引用本文： 陳井陽, 王藝霖, 王霖, 劉潔. 人垂體瘤轉化基因 1 抑制卵巢癌 A2780 細胞凋亡的分子機制研究. 華西醫學, 2017, 32(11): 1734-1738. doi: 10.7507/1002-0179.201704187 復制
卵巢癌是婦科常見腫瘤之一。由于其自身特點，卵巢癌很難做到早期診斷和早期治療，導致其病死率較高，預后差。而細胞凋亡抑制是該腫瘤形成的關鍵[1]，因此，深入探究細胞凋亡和卵巢癌的關系有重要意義。人垂體瘤轉化基因 1（human pituitary tumor-transforming gene，hPTTG1）是近年發現與卵巢癌發生、發展密切相關的原癌基因[2-3]，并可作為該腫瘤基因治療的候選靶點[4-5]。生存素（survivin）是凋亡蛋白抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的特殊成員，既可通過阻抑經典的胱天蛋白酶（caspase）活化，也可通過促進細胞分裂而抑制細胞凋亡[6-7]。 survivin 異常表達導致的凋亡抑制和卵巢癌的發生發展、侵襲轉移及預后相關[8]。在不同的腫瘤組織、病理條件下 hPTTG1 對細胞凋亡有誘導和抑制的雙重作用[9-10]。本研究將 hPTTG1 小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染體外培養的卵巢癌 A2780 細胞株，觀察其對細胞凋亡的影響；探討 hPTTG1 與 survivin 在卵巢癌細胞凋亡調控中的作用和相互關系，為揭示卵巢癌的發生機制、尋找新的治療手段提供理論參考和實驗依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
1.1.1 主要試劑
細胞培養基、胎牛血清、胰酶購自美國 Gibco/BRL 公司；hPTTG1 siRNA、陰性對照 siRNA 及細胞凋亡 DNA 試劑盒購自德國 Qiagen 公司；逆轉錄試劑盒和陽離子脂質體轉染試劑購自美國 Invitrogen 公司；RNA 提取試劑、RNA 酶 H 和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒購自日本 Toyobo 公司；定量 PCR 配套的逆轉錄試劑盒和 SYBR 定量 PCR 試劑盒購自大連 TaKaRa 有限公司；hPTTG1 多克隆抗體、survivin 單克隆抗體、β-actin 抗體和增強型化學發光檢測試劑購自美國 Santa Cruz 公司；hPTTG1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）定量 PCR 引物，survivin 和 β-actin 引物由上海生工生物工程有限公司合成；相對分子質量標志物購自立陶宛 Fermentas 公司；辣根標記兔抗山羊免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G 購自中杉金橋生物有限公司；caspase-3 活性檢測試劑盒購自美國 R&D 公司。
1.1.2 儀器
Heraeus Hera Cell 150 二氧化碳細胞培養箱（德國 Kendro 公司）；細胞培養專用超凈工作臺（中國蘇州安泰空氣技術有限公司）；Sigma 3K-30 臺式低溫高速冷凍離心機（美國 Sigma 公司）；Eppendorf 5810R 高速冷凍離心機（德國 Eppendorf 公司）；ABI PE 9700 DNA 擴增儀、Prism 7500 Sequence Detection System 熒光實時定量 PCR 擴增儀（美國 ABI 公司）；Bio-Rad PowerPac 200 通用電泳電源儀、Bio-Rad Sub-Cell GT 水平電泳儀、Bio-Rad Mini-Protein Ⅲ 小型蛋白電泳系統、Bio-Rad Seimi-Dry 蛋白半干轉印系統（美國 Bio-Rad 公司）；自動封膜儀（中國江蘇儀器設備公司）；Imager 5500 電泳凝膠成像分析儀（美國 Alpha 公司）；Biosciences FACSCalibu r 流式細胞儀（美國 BD 公司）。
1.2 細胞培養及轉染
人卵巢癌細胞株 A2780 由中國醫學科學院腫瘤研究所提供。常規培養在含 10% 胎牛血清、1×105 U/L 青霉素及 100 mg/L 鏈霉素的 RPMI1640 培養基中，待細胞生長到 85% 匯聚時用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代。轉染前 24 h 用無血清、無抗生素的培養液接種細胞。hPPTG1 siRNA 靶序列：5’-AAG ACC TGC AAT AAT CCA GAA-3’，經 Blast 分析未見與其他任何人類基因存在同源性。首先參照 Lipofectamine 2000 操作說明，利用帶有熒光的陰性對照 siRNA（3’-AlexaFluor 488）優化轉染條件，熒光顯微鏡觀察轉染后熒光強度。以該條件進行轉染，分為轉染 hPPTG1 siRNA 的 hPTTG1 siRNA 干擾組、未轉染任何 siRNA 的正常組和轉染陰性對照 siRNA 的陰性對照組，轉染 48 h 后進行檢測。
1.3 實時 PCR 檢測 hPPTG1 基因 mRNA 表達
參照 TRIzol 試劑說明書提取各組細胞總 RNA，利用可除去基因組 DNA 的定量 PCR 專用反轉錄試劑盒合成互補 DNA（complementary DNA，cDNA）；使用 SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進行實時 PCR，反應條件：95℃ 30 s 預變性，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40 個循環。hPPTG1 和內參 GAPDH 基因引物見表 1。每個樣品設 3 個平行孔，經 3 次重復實驗，計算平均循環閾值（cycle threshold，Ct），以 2–ΔΔCt法計算實驗組與對照組 hPPTG1 相對表達量。
表1
引物序列表
1.4 DNA 梯形電泳
離心收集轉染后細胞，按照細胞凋亡 DNA Ladder 檢測試劑盒說明抽提細胞 DNA，乙醇沉淀后用加入 10 μL TE 緩沖液溶解 DNA，在該樣品中加入 2 μL 上樣緩沖液，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，自動電泳凝膠掃描分析系統觀察。
1.5 碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染法流式細胞儀檢測細胞凋亡
細胞先用不含乙二胺四乙酸的 0.25% 胰酶消化，離心收集；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 1 次，離心去除 PBS，加入預冷的 70% 乙醇 4℃ 固定 2 h；離心棄去固定液，3 mL PBS 重懸 5 min，400 目篩網過濾 1 次，800 r/min 離心 5 min，離心半徑 9.30 cm，棄去 PBS；用 1 mL PI 染液 4℃ 避光染色 30 min；流式細胞儀檢測。
1.6 逆轉錄-PCR 檢測 survivin 基因 mRNA 表達
在 GeneBank 中檢索基因序列，利用 Primer-Blast 在線設計引物，引物序列見表 1。參照 TRIzol 試劑說明書提取各組細胞總 RNA，利用 oligo（dT）20 引物和 SuperScriptTM Ⅲ 試劑盒逆轉錄成 cDNA，按照 KOD FX DNA polymerase 試劑盒說明書進行 PCR 擴增，反應條件為：94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，33 個循環，72℃ 5 min。PCR 產物經 2% 瓊脂糖電泳檢測，溴化乙錠染色后利用自動電泳凝膠掃描分析系統測定電泳條帶的積分密度值（integrated density value，IDV），實驗重復 3 次，取目的基因/β-actin IDV 平均值作為其 mRNA 表達水平的相對值。
1.7 蛋白質免疫法檢測 survivin 蛋白表達
提取細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳后，半干轉印到硝酸纖維素膜，5% 脫脂奶粉封閉 2 h 后，加入第一抗體（hPTTG1 1∶200，β-actin 1∶500）室溫孵育 2 h，含有吐溫-20 的 PBS 洗膜后加入 1∶5 000 稀釋的第二抗體孵育 1 h，洗膜后，增強化學發光法顯色曝光并通過 X 線膠片曝光洗片，經自動電泳凝膠分析系統掃描并測定雜交條帶 IDV，實驗重復 3 次，將 survivin IDV/β-actin IDV 平均值作為其蛋白表達水平的相對值。
1.8 caspase-3 活性測定
離心收集細胞，根據試劑盒說明書進行裂解，離心收集上清液，取 50 μL 細胞溶解液加入 50 μL 反應緩沖液（含 0.5 μL 二硫蘇糖醇）和 5 μL caspase-3 底物乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-頡氨酸-天冬氨酸-對硝基苯胺，37℃ 孵育 1 h，利用酶標儀在 405 nm 波長處測定吸光度值（A405 nm），實驗重復 3 次，取其平均值作為每組 caspase-3 的相對活性。
1.9 統計學方法
使用 SPSS 13.0 軟件進行統計分析。所有數據以均數±標準差來表示，組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hPTTG1 siRNA 的沉默效應檢測
以正常組 hPTTG1 基因表達平均值作為 1，陰性對照組 hPTTG1 基因表達相對水平為 0.95±0.02，hPTTG1 siRNA 干擾組 hPTTG1 基因表達相對水平為 0.29±0.04，是正常組 hPTTG1 基因表達水平的（28.72±3.56）%，與正常和陰性對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05），正常組和陰性對照組間hPTTG1 基因表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 DNA 瓊脂糖電泳
hPTTG1 siRNA 干擾組可見典型的 DNA 梯狀條形帶，正常及陰性對照組未檢測到明顯的梯形帶，表明轉染 hPTTG1 siRNA 可誘導 A2780 細胞凋亡。見圖 1。
圖1
各組細胞的 DNA ladder 檢測結果
M：100 bp DNA marker；1：正常組；2：陰性對照組；3：
2.3 細胞凋亡流式檢測結果
在流式細胞儀檢測到的 PI 熒光直方圖上，凋亡細胞在 G1/G0 期前出現一亞二倍體峰，正常組、陰性對照組、hPTTG1 siRNA 干擾組細胞凋亡率分別為（8.97±1.56）%、（9.64±1.31）%、（17.53± 2.17）%，hPTTG1 siRNA 干擾組細胞凋亡率高于正常和陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
各組細胞 PI 單染流式檢測結果
a. 正常組；b. 陰性對照組；c.
2.4 hPTTG1 siRNA 對 A2780 細胞中 survivin mRNA 和蛋白表達的影響
hPTTG1 siRNA 干擾組 survivin 在 mRNA 和蛋白水平表達均下調，hPTTG1 siRNA 干擾組 survivin mRNA 表達量為 0.39±0.11，低于正常組的 0.73±0.02 和陰性對照組的 0.65±0.07，差異有統計學意義（P<0.05）；hPTTG1 siRNA 干擾組 survivin 蛋白表達量為 0.41±0.05，低于正常組的 0.81±0.04 和陰性對照組的 0.72±0.01，差異有統計學意義（P<0.05），而正常組和陰性對照組間 mRNA 和蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3、4。
圖3
hPTTG1 siRNA 對 A2780 細胞 survivin mRNA 表達的影響
M：ФX174 DNA/
圖4
hPTTG1 siRNA 對 A2780 細胞 survivin 蛋白表達的影響
1：正常組；2：陰性對照組；3：
2.5 hPTTG1 siRNA 對 A2780 細胞中 caspase-3 活性的影響
hPTTG1 siRNA 干擾組 caspase-3 活性明顯增強，A405 nm 為 0.26±0.07，與正常組和陰性對照組 A405 nm 相比差異有統計學意義（P<0.05）；正常組A405 nm 為 0.13±0.03，陰性對照組 A405 nm 為 0.11±0.02，二者比較差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
hPTTG1 定位于人類染色體 5q33，全長 787 bp，含有 5 個外顯子和 4 個內含子，編碼由 202 個氨基酸殘基組成的相對分子質量為 22×103的分離素抑制蛋白（securin），以細胞周期依賴性方式表達。hPTTG1 亞細胞定位既可位于細胞核也可位于細胞質中[2]。hPTTG1 在胎兒肝臟、胸腺和睪丸組織中強表達，在結腸、小腸、腦、胎盤和胰腺中弱表達，在其他正常成人組織中表達極低甚至檢測不到。hPTTG1 是一種強腫瘤轉化基因，可通過調節細胞周期、干擾姊妹染色單體分離、調控細胞凋亡、反式激活及細胞轉化作用參與腫瘤進程，并與腫瘤的侵襲轉移等關系密切[11-12]。survivin 是 IAP 家族中的新成員，定位于 17q25 染色體，全長 15 kb，含 4 個外顯子和 3 個內含子，編碼含 142 個氨基酸、相對分子質量為 16.5×103 的蛋白質。survivin 主要表達于胚胎、發育的胎兒組織等分化不成熟組織，除在胸腺、胎盤、CD34+ 細胞、結腸基底上皮細胞、甲狀腺、生殖腺中微弱表達外，其在絕大多數正常成人組織和細胞中均無表達。survivin 可通過以下途徑抑制細胞凋亡[6-7]：① 介導原 caspase-3/P21 復合體的形成，抑制 caspase-3 的激活及其介導的細胞凋亡級聯反應；② 直接抑制 caspase-3、caspase-7 的激活和活性；③ 與 caspase-9 結合，抑制其激活下游效應 caspase；④ 與 Smac/DIABLO 結合，使其他 IAP 不受抑制，繼續發揮抗細胞凋亡的作用。survivin 在人類多種腫瘤中均高表達，并與腫瘤的病理分級、病情分期、患者預后、放射/化學治療效果等存在一定關系[13]。survivin 在正常卵巢組織中無表達，在惡性或交界性腫瘤中表達強度和陽性率明顯高于良性腫瘤，且同卵巢癌的臨床分期、組織學分型、p53 基因突變等反映卵巢癌不良預后的因素相關[14]，這提示其可通過抑制卵巢癌細胞凋亡而對卵巢癌的發展與侵襲起重要作用[15]。迄今為止，hPTTG1 和 survivin 在卵巢癌細胞凋亡中是否發生作用也未見報道。
本研究利用體外合成的 hPTTG1 siRNA 轉染 A2780 細胞，通過定量 PCR 檢測沉默效應，結果顯示 hPTTG1 siRNA 轉染后 A2780 細胞內 hPTTG1 基因表達水平顯著降低，下調了 72.3%，與正常組和陰性對照組間差異有統計學意義，這表明hPTTG1 siRNA 能高效特異地抑制該靶基因表達，實現基因沉默效應。隨后的 DNA 梯形電泳和流式細胞儀結果表明 hPTTG1 表達下調可誘導 A2780 細胞凋亡。對 survivin mRNA 和蛋白的檢測表明 hPTTG1 水平降低可引起 survivin 表達下調，提示 survivin 可能是 hPTTG1 下游的靶點，由于 survivin 具有凋亡抑制作用，其表達下調導致對細胞凋亡的抑制作用減弱，從而引起細胞凋亡增多。在細胞凋亡始動和發生階段，caspase 家族處于核心地位，其中 caspase-3 激活與細胞凋亡幾乎是同步，是哺乳動物凋亡中的關鍵蛋白酶。實驗結果顯示 hPTTG1 siRNA 干擾組 caspase-3 活性增強，因此，我們推測在卵巢癌中 hPTTG1 有凋亡抑制作用，主要通過上調下游凋亡抑制基因 survivin 表達，抑制 caspase-3 活化實現。siRNA 以其基因沉默的高度特異性、高效性和安全性，為卵巢癌的基因治療開辟了新途徑[16-17]。對 hPTTG1 在卵巢癌中的作用及調控機制的深入研究，將為該腫瘤的基因治療提供新思路。
卵巢癌是婦科常見腫瘤之一。由于其自身特點，卵巢癌很難做到早期診斷和早期治療，導致其病死率較高，預后差。而細胞凋亡抑制是該腫瘤形成的關鍵[1]，因此，深入探究細胞凋亡和卵巢癌的關系有重要意義。人垂體瘤轉化基因 1（human pituitary tumor-transforming gene，hPTTG1）是近年發現與卵巢癌發生、發展密切相關的原癌基因[2-3]，并可作為該腫瘤基因治療的候選靶點[4-5]。生存素（survivin）是凋亡蛋白抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的特殊成員，既可通過阻抑經典的胱天蛋白酶（caspase）活化，也可通過促進細胞分裂而抑制細胞凋亡[6-7]。 survivin 異常表達導致的凋亡抑制和卵巢癌的發生發展、侵襲轉移及預后相關[8]。在不同的腫瘤組織、病理條件下 hPTTG1 對細胞凋亡有誘導和抑制的雙重作用[9-10]。本研究將 hPTTG1 小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染體外培養的卵巢癌 A2780 細胞株，觀察其對細胞凋亡的影響；探討 hPTTG1 與 survivin 在卵巢癌細胞凋亡調控中的作用和相互關系，為揭示卵巢癌的發生機制、尋找新的治療手段提供理論參考和實驗依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
1.1.1 主要試劑
細胞培養基、胎牛血清、胰酶購自美國 Gibco/BRL 公司；hPTTG1 siRNA、陰性對照 siRNA 及細胞凋亡 DNA 試劑盒購自德國 Qiagen 公司；逆轉錄試劑盒和陽離子脂質體轉染試劑購自美國 Invitrogen 公司；RNA 提取試劑、RNA 酶 H 和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒購自日本 Toyobo 公司；定量 PCR 配套的逆轉錄試劑盒和 SYBR 定量 PCR 試劑盒購自大連 TaKaRa 有限公司；hPTTG1 多克隆抗體、survivin 單克隆抗體、β-actin 抗體和增強型化學發光檢測試劑購自美國 Santa Cruz 公司；hPTTG1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）定量 PCR 引物，survivin 和 β-actin 引物由上海生工生物工程有限公司合成；相對分子質量標志物購自立陶宛 Fermentas 公司；辣根標記兔抗山羊免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G 購自中杉金橋生物有限公司；caspase-3 活性檢測試劑盒購自美國 R&D 公司。
1.1.2 儀器
Heraeus Hera Cell 150 二氧化碳細胞培養箱（德國 Kendro 公司）；細胞培養專用超凈工作臺（中國蘇州安泰空氣技術有限公司）；Sigma 3K-30 臺式低溫高速冷凍離心機（美國 Sigma 公司）；Eppendorf 5810R 高速冷凍離心機（德國 Eppendorf 公司）；ABI PE 9700 DNA 擴增儀、Prism 7500 Sequence Detection System 熒光實時定量 PCR 擴增儀（美國 ABI 公司）；Bio-Rad PowerPac 200 通用電泳電源儀、Bio-Rad Sub-Cell GT 水平電泳儀、Bio-Rad Mini-Protein Ⅲ 小型蛋白電泳系統、Bio-Rad Seimi-Dry 蛋白半干轉印系統（美國 Bio-Rad 公司）；自動封膜儀（中國江蘇儀器設備公司）；Imager 5500 電泳凝膠成像分析儀（美國 Alpha 公司）；Biosciences FACSCalibu r 流式細胞儀（美國 BD 公司）。
1.2 細胞培養及轉染
人卵巢癌細胞株 A2780 由中國醫學科學院腫瘤研究所提供。常規培養在含 10% 胎牛血清、1×105 U/L 青霉素及 100 mg/L 鏈霉素的 RPMI1640 培養基中，待細胞生長到 85% 匯聚時用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代。轉染前 24 h 用無血清、無抗生素的培養液接種細胞。hPPTG1 siRNA 靶序列：5’-AAG ACC TGC AAT AAT CCA GAA-3’，經 Blast 分析未見與其他任何人類基因存在同源性。首先參照 Lipofectamine 2000 操作說明，利用帶有熒光的陰性對照 siRNA（3’-AlexaFluor 488）優化轉染條件，熒光顯微鏡觀察轉染后熒光強度。以該條件進行轉染，分為轉染 hPPTG1 siRNA 的 hPTTG1 siRNA 干擾組、未轉染任何 siRNA 的正常組和轉染陰性對照 siRNA 的陰性對照組，轉染 48 h 后進行檢測。
1.3 實時 PCR 檢測 hPPTG1 基因 mRNA 表達
參照 TRIzol 試劑說明書提取各組細胞總 RNA，利用可除去基因組 DNA 的定量 PCR 專用反轉錄試劑盒合成互補 DNA（complementary DNA，cDNA）；使用 SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進行實時 PCR，反應條件：95℃ 30 s 預變性，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40 個循環。hPPTG1 和內參 GAPDH 基因引物見表 1。每個樣品設 3 個平行孔，經 3 次重復實驗，計算平均循環閾值（cycle threshold，Ct），以 2–ΔΔCt法計算實驗組與對照組 hPPTG1 相對表達量。
表1
引物序列表
1.4 DNA 梯形電泳
離心收集轉染后細胞，按照細胞凋亡 DNA Ladder 檢測試劑盒說明抽提細胞 DNA，乙醇沉淀后用加入 10 μL TE 緩沖液溶解 DNA，在該樣品中加入 2 μL 上樣緩沖液，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，自動電泳凝膠掃描分析系統觀察。
1.5 碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染法流式細胞儀檢測細胞凋亡
細胞先用不含乙二胺四乙酸的 0.25% 胰酶消化，離心收集；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 1 次，離心去除 PBS，加入預冷的 70% 乙醇 4℃ 固定 2 h；離心棄去固定液，3 mL PBS 重懸 5 min，400 目篩網過濾 1 次，800 r/min 離心 5 min，離心半徑 9.30 cm，棄去 PBS；用 1 mL PI 染液 4℃ 避光染色 30 min；流式細胞儀檢測。
1.6 逆轉錄-PCR 檢測 survivin 基因 mRNA 表達
在 GeneBank 中檢索基因序列，利用 Primer-Blast 在線設計引物，引物序列見表 1。參照 TRIzol 試劑說明書提取各組細胞總 RNA，利用 oligo（dT）20 引物和 SuperScriptTM Ⅲ 試劑盒逆轉錄成 cDNA，按照 KOD FX DNA polymerase 試劑盒說明書進行 PCR 擴增，反應條件為：94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，33 個循環，72℃ 5 min。PCR 產物經 2% 瓊脂糖電泳檢測，溴化乙錠染色后利用自動電泳凝膠掃描分析系統測定電泳條帶的積分密度值（integrated density value，IDV），實驗重復 3 次，取目的基因/β-actin IDV 平均值作為其 mRNA 表達水平的相對值。
1.7 蛋白質免疫法檢測 survivin 蛋白表達
提取細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳后，半干轉印到硝酸纖維素膜，5% 脫脂奶粉封閉 2 h 后，加入第一抗體（hPTTG1 1∶200，β-actin 1∶500）室溫孵育 2 h，含有吐溫-20 的 PBS 洗膜后加入 1∶5 000 稀釋的第二抗體孵育 1 h，洗膜后，增強化學發光法顯色曝光并通過 X 線膠片曝光洗片，經自動電泳凝膠分析系統掃描并測定雜交條帶 IDV，實驗重復 3 次，將 survivin IDV/β-actin IDV 平均值作為其蛋白表達水平的相對值。
1.8 caspase-3 活性測定
離心收集細胞，根據試劑盒說明書進行裂解，離心收集上清液，取 50 μL 細胞溶解液加入 50 μL 反應緩沖液（含 0.5 μL 二硫蘇糖醇）和 5 μL caspase-3 底物乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-頡氨酸-天冬氨酸-對硝基苯胺，37℃ 孵育 1 h，利用酶標儀在 405 nm 波長處測定吸光度值（A405 nm），實驗重復 3 次，取其平均值作為每組 caspase-3 的相對活性。
1.9 統計學方法
使用 SPSS 13.0 軟件進行統計分析。所有數據以均數±標準差來表示，組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hPTTG1 siRNA 的沉默效應檢測
以正常組 hPTTG1 基因表達平均值作為 1，陰性對照組 hPTTG1 基因表達相對水平為 0.95±0.02，hPTTG1 siRNA 干擾組 hPTTG1 基因表達相對水平為 0.29±0.04，是正常組 hPTTG1 基因表達水平的（28.72±3.56）%，與正常和陰性對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05），正常組和陰性對照組間hPTTG1 基因表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 DNA 瓊脂糖電泳
hPTTG1 siRNA 干擾組可見典型的 DNA 梯狀條形帶，正常及陰性對照組未檢測到明顯的梯形帶，表明轉染 hPTTG1 siRNA 可誘導 A2780 細胞凋亡。見圖 1。
圖1
各組細胞的 DNA ladder 檢測結果
M：100 bp DNA marker；1：正常組；2：陰性對照組；3：
2.3 細胞凋亡流式檢測結果
在流式細胞儀檢測到的 PI 熒光直方圖上，凋亡細胞在 G1/G0 期前出現一亞二倍體峰，正常組、陰性對照組、hPTTG1 siRNA 干擾組細胞凋亡率分別為（8.97±1.56）%、（9.64±1.31）%、（17.53± 2.17）%，hPTTG1 siRNA 干擾組細胞凋亡率高于正常和陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
各組細胞 PI 單染流式檢測結果
a. 正常組；b. 陰性對照組；c.
2.4 hPTTG1 siRNA 對 A2780 細胞中 survivin mRNA 和蛋白表達的影響
hPTTG1 siRNA 干擾組 survivin 在 mRNA 和蛋白水平表達均下調，hPTTG1 siRNA 干擾組 survivin mRNA 表達量為 0.39±0.11，低于正常組的 0.73±0.02 和陰性對照組的 0.65±0.07，差異有統計學意義（P<0.05）；hPTTG1 siRNA 干擾組 survivin 蛋白表達量為 0.41±0.05，低于正常組的 0.81±0.04 和陰性對照組的 0.72±0.01，差異有統計學意義（P<0.05），而正常組和陰性對照組間 mRNA 和蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3、4。
圖3
hPTTG1 siRNA 對 A2780 細胞 survivin mRNA 表達的影響
M：ФX174 DNA/
圖4
hPTTG1 siRNA 對 A2780 細胞 survivin 蛋白表達的影響
1：正常組；2：陰性對照組；3：
2.5 hPTTG1 siRNA 對 A2780 細胞中 caspase-3 活性的影響
hPTTG1 siRNA 干擾組 caspase-3 活性明顯增強，A405 nm 為 0.26±0.07，與正常組和陰性對照組 A405 nm 相比差異有統計學意義（P<0.05）；正常組A405 nm 為 0.13±0.03，陰性對照組 A405 nm 為 0.11±0.02，二者比較差異無統計學意義（P>0.05）。
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hPTTG1 定位于人類染色體 5q33，全長 787 bp，含有 5 個外顯子和 4 個內含子，編碼由 202 個氨基酸殘基組成的相對分子質量為 22×103的分離素抑制蛋白（securin），以細胞周期依賴性方式表達。hPTTG1 亞細胞定位既可位于細胞核也可位于細胞質中[2]。hPTTG1 在胎兒肝臟、胸腺和睪丸組織中強表達，在結腸、小腸、腦、胎盤和胰腺中弱表達，在其他正常成人組織中表達極低甚至檢測不到。hPTTG1 是一種強腫瘤轉化基因，可通過調節細胞周期、干擾姊妹染色單體分離、調控細胞凋亡、反式激活及細胞轉化作用參與腫瘤進程，并與腫瘤的侵襲轉移等關系密切[11-12]。survivin 是 IAP 家族中的新成員，定位于 17q25 染色體，全長 15 kb，含 4 個外顯子和 3 個內含子，編碼含 142 個氨基酸、相對分子質量為 16.5×103 的蛋白質。survivin 主要表達于胚胎、發育的胎兒組織等分化不成熟組織，除在胸腺、胎盤、CD34+ 細胞、結腸基底上皮細胞、甲狀腺、生殖腺中微弱表達外，其在絕大多數正常成人組織和細胞中均無表達。survivin 可通過以下途徑抑制細胞凋亡[6-7]：① 介導原 caspase-3/P21 復合體的形成，抑制 caspase-3 的激活及其介導的細胞凋亡級聯反應；② 直接抑制 caspase-3、caspase-7 的激活和活性；③ 與 caspase-9 結合，抑制其激活下游效應 caspase；④ 與 Smac/DIABLO 結合，使其他 IAP 不受抑制，繼續發揮抗細胞凋亡的作用。survivin 在人類多種腫瘤中均高表達，并與腫瘤的病理分級、病情分期、患者預后、放射/化學治療效果等存在一定關系[13]。survivin 在正常卵巢組織中無表達，在惡性或交界性腫瘤中表達強度和陽性率明顯高于良性腫瘤，且同卵巢癌的臨床分期、組織學分型、p53 基因突變等反映卵巢癌不良預后的因素相關[14]，這提示其可通過抑制卵巢癌細胞凋亡而對卵巢癌的發展與侵襲起重要作用[15]。迄今為止，hPTTG1 和 survivin 在卵巢癌細胞凋亡中是否發生作用也未見報道。
本研究利用體外合成的 hPTTG1 siRNA 轉染 A2780 細胞，通過定量 PCR 檢測沉默效應，結果顯示 hPTTG1 siRNA 轉染后 A2780 細胞內 hPTTG1 基因表達水平顯著降低，下調了 72.3%，與正常組和陰性對照組間差異有統計學意義，這表明hPTTG1 siRNA 能高效特異地抑制該靶基因表達，實現基因沉默效應。隨后的 DNA 梯形電泳和流式細胞儀結果表明 hPTTG1 表達下調可誘導 A2780 細胞凋亡。對 survivin mRNA 和蛋白的檢測表明 hPTTG1 水平降低可引起 survivin 表達下調，提示 survivin 可能是 hPTTG1 下游的靶點，由于 survivin 具有凋亡抑制作用，其表達下調導致對細胞凋亡的抑制作用減弱，從而引起細胞凋亡增多。在細胞凋亡始動和發生階段，caspase 家族處于核心地位，其中 caspase-3 激活與細胞凋亡幾乎是同步，是哺乳動物凋亡中的關鍵蛋白酶。實驗結果顯示 hPTTG1 siRNA 干擾組 caspase-3 活性增強，因此，我們推測在卵巢癌中 hPTTG1 有凋亡抑制作用，主要通過上調下游凋亡抑制基因 survivin 表達，抑制 caspase-3 活化實現。siRNA 以其基因沉默的高度特異性、高效性和安全性，為卵巢癌的基因治療開辟了新途徑[16-17]。對 hPTTG1 在卵巢癌中的作用及調控機制的深入研究，將為該腫瘤的基因治療提供新思路。
