引用本文： 倪小蔚, 江英, 唐玥玓. 頭頸部惡性腫瘤中轉鐵蛋白受體 1 的表達情況及意義. 華西醫學, 2017, 32(11): 1726-1729. doi: 10.7507/1002-0179.201703181 復制
近年，腫瘤的發病率與死亡率逐年升高。喉癌、甲狀腺癌、上頜竇癌、腮腺癌是頭頸部惡性腫瘤中患病率較高的幾類，嚴重威脅著人類的健康，探尋其新的治療方法具有十分重要的意義。研究發現，轉鐵蛋白及轉鐵蛋白受體（transferrin receptor 1，TfR）在人體內負責鐵的轉運[1]，參與了大部分的代謝活動，而 TfR 在細胞增殖中發揮著重要作用，在快速增殖的腫瘤細胞中更是如此。然而，在腫瘤的發生過程中，分子水平的改變遠遠早于形態學的改變，本研究通過檢測 TfR1 在以上 4 種頭頸部惡性腫瘤的癌組織及癌旁正常組織中的表達水平，探討 TfR1 在頭頸部惡性腫瘤的發生、發展中可能的作用。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 一般資料
選取本院 2015 年 4 月—2017 年 3 月病理確診的原發喉癌、甲狀腺癌、上頜竇癌、腮腺癌患者的新鮮組織標本，標本采集后即送至液氮中保存。標本分別取材于以上 4 種腫瘤的腫瘤中心、癌旁正常組織（距腫瘤邊緣 5 mm 以上）。本研究共收集頭頸部惡性腫瘤患者 24 例，其中男 14 例，女 10 例；年齡（58.67±11.94）歲。喉癌組患者 8 例，年齡（59.50±8.64）歲。甲狀腺癌組患者 8 例，年齡（50.75±12.57）歲。上頜竇癌組患者 4 例，年齡（64.50±13.18）歲。腮腺癌組患者 4 例，年齡（67.00±8.41）歲。24 例頭頸部惡性腫瘤中，16 例有淋巴結轉移。所有標本均經病理醫師復查，確診無誤。實驗程序符合四川大學華西醫院生物醫學倫理分委會所定制的倫理學標準并得到該委員會的批準，獲得受試對象的知情同意。
1.2 實驗方法
1.2.1 熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術檢測 TfR1 的 mRNA 表達
按照 Trizol 試劑盒（美國 Invitrogin 公司，批號：50563209）的操作說明提取制備手術取材組織的總 RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的質量。提取總 RNA，采用隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成互補 DNA（complementary DNA，cDNA）。采用立陶宛 Fermentas 公司的 Revert AidTM Frist Strand cDNA Synthesis Kit，在 PCR 儀上進行擴增。在引物設計網站（www.ncbi.nlm.nih.gov）設計出TfR1 的擴增引物。上游引物：5′-CAG CAT TCT CTA ACT TGT TTG-3′；下游引物：5′-GTT TCA TCT CCA CAT GAC TGT-3′。擴增條件：94℃ 2 min，94℃ 20 s，52℃ 20 s，60℃ 30 s，共 45 個循環；擴增片段大小約 99 bp。用 β-actin 作為內對照以檢驗 cDNA 的質量以及整個 PCR 操作過程無誤。PCR 產物于 1% 瓊脂糖膠上電泳，凝膠成像系統成像，測定出條帶的吸光度積分，用 TfR1 與 ACTB（β-actin 的基因名）吸光度積分的比值代表 TfR1 的半定量值。
1.2.2 蛋白質印跡法檢測 TfR1 的蛋白表達
取 30 mg 標本組織進行碾磨直至成為細小粉末，加一定量的蛋白裂解液，用槍尖吹打混勻后置于冰上。于 4℃ 下 12 000 r/min 離心 5 min 后收集上清液 20 μL 進行分裝，使用 BCA 蛋白濃度試劑盒（碧云天生物技術研究所）測定樣品蛋白總濃度，根據蛋白量的大小選取適當的分離膠 3.5 mL，制好膠后上樣，經聚丙烯酰胺凝膠電泳（先 80 V，120 min；再 120 V，50 min），取出膠在轉移緩沖液中平衡 10 min 后進行轉膜。洗膜后與抗體結合，加底物曝光顯示目的條帶，Quantity One 分析軟件分析蛋白灰度值，計算目的蛋白相對表達量。
1.3 統計學方法
所有實驗數據均采用 SPSS 19.0 軟件進行結果處理分析。采用均數±標準差描述資料特征，采用配對 t 檢驗比較癌組織與癌旁組織間的差別，采用方差分析檢驗不同腫瘤類型間的均數差別，采用成組 t 檢驗比較有無淋巴結轉移的患者間的差別。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 TfR1 mRNA 水平表達情況
從標本組織中取得的 RNA，經電泳觀察未見 DNA 污染及 RNA 降解。實驗中以 TfR1 的特異性引物進行熒光定量 PCR，并獲得目的片段（長度 99 bp）與內參照 ACTB（長度 111 bp）在同一實驗條件下進行擴增。 TfR1 的凝膠電泳結果見圖 1。24 例頭頸部惡性腫瘤患者中，癌組織及癌旁組織均表達 TfR1，其中癌組織的相對表達量均高于其癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P<0.05）。4 種惡性腫瘤的癌組織之間及癌旁組織之間差異均無統計學意義（P>0.05）。有淋巴結轉移的患者其癌組織中TfR1 mRNA 的相對表達量高于無淋巴結轉移的患者（P<0.05）。見表 1、2。
圖1
4 種頭頸部惡性腫瘤癌組織中 TfR1 mRNA 表達水平的電泳圖
表1
不同部位 TfR1 的 mRNA 相對表達水平（
）
表2
有無淋巴結轉移的患者 TfR1 的 mRNA 相對表達水平（
）
2.2 TfR1 蛋白水平表達情況
每類腫瘤的癌組織與癌旁組織中 TfR1 蛋白表達水平差異均具有統計學意義（P<0.05）；4 種惡性腫瘤的癌組織之間 TfR1 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。有淋巴結轉移的患者的 TfR1 蛋白的相對表達量高于無淋巴結轉移的患者，二者間差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3、4。
表3
不同部位 TfR1 的蛋白相對表達水平（
）
表4
有無淋巴結轉移的患者 TfR1 的蛋白相對表達水平（
）
3 討論
TfR 作為腫瘤相關基因研究的熱點之一而倍受關注。TfR1 是一種廣泛存在于人體細胞中的 Ⅱ 型跨膜糖蛋白[2]。它由 2 個同源二聚體的亞基通過 2 條二硫鍵交聯而成，2 個亞基的每個單體（含 760 個氨基酸，相對分子質量為 90×103～95×103）包含 1 個大的細胞外 C 端區域（671 個氨基酸）、1 個單跨膜區域（包含 28 個氨基酸）及 1 個短的 N 端區域（包含 61 個氨基酸）[3-4]。每個單體都包含 1 個轉鐵蛋白結合位點，該位點與轉鐵蛋白結合后能介導鐵元素的轉運，此途徑是細胞攝取鐵元素的重要途徑[5]。
本研究通過應用熒光定量 PCR 技術及蛋白質印跡技術對喉癌、甲狀腺癌、上頜竇癌、腮腺癌中 TfR1 在 mRNA 水平及蛋白水平的表達情況分別進行比較，首先明確 TfR1 分別在頭頸部 4 種惡性腫瘤的基因及蛋白水平表達情況，進一步分析 TfR1 在 4 種惡性腫瘤的癌組織之間的基因及蛋白水平表達情況。結果顯示，4 種腫瘤癌組織中與癌旁正常組織中的 TfR1 在基因水平及蛋白水平均有表達，但二者無論是 mRNA 水平還是蛋白水平表達存在明顯的表達水平差異。在兩種技術中，頭頸部惡性腫瘤的癌組織 TfR1 的相對表達量均高于其癌旁正常組織，這一結果可能提示增殖活躍的腫瘤細胞為滿足增殖的需求，對鐵的需求量相較正常黏膜組織或細胞明顯增高。在本研究中，每例癌組織與癌旁組織均來自同一患者，排除了其他疾病對 TfR1 表達量檢測結果的影響。本研究發現有淋巴結轉移的腫瘤細胞中 TfR1 的相對表達量更高，有淋巴結轉移的惡性腫瘤，通常臨床分期更高、惡性程度更高、腫瘤生長更快，這提示我們鐵代謝、TfR1 的分布與腫瘤的增殖可能呈一定的正相關關系。最后，4 種惡性腫瘤的癌組織之間差異無統計學意義。這一結果提示 4 種常見的頭頸部惡性腫瘤癌組織之間的 TfR1 表達無統計學差異，提示我們 TfR1 在這 4 種頭頸部惡性腫瘤中可能發揮著相似的作用。
TfR 在細胞中的主要作用包括轉運金屬離子、作為藥物運輸的載體以及參與細胞調節等。TfR 在鐵的轉運中具有重要的作用，根據環境 pH 值的改變，TfR 的構象會隨之發生改變，影響對鐵的攝取，從而促進細胞死亡[6-7]。陳舒華等[8]曾對鼻咽癌患者與正常對照進行比較，其發現，鼻咽癌患者的細胞鼻咽上皮黏膜中 TfR 的表達增加，提示其可能與腫瘤大量攝取鐵有關，從而影響腫瘤的發展。有研究發現，TfR 在某些腫瘤細胞中的表達顯著高于其他腫瘤細胞，如乳腺癌細胞[9]、肝癌細胞[10]、白血病細胞[11]。本次研究的結果與以往這些學者的研究結果相符，因此，我們認為在頭頸部 4 種惡性腫瘤組織中，TfR1 的 mRNA 與蛋白的過度表達與這 4 種頭頸部惡性腫瘤的發生、發展相關。
一方面，正如本組研究結果所示，腫瘤細胞中 TfR 的含量更為豐富，其高表達可能就是為了滿足腫瘤細胞的增殖需求。另一方面，與 TfR 特異性結合的轉鐵蛋白具有某種生物靶向性，因而可考慮作為腫瘤治療的理想靶點[12]。在腫瘤的治療中，我們可考慮利用這種靶向作用[13]，提高腫瘤藥物的治療效果。除此之外，有研究顯示，TfR 對其他某些金屬離子也有較高的親和性，如適合做同位素掃描的鎵元素，其在體內主要存在于腫瘤組織、炎性組織等 TfR 表達量高的部位[14-15]，因此亦可利用鎵元素在早期進行腫瘤定位掃描。也有一些證據顯示，TfR 可結合其他因子，增強藥物對腫瘤細胞的殺傷作用或降低細胞的抗藥性[16-18]。
綜上，通過對 TfR1 在喉癌、甲狀腺癌、上頜竇癌、腮腺癌中表達情況的分析，我們推測 TfR 的表達異常與以上 4 種惡性腫瘤的發生有一定關系，也可能是與其他致病因素共同作用參與了腫瘤的發生、發展。本研究表明 TfR1 在為有核細胞供鐵以及與惡性腫瘤增殖、分化等方面有關，但對于其具體參與了何種調控細胞生長的環節，還需要進一步進行研究。
近年，腫瘤的發病率與死亡率逐年升高。喉癌、甲狀腺癌、上頜竇癌、腮腺癌是頭頸部惡性腫瘤中患病率較高的幾類，嚴重威脅著人類的健康，探尋其新的治療方法具有十分重要的意義。研究發現，轉鐵蛋白及轉鐵蛋白受體（transferrin receptor 1，TfR）在人體內負責鐵的轉運[1]，參與了大部分的代謝活動，而 TfR 在細胞增殖中發揮著重要作用，在快速增殖的腫瘤細胞中更是如此。然而，在腫瘤的發生過程中，分子水平的改變遠遠早于形態學的改變，本研究通過檢測 TfR1 在以上 4 種頭頸部惡性腫瘤的癌組織及癌旁正常組織中的表達水平，探討 TfR1 在頭頸部惡性腫瘤的發生、發展中可能的作用。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 一般資料
選取本院 2015 年 4 月—2017 年 3 月病理確診的原發喉癌、甲狀腺癌、上頜竇癌、腮腺癌患者的新鮮組織標本，標本采集后即送至液氮中保存。標本分別取材于以上 4 種腫瘤的腫瘤中心、癌旁正常組織（距腫瘤邊緣 5 mm 以上）。本研究共收集頭頸部惡性腫瘤患者 24 例，其中男 14 例，女 10 例；年齡（58.67±11.94）歲。喉癌組患者 8 例，年齡（59.50±8.64）歲。甲狀腺癌組患者 8 例，年齡（50.75±12.57）歲。上頜竇癌組患者 4 例，年齡（64.50±13.18）歲。腮腺癌組患者 4 例，年齡（67.00±8.41）歲。24 例頭頸部惡性腫瘤中，16 例有淋巴結轉移。所有標本均經病理醫師復查，確診無誤。實驗程序符合四川大學華西醫院生物醫學倫理分委會所定制的倫理學標準并得到該委員會的批準，獲得受試對象的知情同意。
1.2 實驗方法
1.2.1 熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術檢測 TfR1 的 mRNA 表達
按照 Trizol 試劑盒（美國 Invitrogin 公司，批號：50563209）的操作說明提取制備手術取材組織的總 RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的質量。提取總 RNA，采用隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成互補 DNA（complementary DNA，cDNA）。采用立陶宛 Fermentas 公司的 Revert AidTM Frist Strand cDNA Synthesis Kit，在 PCR 儀上進行擴增。在引物設計網站（www.ncbi.nlm.nih.gov）設計出TfR1 的擴增引物。上游引物：5′-CAG CAT TCT CTA ACT TGT TTG-3′；下游引物：5′-GTT TCA TCT CCA CAT GAC TGT-3′。擴增條件：94℃ 2 min，94℃ 20 s，52℃ 20 s，60℃ 30 s，共 45 個循環；擴增片段大小約 99 bp。用 β-actin 作為內對照以檢驗 cDNA 的質量以及整個 PCR 操作過程無誤。PCR 產物于 1% 瓊脂糖膠上電泳，凝膠成像系統成像，測定出條帶的吸光度積分，用 TfR1 與 ACTB（β-actin 的基因名）吸光度積分的比值代表 TfR1 的半定量值。
1.2.2 蛋白質印跡法檢測 TfR1 的蛋白表達
取 30 mg 標本組織進行碾磨直至成為細小粉末，加一定量的蛋白裂解液，用槍尖吹打混勻后置于冰上。于 4℃ 下 12 000 r/min 離心 5 min 后收集上清液 20 μL 進行分裝，使用 BCA 蛋白濃度試劑盒（碧云天生物技術研究所）測定樣品蛋白總濃度，根據蛋白量的大小選取適當的分離膠 3.5 mL，制好膠后上樣，經聚丙烯酰胺凝膠電泳（先 80 V，120 min；再 120 V，50 min），取出膠在轉移緩沖液中平衡 10 min 后進行轉膜。洗膜后與抗體結合，加底物曝光顯示目的條帶，Quantity One 分析軟件分析蛋白灰度值，計算目的蛋白相對表達量。
1.3 統計學方法
所有實驗數據均采用 SPSS 19.0 軟件進行結果處理分析。采用均數±標準差描述資料特征，采用配對 t 檢驗比較癌組織與癌旁組織間的差別，采用方差分析檢驗不同腫瘤類型間的均數差別，采用成組 t 檢驗比較有無淋巴結轉移的患者間的差別。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 TfR1 mRNA 水平表達情況
從標本組織中取得的 RNA，經電泳觀察未見 DNA 污染及 RNA 降解。實驗中以 TfR1 的特異性引物進行熒光定量 PCR，并獲得目的片段（長度 99 bp）與內參照 ACTB（長度 111 bp）在同一實驗條件下進行擴增。 TfR1 的凝膠電泳結果見圖 1。24 例頭頸部惡性腫瘤患者中，癌組織及癌旁組織均表達 TfR1，其中癌組織的相對表達量均高于其癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P<0.05）。4 種惡性腫瘤的癌組織之間及癌旁組織之間差異均無統計學意義（P>0.05）。有淋巴結轉移的患者其癌組織中TfR1 mRNA 的相對表達量高于無淋巴結轉移的患者（P<0.05）。見表 1、2。
圖1
4 種頭頸部惡性腫瘤癌組織中 TfR1 mRNA 表達水平的電泳圖
表1
不同部位 TfR1 的 mRNA 相對表達水平（
）
表2
有無淋巴結轉移的患者 TfR1 的 mRNA 相對表達水平（
）
2.2 TfR1 蛋白水平表達情況
每類腫瘤的癌組織與癌旁組織中 TfR1 蛋白表達水平差異均具有統計學意義（P<0.05）；4 種惡性腫瘤的癌組織之間 TfR1 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。有淋巴結轉移的患者的 TfR1 蛋白的相對表達量高于無淋巴結轉移的患者，二者間差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3、4。
表3
不同部位 TfR1 的蛋白相對表達水平（
）
表4
有無淋巴結轉移的患者 TfR1 的蛋白相對表達水平（
）
3 討論
TfR 作為腫瘤相關基因研究的熱點之一而倍受關注。TfR1 是一種廣泛存在于人體細胞中的 Ⅱ 型跨膜糖蛋白[2]。它由 2 個同源二聚體的亞基通過 2 條二硫鍵交聯而成，2 個亞基的每個單體（含 760 個氨基酸，相對分子質量為 90×103～95×103）包含 1 個大的細胞外 C 端區域（671 個氨基酸）、1 個單跨膜區域（包含 28 個氨基酸）及 1 個短的 N 端區域（包含 61 個氨基酸）[3-4]。每個單體都包含 1 個轉鐵蛋白結合位點，該位點與轉鐵蛋白結合后能介導鐵元素的轉運，此途徑是細胞攝取鐵元素的重要途徑[5]。
本研究通過應用熒光定量 PCR 技術及蛋白質印跡技術對喉癌、甲狀腺癌、上頜竇癌、腮腺癌中 TfR1 在 mRNA 水平及蛋白水平的表達情況分別進行比較，首先明確 TfR1 分別在頭頸部 4 種惡性腫瘤的基因及蛋白水平表達情況，進一步分析 TfR1 在 4 種惡性腫瘤的癌組織之間的基因及蛋白水平表達情況。結果顯示，4 種腫瘤癌組織中與癌旁正常組織中的 TfR1 在基因水平及蛋白水平均有表達，但二者無論是 mRNA 水平還是蛋白水平表達存在明顯的表達水平差異。在兩種技術中，頭頸部惡性腫瘤的癌組織 TfR1 的相對表達量均高于其癌旁正常組織，這一結果可能提示增殖活躍的腫瘤細胞為滿足增殖的需求，對鐵的需求量相較正常黏膜組織或細胞明顯增高。在本研究中，每例癌組織與癌旁組織均來自同一患者，排除了其他疾病對 TfR1 表達量檢測結果的影響。本研究發現有淋巴結轉移的腫瘤細胞中 TfR1 的相對表達量更高，有淋巴結轉移的惡性腫瘤，通常臨床分期更高、惡性程度更高、腫瘤生長更快，這提示我們鐵代謝、TfR1 的分布與腫瘤的增殖可能呈一定的正相關關系。最后，4 種惡性腫瘤的癌組織之間差異無統計學意義。這一結果提示 4 種常見的頭頸部惡性腫瘤癌組織之間的 TfR1 表達無統計學差異，提示我們 TfR1 在這 4 種頭頸部惡性腫瘤中可能發揮著相似的作用。
TfR 在細胞中的主要作用包括轉運金屬離子、作為藥物運輸的載體以及參與細胞調節等。TfR 在鐵的轉運中具有重要的作用，根據環境 pH 值的改變，TfR 的構象會隨之發生改變，影響對鐵的攝取，從而促進細胞死亡[6-7]。陳舒華等[8]曾對鼻咽癌患者與正常對照進行比較，其發現，鼻咽癌患者的細胞鼻咽上皮黏膜中 TfR 的表達增加，提示其可能與腫瘤大量攝取鐵有關，從而影響腫瘤的發展。有研究發現，TfR 在某些腫瘤細胞中的表達顯著高于其他腫瘤細胞，如乳腺癌細胞[9]、肝癌細胞[10]、白血病細胞[11]。本次研究的結果與以往這些學者的研究結果相符，因此，我們認為在頭頸部 4 種惡性腫瘤組織中，TfR1 的 mRNA 與蛋白的過度表達與這 4 種頭頸部惡性腫瘤的發生、發展相關。
一方面，正如本組研究結果所示，腫瘤細胞中 TfR 的含量更為豐富，其高表達可能就是為了滿足腫瘤細胞的增殖需求。另一方面，與 TfR 特異性結合的轉鐵蛋白具有某種生物靶向性，因而可考慮作為腫瘤治療的理想靶點[12]。在腫瘤的治療中，我們可考慮利用這種靶向作用[13]，提高腫瘤藥物的治療效果。除此之外，有研究顯示，TfR 對其他某些金屬離子也有較高的親和性，如適合做同位素掃描的鎵元素，其在體內主要存在于腫瘤組織、炎性組織等 TfR 表達量高的部位[14-15]，因此亦可利用鎵元素在早期進行腫瘤定位掃描。也有一些證據顯示，TfR 可結合其他因子，增強藥物對腫瘤細胞的殺傷作用或降低細胞的抗藥性[16-18]。
綜上，通過對 TfR1 在喉癌、甲狀腺癌、上頜竇癌、腮腺癌中表達情況的分析，我們推測 TfR 的表達異常與以上 4 種惡性腫瘤的發生有一定關系，也可能是與其他致病因素共同作用參與了腫瘤的發生、發展。本研究表明 TfR1 在為有核細胞供鐵以及與惡性腫瘤增殖、分化等方面有關，但對于其具體參與了何種調控細胞生長的環節，還需要進一步進行研究。
