引用本文： 王丹, 張忠提, 王振華. 片仔癀聯合多西他賽對舌鱗狀細胞癌細胞生長及凋亡的影響. 華西醫學, 2017, 32(6): 880-882. doi: 10.7507/1002-0179.201704054 復制
目前，舌鱗狀細胞癌（鱗癌）的治療以手術為主，輔以化學治療（化療）、放射治療（放療）的綜合療法，中晚期舌鱗癌 5 年生存率較低。手術會造成患者頭面部外貌改變，可引起說話、吞咽等功能障礙，影響生活質量[1]。化療藥物則存在較大的毒副作用，在治療時可考慮采用能在一定程度上有效控制癌細胞的擴散和轉移、提高患者免疫力、減輕化療藥物毒副作用的中草藥進行輔助治療。多西他賽可阻滯腫瘤細胞有絲分裂，誘導細胞凋亡，對頭頸部腫瘤、肺癌、胃癌等有良好的治療效果[2-4]。片仔癀除可清熱解毒、消腫止痛、活血化瘀外，對結腸癌、卵巢癌、神經母細胞瘤、骨肉瘤等腫瘤增殖有一定抑制作用[5-7]。本研究擬探討片仔癀聯合多西他賽對舌鱗癌細胞 Tca8113 細胞生長、凋亡及細胞周期的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
人舌鱗癌細胞株 Tca8113 購自中國科學院上海細胞生物學研究所。片仔癀（漳州片仔癀藥業股份有限公司）；多西他賽（山東齊魯制藥有限公司）；洛斯維·帕克紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）-1640 細胞培養基（美國 Gibco 公司）；AnnexinV-FITC 試劑盒（北京寶賽生物技術有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養方法 Tca8113 細胞為貼壁生長，用含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 RPMI-1640 培養液，置于 37℃、5% 二氧化碳飽和濕度細胞培養箱中培養。取對數生長期的 Tca8113 細胞用于實驗，設對照組、片仔癀單藥組（450 μg/mL）、多西他賽單藥組（0.01 μg/L）及片仔癀和多西他賽兩藥聯合用藥組。
1.2.2 流式細胞儀碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色對細胞周期的檢測方法 將各實驗組的 Tca8113 細胞接種于 6 孔培養板，培養 48 h 后收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗，2 000 r/min 離心 5 min（離心半徑為 10.5 cm），細胞加預冷的 70% 乙醇于 –20℃ 固定，離心收集細胞，PBS 漂洗除去乙醇，用 500 μL PBS 重懸細胞，加入核糖核酸酶 A（終濃度為 0.25 mg/mL）和 5 μL PI 染液，避光孵育 30 min，用流式細胞儀進行檢測。
1.2.3 流式細胞儀對細胞凋亡的檢測方法 把各實驗組細胞接種于 6 孔培養板中培養 48 h，收集細胞，PBS 洗滌細胞 2 次，加入 10 μL 的 Annexin Ⅴ，室溫避光 15 min，加入 10 μL PI，室溫避光 15 min，用流式細胞儀進行檢測。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 13.0 統計軟件進行統計分析。實驗數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用 LSD-t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 片仔癀與多西他賽聯合用藥后 Tca8113 細胞形態的變化
倒置顯微鏡下觀察，對照組細胞狀態良好，貼壁生長，呈多角形且體積較大，細胞之間生長緊密（圖 1a）。單獨使用 450 μg/mL 的片仔癀或 0.01 μg/L 的多西他賽 48 h 后，可見部分細胞體積變小，形態變圓而鈍，細胞間連接變稀疏，細胞內可出現空泡和顆粒（圖 1b、1c）。聯合用藥組的細胞全面皺縮，細胞呈圓形且出現部分細胞破碎（圖 1d）。
圖1
倒置顯微鏡觀察各組 Tca8113 細胞形態的變化（×200）
2.2 片仔癀與多西他賽聯合用藥對Tca8113細胞周期的影響
PI 染色檢測結果顯示，與對照組相比，單獨使用片仔癀時細胞周期在 G0/G1 期發生阻滯，S 期比率下降（P<0.01）。單獨使用多西他賽時細胞周期阻滯于 G2/M 期，顯著高于對照組，S 期比率亦顯著下降（P<0.01）。兩藥聯合使用后細胞周期在 G0/G1 期和 G2/M 期均發生阻滯，與片仔癀單藥組相比，G2/M 期比率顯著增加；與多西他賽單藥組相比，G0/G1 期比率顯著增加（P<0.01）。見表 1。
表1
各組用藥后 Tca8113 細胞周期的變化（
）
2.3 片仔癀與多西他賽聯合用藥對 Tca8113 細胞凋亡的影響
Annexin-Ⅴ/PI 雙染實驗結果顯示，片仔癀單藥組和多西他賽單藥組與對照組相比均顯著促進細胞凋亡（P<0.01）；兩藥聯合應用時，其凋亡率較兩藥單獨應用時均顯著升高（P<0.01）。見圖 2、3。
圖2
各組不同用藥對 Tca8113 細胞凋亡的影響
圖3
各組不同用藥對 Tca8113 細胞凋亡的影響
3 討論
Ⅰ～Ⅱ期早期高分化舌癌患者可行手術或放療，Ⅲ～Ⅳ期晚期舌癌患者為預防術后復發及遠處轉移，治療方案以手術為主，輔以中草藥配合的綜合治療。化療有助于縮小腫瘤，適合懷疑有切除不徹底或遠處轉移的患者，可提高其生存率和治愈率，但化療藥物有較嚴重的誘發中性粒細胞減少、脫發、惡心嘔吐等不良反應。在癌癥的藥物治療中，常輔以中草藥和西藥配合增加療效，減少化療藥物的副作用。片仔癀屬于清熱劑的中成藥，可通過下調血管內皮生長因子-C 抑制結腸癌細胞的轉移[8]；下調蛋白激酶 B 和雷帕霉素靶蛋白磷酸化表達，抑制卵巢癌細胞增殖，阻滯細胞周期進程[9]；通過抑制白細胞介素-6/信號傳導與轉錄激活因子 3 信號通路抑制結腸癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡[10]。多西他賽為紫杉醇類的代表藥物，通過促進微管雙聚體組裝成微管，又可防止去多聚化過程，抑制微管的解聚進而使微管穩定。微管蛋白二聚體可維持細胞形態，在細胞分裂期微管蛋白解聚形成紡錘體，有利于細胞分裂；多西他賽通過干擾微管蛋白解聚，抑制其分解，阻斷細胞分裂周期中的 G2期和 M 期，導致細胞死亡，抑制腫瘤細胞生長[11]。
本研究中，多西他賽單藥組 G2/M 比值較對照組顯著增加，說明 G2/M 期細胞增多，細胞阻滯于 G2/M 期，促進細胞走向凋亡；片仔癀單藥組 G0/G1 期比率較對照組顯著增加，S 期細胞比率下降，說明片仔癀可使細胞周期阻滯于 G0/G1 期。兩藥合用后對 Tca8113 細胞 G0/G1 期和 G2/M 期均有阻滯作用，協同增強了藥物對腫瘤細胞周期進程的抑制作用。倒置顯微鏡下亦觀察到片仔癀與多西他賽聯用誘發細胞呈凋亡樣改變，細胞密度明顯下降。且兩藥聯合應用上調了 Tca8113 細胞的凋亡比率。
綜上，片仔癀與多西他賽聯合使用可抑制舌鱗癌細胞生長并促進細胞凋亡。
目前，舌鱗狀細胞癌（鱗癌）的治療以手術為主，輔以化學治療（化療）、放射治療（放療）的綜合療法，中晚期舌鱗癌 5 年生存率較低。手術會造成患者頭面部外貌改變，可引起說話、吞咽等功能障礙，影響生活質量[1]。化療藥物則存在較大的毒副作用，在治療時可考慮采用能在一定程度上有效控制癌細胞的擴散和轉移、提高患者免疫力、減輕化療藥物毒副作用的中草藥進行輔助治療。多西他賽可阻滯腫瘤細胞有絲分裂，誘導細胞凋亡，對頭頸部腫瘤、肺癌、胃癌等有良好的治療效果[2-4]。片仔癀除可清熱解毒、消腫止痛、活血化瘀外，對結腸癌、卵巢癌、神經母細胞瘤、骨肉瘤等腫瘤增殖有一定抑制作用[5-7]。本研究擬探討片仔癀聯合多西他賽對舌鱗癌細胞 Tca8113 細胞生長、凋亡及細胞周期的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
人舌鱗癌細胞株 Tca8113 購自中國科學院上海細胞生物學研究所。片仔癀（漳州片仔癀藥業股份有限公司）；多西他賽（山東齊魯制藥有限公司）；洛斯維·帕克紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）-1640 細胞培養基（美國 Gibco 公司）；AnnexinV-FITC 試劑盒（北京寶賽生物技術有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養方法 Tca8113 細胞為貼壁生長，用含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 RPMI-1640 培養液，置于 37℃、5% 二氧化碳飽和濕度細胞培養箱中培養。取對數生長期的 Tca8113 細胞用于實驗，設對照組、片仔癀單藥組（450 μg/mL）、多西他賽單藥組（0.01 μg/L）及片仔癀和多西他賽兩藥聯合用藥組。
1.2.2 流式細胞儀碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色對細胞周期的檢測方法 將各實驗組的 Tca8113 細胞接種于 6 孔培養板，培養 48 h 后收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗，2 000 r/min 離心 5 min（離心半徑為 10.5 cm），細胞加預冷的 70% 乙醇于 –20℃ 固定，離心收集細胞，PBS 漂洗除去乙醇，用 500 μL PBS 重懸細胞，加入核糖核酸酶 A（終濃度為 0.25 mg/mL）和 5 μL PI 染液，避光孵育 30 min，用流式細胞儀進行檢測。
1.2.3 流式細胞儀對細胞凋亡的檢測方法 把各實驗組細胞接種于 6 孔培養板中培養 48 h，收集細胞，PBS 洗滌細胞 2 次，加入 10 μL 的 Annexin Ⅴ，室溫避光 15 min，加入 10 μL PI，室溫避光 15 min，用流式細胞儀進行檢測。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 13.0 統計軟件進行統計分析。實驗數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用 LSD-t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 片仔癀與多西他賽聯合用藥后 Tca8113 細胞形態的變化
倒置顯微鏡下觀察，對照組細胞狀態良好，貼壁生長，呈多角形且體積較大，細胞之間生長緊密（圖 1a）。單獨使用 450 μg/mL 的片仔癀或 0.01 μg/L 的多西他賽 48 h 后，可見部分細胞體積變小，形態變圓而鈍，細胞間連接變稀疏，細胞內可出現空泡和顆粒（圖 1b、1c）。聯合用藥組的細胞全面皺縮，細胞呈圓形且出現部分細胞破碎（圖 1d）。
圖1
倒置顯微鏡觀察各組 Tca8113 細胞形態的變化（×200）
2.2 片仔癀與多西他賽聯合用藥對Tca8113細胞周期的影響
PI 染色檢測結果顯示，與對照組相比，單獨使用片仔癀時細胞周期在 G0/G1 期發生阻滯，S 期比率下降（P<0.01）。單獨使用多西他賽時細胞周期阻滯于 G2/M 期，顯著高于對照組，S 期比率亦顯著下降（P<0.01）。兩藥聯合使用后細胞周期在 G0/G1 期和 G2/M 期均發生阻滯，與片仔癀單藥組相比，G2/M 期比率顯著增加；與多西他賽單藥組相比，G0/G1 期比率顯著增加（P<0.01）。見表 1。
表1
各組用藥后 Tca8113 細胞周期的變化（
）
2.3 片仔癀與多西他賽聯合用藥對 Tca8113 細胞凋亡的影響
Annexin-Ⅴ/PI 雙染實驗結果顯示，片仔癀單藥組和多西他賽單藥組與對照組相比均顯著促進細胞凋亡（P<0.01）；兩藥聯合應用時，其凋亡率較兩藥單獨應用時均顯著升高（P<0.01）。見圖 2、3。
圖2
各組不同用藥對 Tca8113 細胞凋亡的影響
圖3
各組不同用藥對 Tca8113 細胞凋亡的影響
3 討論
Ⅰ～Ⅱ期早期高分化舌癌患者可行手術或放療，Ⅲ～Ⅳ期晚期舌癌患者為預防術后復發及遠處轉移，治療方案以手術為主，輔以中草藥配合的綜合治療。化療有助于縮小腫瘤，適合懷疑有切除不徹底或遠處轉移的患者，可提高其生存率和治愈率，但化療藥物有較嚴重的誘發中性粒細胞減少、脫發、惡心嘔吐等不良反應。在癌癥的藥物治療中，常輔以中草藥和西藥配合增加療效，減少化療藥物的副作用。片仔癀屬于清熱劑的中成藥，可通過下調血管內皮生長因子-C 抑制結腸癌細胞的轉移[8]；下調蛋白激酶 B 和雷帕霉素靶蛋白磷酸化表達，抑制卵巢癌細胞增殖，阻滯細胞周期進程[9]；通過抑制白細胞介素-6/信號傳導與轉錄激活因子 3 信號通路抑制結腸癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡[10]。多西他賽為紫杉醇類的代表藥物，通過促進微管雙聚體組裝成微管，又可防止去多聚化過程，抑制微管的解聚進而使微管穩定。微管蛋白二聚體可維持細胞形態，在細胞分裂期微管蛋白解聚形成紡錘體，有利于細胞分裂；多西他賽通過干擾微管蛋白解聚，抑制其分解，阻斷細胞分裂周期中的 G2期和 M 期，導致細胞死亡，抑制腫瘤細胞生長[11]。
本研究中，多西他賽單藥組 G2/M 比值較對照組顯著增加，說明 G2/M 期細胞增多，細胞阻滯于 G2/M 期，促進細胞走向凋亡；片仔癀單藥組 G0/G1 期比率較對照組顯著增加，S 期細胞比率下降，說明片仔癀可使細胞周期阻滯于 G0/G1 期。兩藥合用后對 Tca8113 細胞 G0/G1 期和 G2/M 期均有阻滯作用，協同增強了藥物對腫瘤細胞周期進程的抑制作用。倒置顯微鏡下亦觀察到片仔癀與多西他賽聯用誘發細胞呈凋亡樣改變，細胞密度明顯下降。且兩藥聯合應用上調了 Tca8113 細胞的凋亡比率。
綜上，片仔癀與多西他賽聯合使用可抑制舌鱗癌細胞生長并促進細胞凋亡。
