性 Treg 的調節表型的穩定性值得關注[56]。
4.3 抗原特異性 Treg 與移植耐受
nTreg 可對自身和非自身抗原進行免疫調節，并廣泛運用于誘導移植耐受。有研究小組發現在人源化小鼠模型中輸注體外多克隆擴增的 Treg 能通過抑制效應 T 細胞的免疫反應，有效預防異種胰島移植物的排斥和異種 GVHD，誘導移植物耐受[39]。這些數據證實了 Treg 過繼治療的潛在可能，這種免疫療法可抑制免疫排斥反應，也能減少免疫抑制劑的使用負擔。nTreg 和多克隆活化的 Treg 被廣泛應用，但同時他們會導致全身性免疫抑制，增加感染和腫瘤發生的風險。抗原特異性 Treg 能達到有效免疫，同時又能減少免疫抑制劑或多克隆 Treg 帶來的副作用。多個實驗抑制模型證明供者特異性 Treg 比多克隆 Treg 更有效，能延長移植物存活，誘導耐受。Sagoo 等[57]通過 DC 在體外擴增出異基因抗原特異性人 Treg，共表達 CD69 和 CD71 兩種活化表型。在人源化小鼠皮膚移植的異基因免疫損傷模型中，與多克隆 Treg 相比，回輸異基因抗原特異性 Treg 能顯著減少臨床相關的皮膚組織損傷指標，能更有效地保護皮膚移植物不受免疫損傷，誘導移植物耐受。在 Treg 過繼治療后 3 d，不管是抗原特異性 Treg 還是多克隆 Treg 都被招募到皮膚移植物處，但抗原特異性 Treg 的數量大于多克隆 Treg，并在移植處與供者細胞相互作用。實驗結果提示供者特異性 Treg 介導的抑制作用發生在異體抗原表達的部位和效應細胞的靶組織處，并可能通過早期的相互作用，影響抗原遞呈細胞的功能和效應細胞的募集。Takasato 等[58]研究中發現回輸體外擴增的抗原特異性 Treg 至心臟移植的小鼠模型中，能預防心臟移植物排斥反應的發生并能延長移植物存活時間，同時他們證明了在臨床細胞治療中回輸體外擴增的抗原特異性 Treg 誘導心臟同種異體移植終生免疫耐受的潛在可能。臨床預實驗顯示人或小鼠抗原特異性 Treg 能從多克隆 Treg 中選擇性擴增，而這些抗原特異性 Treg 比多克隆 Treg 在預防移植物排斥和誘導耐受中更為有效[59]。
5 對抗原特異性 Treg 治療疾病的展望
Treg 是一種重要的具有免疫調節功能的細胞，在體內外得到廣泛研究并取得較大進展，但其能否在臨床中得以應用仍需進一步研究與改善。例如探尋識別鑒定 Treg 更好的方法，建立更有效的方法來擴增抗原特異性 Treg，檢測 Treg 在體內功能的方法需要進一步開發。如何在體內誘導 Treg 以及功能的發揮需要進一步研究，而在體內誘導和擴增抗原特異性 Treg 的研究不多。因此，在體內外誘導擴增抗原特異性 Treg 是治療自身免疫性疾病和誘導移植耐受的重要目標。