腫瘤細胞來源外泌體既可幫助腫瘤細胞逃逸免疫監視，也可激活腫瘤特異性免疫應答來清除腫瘤細胞。腫瘤細胞所釋放的外泌體表面攜帶有主要組織相容性復合體分子和抗原肽，可在體外誘導樹突狀細胞（dendritic cell，DC）-細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer cells，CIK 細胞），產生腫瘤抗原特異性 T 細胞，這樣獲得的 DC-CIK 細胞具有特異性和非特異性雙重殺瘤作用，對未來腫瘤的治療提供了一種新的方法。該文就腫瘤分泌的外泌體與 DC-CIK 細胞治療的研究進展予以綜述。
引用本文： 劉思雯, 董立華. 腫瘤細胞外泌體對樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞誘導作用的研究進展. 華西醫學, 2018, 33(4): 435-441. doi: 10.7507/1002-0179.201705122 復制
癌癥是人類的主要死亡原因之一，其治療手段主要為手術切除、放射治療和化學治療（化療）。大多數腫瘤患者通過這些方法獲得了明顯的療效[1-3]。隨著對癌癥研究的不斷深入，人們逐漸認識到應用傳統療法與免疫療法相結合的方法是降低癌癥患者病死率的一個新途徑。應用免疫細胞的自然免疫機制來識別和殺傷腫瘤是目前抑制癌癥發展甚至治愈癌癥的一種創新的、挑戰性的治療策略。過繼免疫治療是癌癥免疫療法中最有效的方法之一[4]，使用樹突狀細胞（dendritic cell，DC）聯合細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer cell，CIK 細胞）免疫治療就屬于腫瘤的過繼免疫治療。DC 和 CIK 細胞對惡性腫瘤免疫治療極其關鍵，兩者產生的作用及其所引發的免疫應答是免疫治療的重要部分。外泌體攜帶有多種生物活性物質，由細胞胞吐產生而進入細胞微環境中，再通過其他細胞攝取來完成細胞間的信息傳遞。隨著外泌體攜帶的活性物質作用的不斷發現，外泌體在腫瘤發生發展中的研究也受到越來越多的關注。因此若將以上兩點結合起來，通過外泌體作用于 DC-CIK 細胞來對腫瘤進行治療，必將會帶來突破性的進展。現就腫瘤外泌體及 DC-CIK 細胞治療的研究進展予以綜述。
1 外泌體與腫瘤
1.1 外泌體的生物學特性
1981 年，Trams 等[5]首先發現外泌體。2007 年，Vlassov 等[6]發現外泌體是一類內含核酸、蛋白質、脂類、糖類等的微小囊泡，其通過細胞胞吐的形式釋放到細胞外環境，在細胞間物質運輸及信息傳遞中起關鍵作用，具有廣泛的生理功能，與腫瘤學、免疫學等領域的研究相關。
外泌體直徑為 40～100 nm，呈圓形或杯形，密度為 1.13～1.19 g/mL，通過多泡內吞體與細胞表面融合或直接通過細胞膜出芽分泌[7]。研究外泌體的蛋白組成發現，外泌體內有核酸、線粒體、內質網、高爾基體內蛋白的存在，目前已被鑒定的外泌體蛋白均來自細胞質、內吞泡和質膜[8]。在鈣離子依賴性激活或 Rab-GTPases 激活后，外泌體與細胞質膜融合。腫瘤細胞外泌體分泌增加是由 Rab3D（一種小的 GTP 酶）過表達導致的。外泌體的釋放可由多種信號通路介導，如 Wnt 通路的活化是腫瘤細胞中外泌體分泌失控的重要原因[9]。腫瘤的酸性微環境也能刺激外泌體的釋放及加強其細胞融合能力。外泌體的攝取是通過內吞作用、受配體相互作用或依賴于微環境 pH 的直接融合而完成的[10]。
外泌體中蛋白質分選部分依賴于蛋白泛素化和內體蛋白分選轉運裝置。外泌體內含有大量的轉運蛋白，如微管蛋白、肌動蛋白和肌動蛋白結合分子以及與分泌細胞特異性功能相關的多種蛋白質。近乎所有的外泌體均攜帶主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子和熱休克蛋白（heat shock protein，HSP），特別是 HSP70 和 HSP90。HSP70 和 HSP90 參與抗原呈遞，并且可以將抗原肽連接到 MHCⅠ類分子上[11]。外泌體內含有高濃度的四跨膜蛋白，包括 CD9、CD63、CD81 和 CD82，這些在其他微囊泡中很少被發現，并且通過與其他跨膜蛋白的相互作用參與抗原呈遞與黏附。CD9 和 CD82 通過與整合素的相互作用抑制體內外腫瘤細胞的轉移和侵襲[12]。
除了蛋白質外，外泌體內還含有脂質，特別是神經酰胺、鞘脂、膽固醇和甘油磷脂等脂筏脂質，以及微 RNA（microRNA，miRNA）、信使 RNA（messengerRNA，mRNA）和 DNA，使細胞能夠交換遺傳信息[13]。可以使用外泌體 miRNA 來對腫瘤進行診斷。已有多種 miRNA 被確定為腫瘤的特異性標志物。有研究通過對卵巢腫瘤患者腫瘤細胞和外泌體的 miRNA 分析，發現 miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-214 可以作為卵巢癌的特異性生物標志物[14]。亦有研究發現非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血漿外泌體中 let-7f、miR-20b 和 miR-30e-3p 水平均降低，miR-30e-3p 和 let-7f 水平分別與無病生存率和總體生存率相關，且其水平與患者不良預后相關[15]。相較其他存在于生物體液內的生物標志物，外泌體中的生物標志物具有較高的特異性和良好的穩定性，因此可以作為臨床診斷的依據，但仍需進一步研究。
外泌體的分離仍是目前研究的重點，因其機制研究上的不明確，要獲得純度較高且完整的外泌體樣本仍存在一些困難。差速離心法是目前分離外泌體的主要方法，包括多個離心步驟，以增加的離心強度順序沉淀細胞、微泡和外泌體，此方法快速且簡便，但當用于黏性生物體液如血漿、血清等時效率較低。ExoQuick 試劑盒提取外泌體即在超速離心前化學沉淀外泌體，此方法優缺點與差速離心法相似。另一種方法是微流體免疫法，即使血清流過微室，其內含有針對外泌體標志物（上皮細胞黏附分子、CD63 等）的抗體，但該方法僅能獲得表達目標標志物的外泌體，而無法得到外泌體的其他亞群[16]。
1.2 外泌體與腫瘤
哺乳動物體內的多種細胞均能釋放外泌體，且正常生理狀態及病理狀態下體液、尿液及乳汁等都存在外泌體，因此外泌體有可能是檢測疾病和預測疾病進展的一個新指標[17]。在腫瘤發生發展的過程中，外泌體參與細胞間的信息傳遞，進而促進腫瘤血管的生成和實體瘤的轉移，腫瘤來源的外泌體（tumor-derived exosome，TDE）已經成為腫瘤分子生物研究的熱點之一[6]。
惡性腫瘤細胞通過其細胞環境的改變來調節自身的發生、發展和轉移，且這種調節可以通過 TDE 和腫瘤細胞分泌因子發生。研究表明，TDE 可以通過調節骨髓祖細胞[18]、前哨淋巴結[19]及轉移致癌受體、蛋白質、RNA[20-21]來促進腫瘤的發生和轉移。Thakur 等[22]發現外泌體中存在表達整個基因組 DNA 的雙鏈 DNA，即外泌體 DNA，其可用于鑒定腫瘤細胞中存在的突變。由于外泌體 DNA 穩定存在于 TDE，通過外泌體表面標志物易于分離或富集 TDE 和制備簡便快捷等特點，外泌體 DNA 在癌癥的早期診斷及監測治療效果方面具有極大潛力。
2 DC
2.1 DC 的生物學特性
DC 源自骨髓，是已知提呈功能最強的專職性抗原提呈細胞，具有高于 B 細胞和巨噬細胞 10～100 倍的抗原提呈能力。DC 可以刺激初始 T 細胞活化和增殖，將腫瘤細胞抗原呈遞至 T 細胞，誘導 T 細胞特異性增殖，從而殺滅腫瘤細胞，而且可以有效抵制腫瘤的免疫逃逸機制，在抗腫瘤免疫治療中起到關鍵作用[23]。
DC 通過內吞作用有效地吸收抗原肽，并加工抗原將其呈現在 MHC 分子上。此過程有 2 種經典的途徑，即激活 CD8+ T 細胞的 MHCⅠ通路和向 CD4+ T 細胞呈遞抗原肽的 MHCⅡ途徑。除此以外還存在另一種通路，即交叉呈遞，外源性抗原呈現在 MHCⅠ類分子上以誘導 CD8+ T 細胞應答，經過交叉呈遞和改裝，可從其他細胞中獲得整個肽-MHC 復合物，但其確切機制仍不明確。
通過 MHCⅠ途徑呈遞的抗原來源于細胞質，蛋白酶體將抗原降解為 8～12 個氨基酸長度的肽段，然后將其釋放回細胞質內，通過抗原加工相關轉運體（分子協助抗原肽段轉運至內質網中，隨后肽段裝載至 MHCⅠ類分子上。成功裝載肽段要求有多個蛋白質參與形成組裝復合體，肽段連接導致組裝復合體的解離，然后完整的肽-MHCⅠ復合物通過高爾基體轉運至細胞表面，被 CD8+ T 細胞識別。所有細胞均可以表達 MHCⅠ并通過該途徑將感染細胞的抗原呈遞至免疫系統。
通過 MHCⅡ途徑呈遞的抗原通常來源于細胞外，因此這些蛋白質需先經過內化。蛋白質經內吞進入細胞，并在內吞泡中被降解加工為 12～24 個氨基酸長度的肽段。MHCⅡ類分子在內質網中產生并通過恒定鏈穩定存在，恒定鏈可促進 MHCⅡ類分子轉運至高爾基體，內吞體內肽段與 MHCⅡ類分子在高爾基體內結合[24]。恒定鏈內存在一個名為 CLIP 的小片段，可封閉肽結合槽，直至恒定鏈被降解，CLIP 脫離肽結合槽，抗原肽進入并與 MHCⅡ類分子結合，隨后 MHCⅡ類分子轉運至細胞表面，被 CD4+ T 細胞識別。
交叉呈遞為外源性抗原與 MHCⅠ類分子結合形成復合物從而誘導 CD4+ T 細胞應答。此途徑可對非 DC 感染的腫瘤和病毒產生免疫應答[25]。目前其確切的作用機制仍在進一步研究中。
2.2 DC 的抗腫瘤作用
DC 在癌癥免疫監測中起主要作用。腫瘤浸潤性 DC 遷移到局部淋巴結，并呈現腫瘤抗原刺激幼稚的腫瘤特異性 T 細胞，引發抗瘤免疫反應。然而，有證據表明，腫瘤抗原的交叉呈遞也可發生在腫瘤自身，初始的 T 淋巴細胞浸潤腫瘤并引發應答[26-27]。這些研究結果表明，除了在淋巴組織中驅動反應之外，腫瘤浸潤性 DC 可在局部啟動 T 細胞。
DC 存在許多與腫瘤浸潤相關的亞型。CD103+、CD11b+ 和漿細胞樣 DC 存在于腫瘤中，CD103+ 和 CD11b+ 在鼠和人類腫瘤中水平均較低。所有 DC 亞型均具有獲得抗原的能力，DC 可通過受體介導的胞吞作用來攝取抗原[28-29]。處理和呈遞抗原的能力在 DC 的不同亞型之間有所不同。
DC 之間可以通過外泌體轉移 mRNA 和小 RNA（包括 miRNA）。miRNA 的轉移可以作為信息交流和轉錄后修飾的手段。有研究表明，接受 miRNA 的 DC 中目標 mRNA 的表達將受到抑制，因此特定 RNA 引起的轉錄后修飾可能會影響抗原提呈細胞的功能，導致其臨床應用的成功或失敗[30]。
有研究將腫瘤患者胸腹水中的外泌體與患者自體的 DC 共培養，隨后使用 DC 刺激外周血分離得來的 T 淋巴細胞，并與胸腹水中分離得到的腫瘤細胞一起培養，發現腫瘤細胞發生了溶解，說明 DC 具有抗瘤作用[31]。
目前所有應用 DC 來進行抗腫瘤的治療策略均是利用其抗原呈遞作用，增強腫瘤抗原的提呈，誘導出 T 細胞抗瘤。目前許多臨床研究已驗證傳統 DC 疫苗抗腫瘤策略的有效性，但其仍面臨許多問題，如疫苗均針對個體設計，無法進行大批量的生產，研究出新的優化 DC 疫苗的抗瘤方案是目前研究的關鍵。
3 CIK 細胞
3.1 CIK 細胞的生物學特性
CIK 細胞是由外周血單個核細胞經體外誘導分化而產生的多克隆效應 T 細胞群，主要來自健康供體或癌癥患者的外周血、臍帶血和骨髓，具有自然殺傷 T 細胞（natural killer T cell，NKT 細胞）表型（即 CD3+ CD56+）、強大的擴增潛力和非 MHC 限制性殺傷能力，對骨髓及造血細胞未產生嚴重的副作用[32]。CIK 細胞解決了目前過繼免疫治療策略所面臨的一些主要限制。外周血單個核細胞離體擴增相對容易且價格較低，可以此獲得足夠量的過繼輸入和有效的免疫效應。
3.2 CIK 細胞的抗腫瘤作用
CIK 細胞通過表達 NKG2D 受體，與腫瘤細胞表面的 NKG2D 配體相互作用達到殺瘤目的。NKG2D 識別的主要目標是 MICA/B，其廣泛表達于惡性或轉化細胞以及 JL16 結合蛋白家族（UL16-binding proteins，ULBP）[33-34]。CIK 細胞上的 NKG2D 分子與腫瘤細胞上的 MICA/B 或 ULBP 分子之間的相互作用使其具有 MHC 非限制性腫瘤殺傷作用。
CIK 細胞不僅具有識別腫瘤的能力，而且具有腫瘤靶向性。CIK 細胞對腫瘤細胞靶向性遷移的機制尚未明確，目前認為其機制可能是以下 2 個方面共同作用的結果：① 腫瘤細胞釋放的趨化因子、細胞因子，誘導 CIK 細胞向腫瘤微環境趨向遷移。有研究認為腫瘤微環境中含有高濃度的旁分泌生長因子如血小板衍生因子、堿性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子等，對 CIK 細胞的趨向遷移起調控作用[35]。② CIK 細胞表面表達的受體能夠與腫瘤細胞表面特異的配體結合[36]。NKG2D 為自然殺傷細胞（natural killer cell，NK 細胞）的活化受體，可在多種免疫細胞表面表達，具有參與適應性免疫應答及固有免疫和調節 NK 細胞、T 細胞、巨噬細胞以及 DC 的功能。NKG2D 的配體為 HLA-Ⅰ類相關基因產物，在應激細胞、腫瘤細胞以及病毒感染細胞表面均可普遍上調表達[37]。CIK 細胞通過其表面 NKG2D 受體與腫瘤表面相應的配體結合，特異地刺激 CIK 細胞分泌腫瘤殺傷因子從而識別和殺傷腫瘤細胞。CIK 療法已被證明對多種實體腫瘤和血液惡性腫瘤有效，具有成為常規供體淋巴細胞輸注的替代方案的潛力。
研究表明，不同外周血單個核細胞的分離方法可以影響患者自體 CIK 細胞的生物學特性[38]。通過對比血細胞分離器（單采法）和 Ficoll 淋巴細胞分離培養基（Ficoll 法）分離外周血單個核細胞，發現單采法得到的單個核細胞的數量遠遠大于 Ficoll 法，但其分離率較低，存在更多的細胞碎片。體外培養后發現，Ficoll 組 CIK 細胞的富集時間較長，CD3+CD4+［輔助性 T 細胞（helper T cell，Th）］和 CD4+CD25+（調節性 T 細胞）細胞的比例較高。在血漿分離法中，CD3–CD56+（NK）和 CD3+CD56+（NKT）細胞的百分比較高，CIK 細胞對 HepG2 肝癌細胞表現出較高的細胞溶解活性。總之，不同的外周血單個核細胞分離方法可以影響 CIK 細胞的生物學活性，并且單采法更可有效地提高 CIK 細胞的抗腫瘤效能。然而，應該重視注射單采血液供體產生不良反應的可能性。
4 DC-CIK
4.1 DC-CIK 細胞的生物學特性
DC-CIK 即 DC 和 CIK 細胞在體外共培養，以回輸的方式來達到治療目的。將攜帶腫瘤抗原的 DC 與 CIK 細胞共同培養，能產生腫瘤抗原特異性 T 淋巴細胞，以發揮特異性和非特異性雙重殺瘤作用，且相較未負載腫瘤抗原的 DC 具有更強的刺激 CIK 細胞的活性。實際上，起到主要的抑瘤抗瘤作用的是經 DC 活化的 CIK 細胞。DC 和 CIK 細胞在腫瘤免疫治療中起重要作用，結合 CIK 細胞的高效殺傷活性和 DC 的強大腫瘤抗原提呈能力可有效增強腫瘤患者 T 淋巴細胞免疫力，起到抗腫瘤作用。近年來 CIK 與 DC 共同培養在臨床應用中對多系統腫瘤都有良好療效，具有極大潛力。一些研究表明，DC 和 CIK 細胞之間的相互作用引起兩個群體的表面分子表達的變化，導致白細胞介素（interleukin，IL）-12 分泌增加，并提高了細胞毒活性[39-41]。因此，DC-CIK 療法可能對癌癥患者的免疫治療方案有重大影響。
有研究將 DC 和 CIK 相結合的化療免疫治療與常規化療相對比，發現 DC-CIK 免疫可以協同加強化療，提供強有力的系統性抗腫瘤活性，其較常規化療可以有效延長 NSCLC 晚期患者生命 5.2～6.9 個月，且較少發生化療常見的副作用，而隨之發生的皮膚毒性和非感染性發熱等副作用也較輕且易控制[42]。這一發現表明 DC-CIK 免疫治療與化學治療協同作用可以提供有效的全身抗腫瘤作用。此現象的原因可能為：① 化療后的細胞死亡可能對隨后的免疫應答產生影響。② 化療會耗盡調節性 T 細胞，從而增強免疫應答。③ 化療后免疫系統重組可以通過形成針對腫瘤抗原反應性的基因譜系來提供治療干預的獨特機會。④ 化療可能會改變細胞因子在 DC 上的表達來發揮其免疫潛能。因此，通過 DC-CIK 免疫可以減少不良反應，在整個抗腫瘤活動中起到關鍵作用。
Cui 等[43]通過延遲型超敏反應皮膚試驗來確定細胞免疫應答，以此評估 DC-CIK 聯合治療的臨床表現和安全性，研究表明接受 DC-CIK 聯合治療的患者延遲型超敏反應陽性率高于接受 DC 單獨治療的患者（P<0.01），且其主觀臨床表現也有改善，患者的耐受良好，輕度不良反應也均可通過相關治療得到緩解。DC-CIK 聯合治療在癌癥治療中表現為低毒性且患者對該方案的耐受性普遍良好，無嚴重副作用發生，因此該方案是一種前途廣闊的癌癥治療方案。
4.2 DC、CIK 細胞之間的相互作用
有研究顯示，DC、CIK 細胞之間會產生協同作用，共同培養會使 DC 表面共刺激分子表達增加，也會顯著提高其抗原遞呈能力，同時 CIK 細胞的增殖能力和細胞毒活性均得到加強，由此證明 DC-CIK 細胞較單獨的 CIK 細胞治療更為有效。發生此情況的原因可能是成熟 DC 表面的大量突起可呈遞腫瘤抗原至 CIK 細胞。除此之外，也可能是激活后的 DC 所分泌的細胞因子（如 IL-12、IL-18、干擾素-8 等）可以刺激 Th0、Th2 細胞分化為 Th1 細胞，引發 Th1 型特異性免疫應答，并經 MHCⅡ類分子呈遞外源性抗原被 CD8 細胞識別，引發免疫應答反應，且在此過程中可產生強烈的共刺激信號。Xie 等[44]研究發現將負載腫瘤裂解物的 DC 與 CIK、NK 細胞結合來治療肝臟未分化胚胎性肉瘤具有令人滿意的結果，所有的病例中腫瘤均得到了緩解，患者的生命也得到了延長，但無完全治愈病例。Jung 等[45]研究發現，DC-CIK 細胞聯合應用能夠顯著增加肝癌小鼠中細胞毒性 T 細胞的數量，而單獨 DC 或 CIK 治療對腫瘤細胞影響無統計學意義。
5 外泌體對 DC-CIK 細胞的誘導作用
5.1 參與腫瘤免疫逃逸
Chen 等[46]研究表明 TDE 通過下調 CD3+、CD8+、NK（CD56+）和 CD3+CD56+ 細胞以及分泌腫瘤壞死因子-α 和穿孔素來抑制 CIK 細胞的抗腫瘤活性，并且參與腫瘤的免疫逃逸。除此以外，TDE 可以抑制腫瘤的特異性免疫應答和免疫監視。Xiang 等[47]發現 TDE 可以引起腫瘤中骨髓來源的抑制細胞的積累，Yu 等[48]發現 TDE 來源的 IL-6 可以阻斷骨髓 DC 分化。這些內源性腫瘤衍生的外泌體抑制抗腫瘤免疫應答的確切機制仍有待充分證明，及由此可能產生的重要的新型治療靶點仍待研究。由于已有實質性證據表明 TDE 具有促進癌癥進展的功能，因此 TDE 可能成為癌癥診斷及預后監測的有效生物標志物。
5.2 參與腫瘤特異性免疫應答
腫瘤細胞來源外泌體既可幫助腫瘤細胞逃逸免疫監視，也可激活腫瘤特異性免疫應答。值得一提的是，TDE 內包含腫瘤特異性抗原，可以在體外產生 MHCⅠ類限制性 T 細胞克隆，且 TDE 可以在體內驅動依賴 T 細胞的交叉保護作用對抗同源和異源腫瘤[49]。因此可以利用外泌體來源的抗原預刺激 DC 進行靶向抗癌治療。腫瘤細胞所釋放的外泌體表面攜帶有 MHC 分子和抗原肽，可在體外誘導 DC-CIK 細胞，刺激產生特異性的抗瘤 T 細胞，并得到具有特異性和非特異性雙重抗瘤作用的 DC-CIK 細胞，對未來腫瘤的治療提供了一種不同以往的方法。外泌體可以增強 DC-CIK 的細胞毒活性，且其易于在體外培養，供體細胞若取交叉配血成功的健康個體的外周血，則獲得的 DC-CIK 細胞將具有更強的增殖活力，以此特異性地清除腫瘤細胞，增強患者的免疫力，從而達到殺瘤抑瘤的效果，為腫瘤過繼免疫治療的深入研究與臨床使用提供了全新的思路。
6 展望
過繼免疫療法具有極大的治療潛力，且有著極其廣闊的應用前景。目前應用腫瘤分泌外泌體誘導 DC-CIK 細胞分化已取得了初步成果，但仍存在許多急需解決的問題，如外泌體的分離方法、外泌體具體的作用機制、DC/CIK 細胞應用比例、DC/CIK 細胞分離方法及回輸途徑、DC-CIK 細胞培養最適條件等實際問題以及臨床療效評價等仍需進一步研究。相信隨著研究的進展，DC-CIK 療法將成為腫瘤免疫治療的有效方法，為腫瘤患者的診斷及治療帶來新的希望。
癌癥是人類的主要死亡原因之一，其治療手段主要為手術切除、放射治療和化學治療（化療）。大多數腫瘤患者通過這些方法獲得了明顯的療效[1-3]。隨著對癌癥研究的不斷深入，人們逐漸認識到應用傳統療法與免疫療法相結合的方法是降低癌癥患者病死率的一個新途徑。應用免疫細胞的自然免疫機制來識別和殺傷腫瘤是目前抑制癌癥發展甚至治愈癌癥的一種創新的、挑戰性的治療策略。過繼免疫治療是癌癥免疫療法中最有效的方法之一[4]，使用樹突狀細胞（dendritic cell，DC）聯合細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer cell，CIK 細胞）免疫治療就屬于腫瘤的過繼免疫治療。DC 和 CIK 細胞對惡性腫瘤免疫治療極其關鍵，兩者產生的作用及其所引發的免疫應答是免疫治療的重要部分。外泌體攜帶有多種生物活性物質，由細胞胞吐產生而進入細胞微環境中，再通過其他細胞攝取來完成細胞間的信息傳遞。隨著外泌體攜帶的活性物質作用的不斷發現，外泌體在腫瘤發生發展中的研究也受到越來越多的關注。因此若將以上兩點結合起來，通過外泌體作用于 DC-CIK 細胞來對腫瘤進行治療，必將會帶來突破性的進展。現就腫瘤外泌體及 DC-CIK 細胞治療的研究進展予以綜述。
1 外泌體與腫瘤
1.1 外泌體的生物學特性
1981 年，Trams 等[5]首先發現外泌體。2007 年，Vlassov 等[6]發現外泌體是一類內含核酸、蛋白質、脂類、糖類等的微小囊泡，其通過細胞胞吐的形式釋放到細胞外環境，在細胞間物質運輸及信息傳遞中起關鍵作用，具有廣泛的生理功能，與腫瘤學、免疫學等領域的研究相關。
外泌體直徑為 40～100 nm，呈圓形或杯形，密度為 1.13～1.19 g/mL，通過多泡內吞體與細胞表面融合或直接通過細胞膜出芽分泌[7]。研究外泌體的蛋白組成發現，外泌體內有核酸、線粒體、內質網、高爾基體內蛋白的存在，目前已被鑒定的外泌體蛋白均來自細胞質、內吞泡和質膜[8]。在鈣離子依賴性激活或 Rab-GTPases 激活后，外泌體與細胞質膜融合。腫瘤細胞外泌體分泌增加是由 Rab3D（一種小的 GTP 酶）過表達導致的。外泌體的釋放可由多種信號通路介導，如 Wnt 通路的活化是腫瘤細胞中外泌體分泌失控的重要原因[9]。腫瘤的酸性微環境也能刺激外泌體的釋放及加強其細胞融合能力。外泌體的攝取是通過內吞作用、受配體相互作用或依賴于微環境 pH 的直接融合而完成的[10]。
外泌體中蛋白質分選部分依賴于蛋白泛素化和內體蛋白分選轉運裝置。外泌體內含有大量的轉運蛋白，如微管蛋白、肌動蛋白和肌動蛋白結合分子以及與分泌細胞特異性功能相關的多種蛋白質。近乎所有的外泌體均攜帶主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子和熱休克蛋白（heat shock protein，HSP），特別是 HSP70 和 HSP90。HSP70 和 HSP90 參與抗原呈遞，并且可以將抗原肽連接到 MHCⅠ類分子上[11]。外泌體內含有高濃度的四跨膜蛋白，包括 CD9、CD63、CD81 和 CD82，這些在其他微囊泡中很少被發現，并且通過與其他跨膜蛋白的相互作用參與抗原呈遞與黏附。CD9 和 CD82 通過與整合素的相互作用抑制體內外腫瘤細胞的轉移和侵襲[12]。
除了蛋白質外，外泌體內還含有脂質，特別是神經酰胺、鞘脂、膽固醇和甘油磷脂等脂筏脂質，以及微 RNA（microRNA，miRNA）、信使 RNA（messengerRNA，mRNA）和 DNA，使細胞能夠交換遺傳信息[13]。可以使用外泌體 miRNA 來對腫瘤進行診斷。已有多種 miRNA 被確定為腫瘤的特異性標志物。有研究通過對卵巢腫瘤患者腫瘤細胞和外泌體的 miRNA 分析，發現 miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-214 可以作為卵巢癌的特異性生物標志物[14]。亦有研究發現非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血漿外泌體中 let-7f、miR-20b 和 miR-30e-3p 水平均降低，miR-30e-3p 和 let-7f 水平分別與無病生存率和總體生存率相關，且其水平與患者不良預后相關[15]。相較其他存在于生物體液內的生物標志物，外泌體中的生物標志物具有較高的特異性和良好的穩定性，因此可以作為臨床診斷的依據，但仍需進一步研究。
外泌體的分離仍是目前研究的重點，因其機制研究上的不明確，要獲得純度較高且完整的外泌體樣本仍存在一些困難。差速離心法是目前分離外泌體的主要方法，包括多個離心步驟，以增加的離心強度順序沉淀細胞、微泡和外泌體，此方法快速且簡便，但當用于黏性生物體液如血漿、血清等時效率較低。ExoQuick 試劑盒提取外泌體即在超速離心前化學沉淀外泌體，此方法優缺點與差速離心法相似。另一種方法是微流體免疫法，即使血清流過微室，其內含有針對外泌體標志物（上皮細胞黏附分子、CD63 等）的抗體，但該方法僅能獲得表達目標標志物的外泌體，而無法得到外泌體的其他亞群[16]。
1.2 外泌體與腫瘤
哺乳動物體內的多種細胞均能釋放外泌體，且正常生理狀態及病理狀態下體液、尿液及乳汁等都存在外泌體，因此外泌體有可能是檢測疾病和預測疾病進展的一個新指標[17]。在腫瘤發生發展的過程中，外泌體參與細胞間的信息傳遞，進而促進腫瘤血管的生成和實體瘤的轉移，腫瘤來源的外泌體（tumor-derived exosome，TDE）已經成為腫瘤分子生物研究的熱點之一[6]。
惡性腫瘤細胞通過其細胞環境的改變來調節自身的發生、發展和轉移，且這種調節可以通過 TDE 和腫瘤細胞分泌因子發生。研究表明，TDE 可以通過調節骨髓祖細胞[18]、前哨淋巴結[19]及轉移致癌受體、蛋白質、RNA[20-21]來促進腫瘤的發生和轉移。Thakur 等[22]發現外泌體中存在表達整個基因組 DNA 的雙鏈 DNA，即外泌體 DNA，其可用于鑒定腫瘤細胞中存在的突變。由于外泌體 DNA 穩定存在于 TDE，通過外泌體表面標志物易于分離或富集 TDE 和制備簡便快捷等特點，外泌體 DNA 在癌癥的早期診斷及監測治療效果方面具有極大潛力。
2 DC
2.1 DC 的生物學特性
DC 源自骨髓，是已知提呈功能最強的專職性抗原提呈細胞，具有高于 B 細胞和巨噬細胞 10～100 倍的抗原提呈能力。DC 可以刺激初始 T 細胞活化和增殖，將腫瘤細胞抗原呈遞至 T 細胞，誘導 T 細胞特異性增殖，從而殺滅腫瘤細胞，而且可以有效抵制腫瘤的免疫逃逸機制，在抗腫瘤免疫治療中起到關鍵作用[23]。
DC 通過內吞作用有效地吸收抗原肽，并加工抗原將其呈現在 MHC 分子上。此過程有 2 種經典的途徑，即激活 CD8+ T 細胞的 MHCⅠ通路和向 CD4+ T 細胞呈遞抗原肽的 MHCⅡ途徑。除此以外還存在另一種通路，即交叉呈遞，外源性抗原呈現在 MHCⅠ類分子上以誘導 CD8+ T 細胞應答，經過交叉呈遞和改裝，可從其他細胞中獲得整個肽-MHC 復合物，但其確切機制仍不明確。
通過 MHCⅠ途徑呈遞的抗原來源于細胞質，蛋白酶體將抗原降解為 8～12 個氨基酸長度的肽段，然后將其釋放回細胞質內，通過抗原加工相關轉運體（分子協助抗原肽段轉運至內質網中，隨后肽段裝載至 MHCⅠ類分子上。成功裝載肽段要求有多個蛋白質參與形成組裝復合體，肽段連接導致組裝復合體的解離，然后完整的肽-MHCⅠ復合物通過高爾基體轉運至細胞表面，被 CD8+ T 細胞識別。所有細胞均可以表達 MHCⅠ并通過該途徑將感染細胞的抗原呈遞至免疫系統。
通過 MHCⅡ途徑呈遞的抗原通常來源于細胞外，因此這些蛋白質需先經過內化。蛋白質經內吞進入細胞，并在內吞泡中被降解加工為 12～24 個氨基酸長度的肽段。MHCⅡ類分子在內質網中產生并通過恒定鏈穩定存在，恒定鏈可促進 MHCⅡ類分子轉運至高爾基體，內吞體內肽段與 MHCⅡ類分子在高爾基體內結合[24]。恒定鏈內存在一個名為 CLIP 的小片段，可封閉肽結合槽，直至恒定鏈被降解，CLIP 脫離肽結合槽，抗原肽進入并與 MHCⅡ類分子結合，隨后 MHCⅡ類分子轉運至細胞表面，被 CD4+ T 細胞識別。
交叉呈遞為外源性抗原與 MHCⅠ類分子結合形成復合物從而誘導 CD4+ T 細胞應答。此途徑可對非 DC 感染的腫瘤和病毒產生免疫應答[25]。目前其確切的作用機制仍在進一步研究中。
2.2 DC 的抗腫瘤作用
DC 在癌癥免疫監測中起主要作用。腫瘤浸潤性 DC 遷移到局部淋巴結，并呈現腫瘤抗原刺激幼稚的腫瘤特異性 T 細胞，引發抗瘤免疫反應。然而，有證據表明，腫瘤抗原的交叉呈遞也可發生在腫瘤自身，初始的 T 淋巴細胞浸潤腫瘤并引發應答[26-27]。這些研究結果表明，除了在淋巴組織中驅動反應之外，腫瘤浸潤性 DC 可在局部啟動 T 細胞。
DC 存在許多與腫瘤浸潤相關的亞型。CD103+、CD11b+ 和漿細胞樣 DC 存在于腫瘤中，CD103+ 和 CD11b+ 在鼠和人類腫瘤中水平均較低。所有 DC 亞型均具有獲得抗原的能力，DC 可通過受體介導的胞吞作用來攝取抗原[28-29]。處理和呈遞抗原的能力在 DC 的不同亞型之間有所不同。
DC 之間可以通過外泌體轉移 mRNA 和小 RNA（包括 miRNA）。miRNA 的轉移可以作為信息交流和轉錄后修飾的手段。有研究表明，接受 miRNA 的 DC 中目標 mRNA 的表達將受到抑制，因此特定 RNA 引起的轉錄后修飾可能會影響抗原提呈細胞的功能，導致其臨床應用的成功或失敗[30]。
有研究將腫瘤患者胸腹水中的外泌體與患者自體的 DC 共培養，隨后使用 DC 刺激外周血分離得來的 T 淋巴細胞，并與胸腹水中分離得到的腫瘤細胞一起培養，發現腫瘤細胞發生了溶解，說明 DC 具有抗瘤作用[31]。
目前所有應用 DC 來進行抗腫瘤的治療策略均是利用其抗原呈遞作用，增強腫瘤抗原的提呈，誘導出 T 細胞抗瘤。目前許多臨床研究已驗證傳統 DC 疫苗抗腫瘤策略的有效性，但其仍面臨許多問題，如疫苗均針對個體設計，無法進行大批量的生產，研究出新的優化 DC 疫苗的抗瘤方案是目前研究的關鍵。
3 CIK 細胞
3.1 CIK 細胞的生物學特性
CIK 細胞是由外周血單個核細胞經體外誘導分化而產生的多克隆效應 T 細胞群，主要來自健康供體或癌癥患者的外周血、臍帶血和骨髓，具有自然殺傷 T 細胞（natural killer T cell，NKT 細胞）表型（即 CD3+ CD56+）、強大的擴增潛力和非 MHC 限制性殺傷能力，對骨髓及造血細胞未產生嚴重的副作用[32]。CIK 細胞解決了目前過繼免疫治療策略所面臨的一些主要限制。外周血單個核細胞離體擴增相對容易且價格較低，可以此獲得足夠量的過繼輸入和有效的免疫效應。
3.2 CIK 細胞的抗腫瘤作用
CIK 細胞通過表達 NKG2D 受體，與腫瘤細胞表面的 NKG2D 配體相互作用達到殺瘤目的。NKG2D 識別的主要目標是 MICA/B，其廣泛表達于惡性或轉化細胞以及 JL16 結合蛋白家族（UL16-binding proteins，ULBP）[33-34]。CIK 細胞上的 NKG2D 分子與腫瘤細胞上的 MICA/B 或 ULBP 分子之間的相互作用使其具有 MHC 非限制性腫瘤殺傷作用。
CIK 細胞不僅具有識別腫瘤的能力，而且具有腫瘤靶向性。CIK 細胞對腫瘤細胞靶向性遷移的機制尚未明確，目前認為其機制可能是以下 2 個方面共同作用的結果：① 腫瘤細胞釋放的趨化因子、細胞因子，誘導 CIK 細胞向腫瘤微環境趨向遷移。有研究認為腫瘤微環境中含有高濃度的旁分泌生長因子如血小板衍生因子、堿性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子等，對 CIK 細胞的趨向遷移起調控作用[35]。② CIK 細胞表面表達的受體能夠與腫瘤細胞表面特異的配體結合[36]。NKG2D 為自然殺傷細胞（natural killer cell，NK 細胞）的活化受體，可在多種免疫細胞表面表達，具有參與適應性免疫應答及固有免疫和調節 NK 細胞、T 細胞、巨噬細胞以及 DC 的功能。NKG2D 的配體為 HLA-Ⅰ類相關基因產物，在應激細胞、腫瘤細胞以及病毒感染細胞表面均可普遍上調表達[37]。CIK 細胞通過其表面 NKG2D 受體與腫瘤表面相應的配體結合，特異地刺激 CIK 細胞分泌腫瘤殺傷因子從而識別和殺傷腫瘤細胞。CIK 療法已被證明對多種實體腫瘤和血液惡性腫瘤有效，具有成為常規供體淋巴細胞輸注的替代方案的潛力。
研究表明，不同外周血單個核細胞的分離方法可以影響患者自體 CIK 細胞的生物學特性[38]。通過對比血細胞分離器（單采法）和 Ficoll 淋巴細胞分離培養基（Ficoll 法）分離外周血單個核細胞，發現單采法得到的單個核細胞的數量遠遠大于 Ficoll 法，但其分離率較低，存在更多的細胞碎片。體外培養后發現，Ficoll 組 CIK 細胞的富集時間較長，CD3+CD4+［輔助性 T 細胞（helper T cell，Th）］和 CD4+CD25+（調節性 T 細胞）細胞的比例較高。在血漿分離法中，CD3–CD56+（NK）和 CD3+CD56+（NKT）細胞的百分比較高，CIK 細胞對 HepG2 肝癌細胞表現出較高的細胞溶解活性。總之，不同的外周血單個核細胞分離方法可以影響 CIK 細胞的生物學活性，并且單采法更可有效地提高 CIK 細胞的抗腫瘤效能。然而，應該重視注射單采血液供體產生不良反應的可能性。
4 DC-CIK
4.1 DC-CIK 細胞的生物學特性
DC-CIK 即 DC 和 CIK 細胞在體外共培養，以回輸的方式來達到治療目的。將攜帶腫瘤抗原的 DC 與 CIK 細胞共同培養，能產生腫瘤抗原特異性 T 淋巴細胞，以發揮特異性和非特異性雙重殺瘤作用，且相較未負載腫瘤抗原的 DC 具有更強的刺激 CIK 細胞的活性。實際上，起到主要的抑瘤抗瘤作用的是經 DC 活化的 CIK 細胞。DC 和 CIK 細胞在腫瘤免疫治療中起重要作用，結合 CIK 細胞的高效殺傷活性和 DC 的強大腫瘤抗原提呈能力可有效增強腫瘤患者 T 淋巴細胞免疫力，起到抗腫瘤作用。近年來 CIK 與 DC 共同培養在臨床應用中對多系統腫瘤都有良好療效，具有極大潛力。一些研究表明，DC 和 CIK 細胞之間的相互作用引起兩個群體的表面分子表達的變化，導致白細胞介素（interleukin，IL）-12 分泌增加，并提高了細胞毒活性[39-41]。因此，DC-CIK 療法可能對癌癥患者的免疫治療方案有重大影響。
有研究將 DC 和 CIK 相結合的化療免疫治療與常規化療相對比，發現 DC-CIK 免疫可以協同加強化療，提供強有力的系統性抗腫瘤活性，其較常規化療可以有效延長 NSCLC 晚期患者生命 5.2～6.9 個月，且較少發生化療常見的副作用，而隨之發生的皮膚毒性和非感染性發熱等副作用也較輕且易控制[42]。這一發現表明 DC-CIK 免疫治療與化學治療協同作用可以提供有效的全身抗腫瘤作用。此現象的原因可能為：① 化療后的細胞死亡可能對隨后的免疫應答產生影響。② 化療會耗盡調節性 T 細胞，從而增強免疫應答。③ 化療后免疫系統重組可以通過形成針對腫瘤抗原反應性的基因譜系來提供治療干預的獨特機會。④ 化療可能會改變細胞因子在 DC 上的表達來發揮其免疫潛能。因此，通過 DC-CIK 免疫可以減少不良反應，在整個抗腫瘤活動中起到關鍵作用。
Cui 等[43]通過延遲型超敏反應皮膚試驗來確定細胞免疫應答，以此評估 DC-CIK 聯合治療的臨床表現和安全性，研究表明接受 DC-CIK 聯合治療的患者延遲型超敏反應陽性率高于接受 DC 單獨治療的患者（P<0.01），且其主觀臨床表現也有改善，患者的耐受良好，輕度不良反應也均可通過相關治療得到緩解。DC-CIK 聯合治療在癌癥治療中表現為低毒性且患者對該方案的耐受性普遍良好，無嚴重副作用發生，因此該方案是一種前途廣闊的癌癥治療方案。
4.2 DC、CIK 細胞之間的相互作用
有研究顯示，DC、CIK 細胞之間會產生協同作用，共同培養會使 DC 表面共刺激分子表達增加，也會顯著提高其抗原遞呈能力，同時 CIK 細胞的增殖能力和細胞毒活性均得到加強，由此證明 DC-CIK 細胞較單獨的 CIK 細胞治療更為有效。發生此情況的原因可能是成熟 DC 表面的大量突起可呈遞腫瘤抗原至 CIK 細胞。除此之外，也可能是激活后的 DC 所分泌的細胞因子（如 IL-12、IL-18、干擾素-8 等）可以刺激 Th0、Th2 細胞分化為 Th1 細胞，引發 Th1 型特異性免疫應答，并經 MHCⅡ類分子呈遞外源性抗原被 CD8 細胞識別，引發免疫應答反應，且在此過程中可產生強烈的共刺激信號。Xie 等[44]研究發現將負載腫瘤裂解物的 DC 與 CIK、NK 細胞結合來治療肝臟未分化胚胎性肉瘤具有令人滿意的結果，所有的病例中腫瘤均得到了緩解，患者的生命也得到了延長，但無完全治愈病例。Jung 等[45]研究發現，DC-CIK 細胞聯合應用能夠顯著增加肝癌小鼠中細胞毒性 T 細胞的數量，而單獨 DC 或 CIK 治療對腫瘤細胞影響無統計學意義。
5 外泌體對 DC-CIK 細胞的誘導作用
5.1 參與腫瘤免疫逃逸
Chen 等[46]研究表明 TDE 通過下調 CD3+、CD8+、NK（CD56+）和 CD3+CD56+ 細胞以及分泌腫瘤壞死因子-α 和穿孔素來抑制 CIK 細胞的抗腫瘤活性，并且參與腫瘤的免疫逃逸。除此以外，TDE 可以抑制腫瘤的特異性免疫應答和免疫監視。Xiang 等[47]發現 TDE 可以引起腫瘤中骨髓來源的抑制細胞的積累，Yu 等[48]發現 TDE 來源的 IL-6 可以阻斷骨髓 DC 分化。這些內源性腫瘤衍生的外泌體抑制抗腫瘤免疫應答的確切機制仍有待充分證明，及由此可能產生的重要的新型治療靶點仍待研究。由于已有實質性證據表明 TDE 具有促進癌癥進展的功能，因此 TDE 可能成為癌癥診斷及預后監測的有效生物標志物。
5.2 參與腫瘤特異性免疫應答
腫瘤細胞來源外泌體既可幫助腫瘤細胞逃逸免疫監視，也可激活腫瘤特異性免疫應答。值得一提的是，TDE 內包含腫瘤特異性抗原，可以在體外產生 MHCⅠ類限制性 T 細胞克隆，且 TDE 可以在體內驅動依賴 T 細胞的交叉保護作用對抗同源和異源腫瘤[49]。因此可以利用外泌體來源的抗原預刺激 DC 進行靶向抗癌治療。腫瘤細胞所釋放的外泌體表面攜帶有 MHC 分子和抗原肽，可在體外誘導 DC-CIK 細胞，刺激產生特異性的抗瘤 T 細胞，并得到具有特異性和非特異性雙重抗瘤作用的 DC-CIK 細胞，對未來腫瘤的治療提供了一種不同以往的方法。外泌體可以增強 DC-CIK 的細胞毒活性，且其易于在體外培養，供體細胞若取交叉配血成功的健康個體的外周血，則獲得的 DC-CIK 細胞將具有更強的增殖活力，以此特異性地清除腫瘤細胞，增強患者的免疫力，從而達到殺瘤抑瘤的效果，為腫瘤過繼免疫治療的深入研究與臨床使用提供了全新的思路。
6 展望
過繼免疫療法具有極大的治療潛力，且有著極其廣闊的應用前景。目前應用腫瘤分泌外泌體誘導 DC-CIK 細胞分化已取得了初步成果，但仍存在許多急需解決的問題，如外泌體的分離方法、外泌體具體的作用機制、DC/CIK 細胞應用比例、DC/CIK 細胞分離方法及回輸途徑、DC-CIK 細胞培養最適條件等實際問題以及臨床療效評價等仍需進一步研究。相信隨著研究的進展，DC-CIK 療法將成為腫瘤免疫治療的有效方法，為腫瘤患者的診斷及治療帶來新的希望。