引用本文： 呂長遙, 伍靜, 何洪波. 六合丹對新西蘭大白兔皮膚感染創面愈合過程中白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α 表達的影響. 華西醫學, 2017, 32(10): 1544-1550. doi: 10.7507/1002-0179.201703100 復制
肛瘺術后患者的切口創面屬于感染加開創性創面，肛門部位特殊，每日均需排便，排便后糞渣和腸道切口分泌物常會污染切口創面，因此術后換藥是整個治療過程不可或缺的環節，其直接影響著疾病治療效果。中藥外治的優勢主要體現在創口愈合方面，基于中醫整體觀實施辯證論治，通過清熱解毒祛濕、脫膿祛腐生肌、活血祛瘀通絡、補益氣血等方法進行治療，采用外敷的方式治療創面，能夠起到解毒生肌、調和氣血的效果，從而加速創口的愈合。六合丹是本院已故名醫吳介誠先生的家傳名方，該方主要由生大黃、生黃柏、烏梅肉、薄荷、白芨、白芷、烏金散、陳小粉等組成，臨床多用于重癥急性胰腺炎疼痛及腹腔積液、急性嵌頓痔水腫、混合痔外剝內扎術后水腫、流行性腮腺炎、早期哺乳期乳腺炎等急性炎癥[1-4]。熊艷艷等[1]將六合丹敷在脫出的嵌頓痔上，發現六合丹能緩解痔水腫及疼痛。李黎等[3]將六合丹外敷于腫脹的腮腺、睪丸處，發現六合丹可縮短治療時間、提高總有效率。但六合丹在疾病慢性感染或潰瘍期的臨床報道較少。為了進一步論證六合丹是否適用于肛瘺術后的慢性感染性創面，能否加速創面的愈合，我們進行了本次實驗研究。現報告如下。
1 材料與儀器
1.1 實驗動物
40 只普通級 3 月齡新西蘭長耳大白兔，雌雄不限，體質量 2.0～2.5 kg，由四川大學實驗動物中心提供[合格證：scxk（川）2013-14]。所有大白兔均由該中心負責飼養。溫度調至 18～24℃，濕度調至 40%～60%。實驗過程中，所有動物均能夠自由飲水，食用一般飼料（由該中心直接供應）。常規喂養，時間 1 周。
1.2 試藥與菌株
1.2.1 試藥 六合丹：由四川大學華西醫院藥劑科提供；紫草油（院內制劑）：由四川大學華西醫院藥劑科提供；藻酸鈣傷口敷料（商品名：德濕康）：由保赫曼（上海）藥業有限公司提供，規格：1 g/30 cm。
1.2.2 菌株 金黃色葡萄菌：由四川大學基礎醫學院藥理教研室提供。
1.3 試劑與儀器
1.3.1 試劑 新西蘭大白兔白細胞介素（interleukin，IL）-1β 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：北京博奧森生物技術有限公司產品；新西蘭大白兔腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（一抗）：北京博奧森生物技術有限公司產品；鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）兔免疫球蛋白G（二/三抗）：武漢博士德生物工程公司產品；二氨基聯苯胺顯色劑：武漢博士德生物工程公司產品；戊巴比妥鈉：5 g/瓶，成都凱派生物科技有限公司產品；硫化鈉：500 g/瓶，成都凱派生物科技有限公司產品；磷酸鹽緩沖液：美國 Hyclone 公司產品。
1.3.2 儀器 顯微鏡：Olympus BX5，日本奧林巴斯光學工業株式會社產品；圖像采集系統（CCD）：Olympus DP73，日本奧林巴斯光學工業株式會社產品；冷凍高速離心機：Centrifuge 5403，美國 Thermo 公司產品；酶標儀：ELx800，美國 BioTek 公司產品；切片機：徠卡 RM2155，德國 Leica 公司產品；電熱恒溫培養箱：DH-360A（303-1A），北京中光偉業儀器有限公司產品；普通電冰箱：BCD-165F，容聲牌；家用微波爐：PJ21C-BF，美的牌；有機玻璃濕盒；玻璃勻漿器：20 mL/支，成都市錦江區玻蜀玻璃儀器廠產品；單道可調移液器：100～1 000 μL/支，溶海實驗器材經營部產品；EP 管：1.5 mL/支，美國 Hyclone 公司產品；微量移液器：美國 Thermo 公司產品；1.5 mL 離心管：美國 Axygen 公司產品。
1.4 方法
1.4.1 實驗動物分組 40 只大白兔采用自體對照法，在大白兔左側背部縱向做 2 個創面，右側背部縱向做 3 個創面，從左上創面開始按逆時針順序分為 5 組：空白組、模型組、治療組（六合丹）、西藥組（藻酸鈣傷口敷料）、中藥組（紫草油）。
1.4.2 麻醉方法 將大白兔放入兔盒中，0.7% 戊巴比妥鈉從大白兔耳緣靜脈給藥，給藥劑量 6 mL/kg。先給總量的 2/3，大白兔無不適反應后再給剩余藥量。
1.4.3 造模方法 將麻醉后的大白兔俯臥固定在兔臺上，彎剪剪去部分兔毛，用 5% 的硫化鈉脫掉大白兔背部兩側兔毛，脫毛范圍約 12 cm×10 cm，脫毛后用生理鹽水洗凈擦干。聚維酮碘局部消毒后，用尖銳組織剪在皮膚上剪 5 個直徑約 2 cm 圓形傷口，深達肌筋膜，破壞部分肌肉表面筋膜，在創面上覆蓋直徑約 2 cm 的圓形紗布，移液器吸取 1 mL 金黃色葡萄菌滴在模型組、治療組、西藥組及中藥組紗布上，空白組不滴菌，單層紗布及網狀彈力繃帶包扎固定，防止大白兔舔蹭。大白兔分籠飼養，給予充足的飼料和水。1 d 后觀察大白兔情況及創面情況，大白兔精神略萎靡，食欲不振，造模成功的創面表面附有黃白色膿性分泌物，周圍皮溫略高。
1.4.4 給藥方法 術后第 1 天開始換藥，此后每天換藥。先用生理鹽水清洗 5 組創面，再用聚維酮碘消毒。空白組和模型組均不給藥；治療組：六合丹涂于創面周圍；西藥組：藻酸鈣傷口敷料填塞創面；中藥組：紫草油涂于創面周圍。換完藥后用單層紗布及網狀彈力繃帶包扎固定，防止大白兔舔蹭。
1.4.5 取材 術后第 3、7、14、21 天隨機處死 10 只兔，聚維酮碘消毒局部后沿創面外緣約 2 mm 切下整個創面組織，將創面組織平均剪為 2 份，1 份放入 10% 甲醛溶液中固定，1 份用磷酸鹽緩沖液洗凈組織表面的膿液，剪除脂肪、結締組織和血管，剪碎組織后放入玻璃均漿器，加入 1 mL 磷酸鹽緩沖液，在冰盒中充分碾磨創面組織后倒入 1.5 mL EP 管，放入冰盒中貯存，2 h 內置于離心機，以離心半徑 15 cm、轉速 15 000 r/min 離心 15 min。
1.5 檢測指標
1.5.1 創面愈合率 術后第 3、7、14、21 天，根據透明薄膜來對創面大小進行描繪，再將描繪好的透明薄膜覆蓋在心電圖紙上，算出創面面積。計算出創面愈合率：創面愈合率=（原始創面面積－殘余創面面積）/原始創面面積×100%。
1.5.2 創面愈合時間 創面徹底上皮化即判斷為愈合。記錄完全上皮化所需的時間。
1.5.3 創面的組織學觀察 切片后進行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin，HE）染色后，采用圖像分析系統分析。使用顯微鏡在各組組織隨機選擇 1 個視野（非壞死及出血、非特異性染色的邊緣區），用 CCD 采集高質量的圖像（像素 1 600×1 200）。在采集圖像時保證每次條件的一致，即以手動調節光源、光圈大小、白平衡、曝光強度、敏感度、對比度、Gamma 值等各項設置并且固定。即使是在更換切片時，除調整焦距和視野以外，顯微鏡上的其他部件的設置都保持不變，包括物鏡的放大倍數。再換用 20 倍的物鏡（總放大倍數為 200 倍），依據上述要求每張切片不同倍數下隨機選取 1 個視野進行圖像采集，其中 HE 采圖每張切片選取 40 倍及 200 倍兩個視野便于觀察。
HE 評價及描述涉及指標：壞死組織厚度及肉芽、瘢痕組織厚度（大致范圍：>3 mm、1～3 mm、<1 mm）；炎細胞數（少/中/多）：炎性細胞浸及皮膚表皮層為少量，浸及真皮層為中量，浸及真皮下為大量[5]。
1.5.4 創面組織中 IL-1β 含量的檢測 采用 ELISA 法，按照 ELISA 試劑盒說明操作。
1.5.5 創面組織中 TNF-α 表達的檢測 采用免疫組織化學法。考慮到本實驗涂片是皮膚潰瘍修復，要避開大量壞死區域（非特異性染色），同時要考慮炎細胞浸潤所帶的影響，故采用經典半定量方法。利用高倍鏡，對每張切片進行觀察，視野共計 10 個，對 1 000 個細胞進行記錄，根據染色強度以及陽性細胞的具體個數作出最后判斷[6]。① 著色評分：0 分，細胞沒有顯色；1 分，呈淡黃色；2 分，顯示棕黃色；3 分，顯示棕褐色。② 根據同類細胞中陽性細胞占據的比例進行評定：0 分，陰性；1 分，陽性細胞的占比≤10%；2 分，陽性細胞的占比>10% 且≤50%；3 分，陽性細胞的占比>50% 且≤75%；4 分，陽性細胞的占比≥75%。將 ① 和 ② 所得乘積視作總積分：0～3 分，記作（–）；3～6 分，記作（+）；7～9 分，記作（++），9～12 分，記作（+++）。
1.6 統計學方法
統計學分析由不知分組意義的第三方統計者負責，采用 SPSS 17.0 軟件處理所有的實驗數據。符合正態分布的計量數據采用均數±標準差表示，組間兩兩比較采用 SNK-q 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 創面愈合率
術后第 3 天，不同組別創面愈合率差異無統計學意義（P>0.05）。術后第 7、14、21 天西藥組、治療組和空白組創面愈合率明顯優于模型組和中藥組，差異有統計學意義（P<0.05）；西藥組、治療組和空白組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；中藥組優于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
術后不同時間各組創面愈合率比較（n=40，%，
）
2.2 創面愈合時間
空白組、模型組、中藥組、西藥組和治療組創面愈合時間分別為（16.35±0.95）、（20.38±1.28）、（20.17±1.12）、（18.05±1.55）、（17.39±1.23） d。空白組創面愈合最為迅速，相較于其他組別，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組和中藥組愈合相對最慢，相較于其他組別，差異有統計學意義（P<0.05）；在愈合時間上，模型組和中藥組比較、西藥組和治療組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
各組組織不同時間 IL-1β 含量的動態比較（n=10，pg/mL，
）
2.3 HE 染色結果
術后第 3 天：治療組、空白組創面炎癥反應與其他 3 組相比較輕，其他 3 組創面炎癥反應重，創面腫脹、滲出，鏡下皮下組織可見大量壞死組織及炎性細胞浸潤。術后第 7 天：各組均可見部分壞死組織及炎細胞浸潤，治療組、西藥組的壞死組織及炎細胞浸潤程度比模型組、中藥組輕，但各組炎癥反應均比第 3 天減輕。術后第 14 天：上皮組織大部分形成，表皮細胞分化良好，較正常上皮更為肥厚，且能夠看到膠原纖維（新生）和部分炎細胞。其下為平行排列的膠原纖維及小血管，可見瘢痕形成。治療組、西藥組的小血管數量比模型組、中藥組多，膠原纖維排列更為致密。術后第 21 天：各組創面可見上皮組織覆蓋，并可見大量瘢痕組織增生，大量成熟的且數量較多的膠原纖維，毛細血管管徑大，數量較前有所減少。見圖 1。
圖1
術后不同時間各組創面 HE 染色結果（HE ×200）
2.4 創面肉芽組織中 IL-1β 變化情況
在術后第 3、7 天，IL-1β 含量從低到高依次為空白組、治療組、西藥組、中藥組、模型組，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；術后第 14 天，IL-1β 含量從低到高依次為治療組、空白組、西藥組、中藥組、模型組，除西藥組和中藥組間差異無統計學意義（P>0.05）外，其余組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；術后第 21 天，治療組的 IL-1β 含量低于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05），其余組間兩兩比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
2.5 創面肉芽組織中 TNF-α 的表達
根據免疫組織化學圖像染色強度以及陽性細胞來判斷 TNF-α 的表達，模型組創面中 TNF-α 的表達在整個實驗過程中均高于其余各組，而經藥物干預的治療組和西藥組的 TNF-α 的表達下降較模型組明顯，中藥組 TNF-α 的表達強于治療組和西藥組。免疫組織化學圖像見圖 2。
圖2
各組術后不同時間 TNF-α 的免疫組織化學圖像（SABC ×200）
3 討論
創傷修復分為炎癥期、細胞增生期及重塑期[7]，炎癥期的應答對創面的修復至關重要，IL-1β、TNF-α 都是炎癥期重要的炎性因子。IL-1β 主要出現在早期炎癥免疫反應中，使不同的免疫活性細胞具備更多功能，它對炎性反應、機體防御有一定誘導作用，維持機體內環境相對平衡[8-9]。TNF-α 主要由巨噬細胞、成纖維細胞、淋巴細胞以及內皮細胞等產生[10]，TNF-α 若發生高表達，表皮細胞將無法進行增殖，進而導致慢性創面無法實現短期愈合[11]。相關研究結果顯示創傷傷口、全身血液均可表達出炎癥細胞因子，前者對機體組織造成的影響要大于后者，局部表達可快速啟動創傷修復，而 IL-1β、TNF-α 可對細胞反應進行調節，決定細胞外基質能不能合成，細胞是否能產生更多的血管以及肉芽組織，同時還決定細胞組織是否能進行更快分化，決定細胞組織是否具備更高的遷移活性[12]。因此，IL-1β、TNF-α 達到怎樣的表達水平，與組織創面的修復有很大的關系[13]，可見創面若具備良好的炎癥環境，其愈合時間也將大大縮短。
六合丹以清熱解毒、活血化瘀通絡立法，方中大黃為君藥，性寒，味苦，入胃、大腸和肝經，有瀉熱毒、蕩積滯、行瘀血的功效。黃柏為臣，性寒、味苦，歸腎、大腸、膀胱經，能清熱燥濕、瀉火解毒、利水消腫，祛瘀化腐。兩者協同發揮清熱解毒、祛腐通絡、逐瘀止痛的功效。白芨為佐使，性辛溫，能消腫生肌斂瘡，薄荷辛涼，可辛散通絡、活血散腫、透熱外出，溫涼并用，辛而行氣，以溫濟寒，加之烏梅酸澀，白芷辛溫芳香、長于止痛，烏金散拔毒解毒，陳小粉散瘀止痛，再使用蜂蜜調制成中藥糊劑，減少藥物刺激，諸藥共用，共奏清熱解毒、行氣活血、消腫止痛、散結化瘀之功效。彭小航等[14-15]將微米六合丹外敷于急性胰腺炎大鼠腹部，發現六合丹能降低急性胰腺炎大鼠的血清淀粉酶、TNF-α、IL-6、IL-10、血栓烷素 B2 及 6-酮-前列腺素 F1α 水平，提示六合丹外敷有助于減輕實驗大鼠急性胰腺炎過氧化損傷和炎癥反應。
本研究結果顯示在創面修復過程中，炎癥細胞因子呈現動態變化，在術后第 3 天開始明顯升高，術后第 7 天達到峰值，然后逐漸下降。模型組創面相較于其他組表達出更多的 IL-1β、TNF-α，所以創面愈合時間也更長，而經藥物干預的治療組和西藥組的 IL-1β、TNF-α 的表達下降較模型組明顯。西藥組和中藥組相比，西藥組的 IL-1β、TNF-α 的表達下降較中藥組明顯，藻酸鈣傷口敷料對炎癥因子的調控作用比紫草油強。術后第 14、21 天創面處于細胞增生期及重塑期，各組創面中的 IL-1β、TNF-α 表達下降，雖空白組未滴細菌，但實驗環境并不是無菌環境，治療組使用六合丹治療感染性創面，對創面的炎癥因子仍有調控作用，對比未使用藥物治療的空白組，其 IL-1β、TNF-α 表達減弱，從該層面也證實六合丹對慢性感染創面的促愈合作用。早期炎癥反應關系到創面愈合，IL-1β、TNF-α 這兩種因子間可相互協同導致后期感染性創面很難實現愈合。六合丹外敷感染性創面可有效抑制 IL-1β、TNF-α 的表達，減少感染性創面炎性因子的釋放。
綜上所述，六合丹具有清熱解毒、活血化瘀的功效，在炎癥期，通過降低感染性創面 IL-1β 和 TNF-α 的表達水平，阻止創面釋放出更多的炎癥介質，為創面愈合提供良好的條件。進入組織重建期后，前期炎癥反應輕的創面組織的細胞外基質、成纖維細胞、毛細血管具有更強的生長能力，加速創面的愈合。所以，六合丹通過對創面炎癥進行有效抑制，加快創面更好地愈合，但創面的愈合是一個復雜的過程，多種調控因子參與組織修復，我們未來仍需發掘研究六合丹對調控因子之間的影響。
肛瘺術后患者的切口創面屬于感染加開創性創面，肛門部位特殊，每日均需排便，排便后糞渣和腸道切口分泌物常會污染切口創面，因此術后換藥是整個治療過程不可或缺的環節，其直接影響著疾病治療效果。中藥外治的優勢主要體現在創口愈合方面，基于中醫整體觀實施辯證論治，通過清熱解毒祛濕、脫膿祛腐生肌、活血祛瘀通絡、補益氣血等方法進行治療，采用外敷的方式治療創面，能夠起到解毒生肌、調和氣血的效果，從而加速創口的愈合。六合丹是本院已故名醫吳介誠先生的家傳名方，該方主要由生大黃、生黃柏、烏梅肉、薄荷、白芨、白芷、烏金散、陳小粉等組成，臨床多用于重癥急性胰腺炎疼痛及腹腔積液、急性嵌頓痔水腫、混合痔外剝內扎術后水腫、流行性腮腺炎、早期哺乳期乳腺炎等急性炎癥[1-4]。熊艷艷等[1]將六合丹敷在脫出的嵌頓痔上，發現六合丹能緩解痔水腫及疼痛。李黎等[3]將六合丹外敷于腫脹的腮腺、睪丸處，發現六合丹可縮短治療時間、提高總有效率。但六合丹在疾病慢性感染或潰瘍期的臨床報道較少。為了進一步論證六合丹是否適用于肛瘺術后的慢性感染性創面，能否加速創面的愈合，我們進行了本次實驗研究。現報告如下。
1 材料與儀器
1.1 實驗動物
40 只普通級 3 月齡新西蘭長耳大白兔，雌雄不限，體質量 2.0～2.5 kg，由四川大學實驗動物中心提供[合格證：scxk（川）2013-14]。所有大白兔均由該中心負責飼養。溫度調至 18～24℃，濕度調至 40%～60%。實驗過程中，所有動物均能夠自由飲水，食用一般飼料（由該中心直接供應）。常規喂養，時間 1 周。
1.2 試藥與菌株
1.2.1 試藥 六合丹：由四川大學華西醫院藥劑科提供；紫草油（院內制劑）：由四川大學華西醫院藥劑科提供；藻酸鈣傷口敷料（商品名：德濕康）：由保赫曼（上海）藥業有限公司提供，規格：1 g/30 cm。
1.2.2 菌株 金黃色葡萄菌：由四川大學基礎醫學院藥理教研室提供。
1.3 試劑與儀器
1.3.1 試劑 新西蘭大白兔白細胞介素（interleukin，IL）-1β 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：北京博奧森生物技術有限公司產品；新西蘭大白兔腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（一抗）：北京博奧森生物技術有限公司產品；鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）兔免疫球蛋白G（二/三抗）：武漢博士德生物工程公司產品；二氨基聯苯胺顯色劑：武漢博士德生物工程公司產品；戊巴比妥鈉：5 g/瓶，成都凱派生物科技有限公司產品；硫化鈉：500 g/瓶，成都凱派生物科技有限公司產品；磷酸鹽緩沖液：美國 Hyclone 公司產品。
1.3.2 儀器 顯微鏡：Olympus BX5，日本奧林巴斯光學工業株式會社產品；圖像采集系統（CCD）：Olympus DP73，日本奧林巴斯光學工業株式會社產品；冷凍高速離心機：Centrifuge 5403，美國 Thermo 公司產品；酶標儀：ELx800，美國 BioTek 公司產品；切片機：徠卡 RM2155，德國 Leica 公司產品；電熱恒溫培養箱：DH-360A（303-1A），北京中光偉業儀器有限公司產品；普通電冰箱：BCD-165F，容聲牌；家用微波爐：PJ21C-BF，美的牌；有機玻璃濕盒；玻璃勻漿器：20 mL/支，成都市錦江區玻蜀玻璃儀器廠產品；單道可調移液器：100～1 000 μL/支，溶海實驗器材經營部產品；EP 管：1.5 mL/支，美國 Hyclone 公司產品；微量移液器：美國 Thermo 公司產品；1.5 mL 離心管：美國 Axygen 公司產品。
1.4 方法
1.4.1 實驗動物分組 40 只大白兔采用自體對照法，在大白兔左側背部縱向做 2 個創面，右側背部縱向做 3 個創面，從左上創面開始按逆時針順序分為 5 組：空白組、模型組、治療組（六合丹）、西藥組（藻酸鈣傷口敷料）、中藥組（紫草油）。
1.4.2 麻醉方法 將大白兔放入兔盒中，0.7% 戊巴比妥鈉從大白兔耳緣靜脈給藥，給藥劑量 6 mL/kg。先給總量的 2/3，大白兔無不適反應后再給剩余藥量。
1.4.3 造模方法 將麻醉后的大白兔俯臥固定在兔臺上，彎剪剪去部分兔毛，用 5% 的硫化鈉脫掉大白兔背部兩側兔毛，脫毛范圍約 12 cm×10 cm，脫毛后用生理鹽水洗凈擦干。聚維酮碘局部消毒后，用尖銳組織剪在皮膚上剪 5 個直徑約 2 cm 圓形傷口，深達肌筋膜，破壞部分肌肉表面筋膜，在創面上覆蓋直徑約 2 cm 的圓形紗布，移液器吸取 1 mL 金黃色葡萄菌滴在模型組、治療組、西藥組及中藥組紗布上，空白組不滴菌，單層紗布及網狀彈力繃帶包扎固定，防止大白兔舔蹭。大白兔分籠飼養，給予充足的飼料和水。1 d 后觀察大白兔情況及創面情況，大白兔精神略萎靡，食欲不振，造模成功的創面表面附有黃白色膿性分泌物，周圍皮溫略高。
1.4.4 給藥方法 術后第 1 天開始換藥，此后每天換藥。先用生理鹽水清洗 5 組創面，再用聚維酮碘消毒。空白組和模型組均不給藥；治療組：六合丹涂于創面周圍；西藥組：藻酸鈣傷口敷料填塞創面；中藥組：紫草油涂于創面周圍。換完藥后用單層紗布及網狀彈力繃帶包扎固定，防止大白兔舔蹭。
1.4.5 取材 術后第 3、7、14、21 天隨機處死 10 只兔，聚維酮碘消毒局部后沿創面外緣約 2 mm 切下整個創面組織，將創面組織平均剪為 2 份，1 份放入 10% 甲醛溶液中固定，1 份用磷酸鹽緩沖液洗凈組織表面的膿液，剪除脂肪、結締組織和血管，剪碎組織后放入玻璃均漿器，加入 1 mL 磷酸鹽緩沖液，在冰盒中充分碾磨創面組織后倒入 1.5 mL EP 管，放入冰盒中貯存，2 h 內置于離心機，以離心半徑 15 cm、轉速 15 000 r/min 離心 15 min。
1.5 檢測指標
1.5.1 創面愈合率 術后第 3、7、14、21 天，根據透明薄膜來對創面大小進行描繪，再將描繪好的透明薄膜覆蓋在心電圖紙上，算出創面面積。計算出創面愈合率：創面愈合率=（原始創面面積－殘余創面面積）/原始創面面積×100%。
1.5.2 創面愈合時間 創面徹底上皮化即判斷為愈合。記錄完全上皮化所需的時間。
1.5.3 創面的組織學觀察 切片后進行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin，HE）染色后，采用圖像分析系統分析。使用顯微鏡在各組組織隨機選擇 1 個視野（非壞死及出血、非特異性染色的邊緣區），用 CCD 采集高質量的圖像（像素 1 600×1 200）。在采集圖像時保證每次條件的一致，即以手動調節光源、光圈大小、白平衡、曝光強度、敏感度、對比度、Gamma 值等各項設置并且固定。即使是在更換切片時，除調整焦距和視野以外，顯微鏡上的其他部件的設置都保持不變，包括物鏡的放大倍數。再換用 20 倍的物鏡（總放大倍數為 200 倍），依據上述要求每張切片不同倍數下隨機選取 1 個視野進行圖像采集，其中 HE 采圖每張切片選取 40 倍及 200 倍兩個視野便于觀察。
HE 評價及描述涉及指標：壞死組織厚度及肉芽、瘢痕組織厚度（大致范圍：>3 mm、1～3 mm、<1 mm）；炎細胞數（少/中/多）：炎性細胞浸及皮膚表皮層為少量，浸及真皮層為中量，浸及真皮下為大量[5]。
1.5.4 創面組織中 IL-1β 含量的檢測 采用 ELISA 法，按照 ELISA 試劑盒說明操作。
1.5.5 創面組織中 TNF-α 表達的檢測 采用免疫組織化學法。考慮到本實驗涂片是皮膚潰瘍修復，要避開大量壞死區域（非特異性染色），同時要考慮炎細胞浸潤所帶的影響，故采用經典半定量方法。利用高倍鏡，對每張切片進行觀察，視野共計 10 個，對 1 000 個細胞進行記錄，根據染色強度以及陽性細胞的具體個數作出最后判斷[6]。① 著色評分：0 分，細胞沒有顯色；1 分，呈淡黃色；2 分，顯示棕黃色；3 分，顯示棕褐色。② 根據同類細胞中陽性細胞占據的比例進行評定：0 分，陰性；1 分，陽性細胞的占比≤10%；2 分，陽性細胞的占比>10% 且≤50%；3 分，陽性細胞的占比>50% 且≤75%；4 分，陽性細胞的占比≥75%。將 ① 和 ② 所得乘積視作總積分：0～3 分，記作（–）；3～6 分，記作（+）；7～9 分，記作（++），9～12 分，記作（+++）。
1.6 統計學方法
統計學分析由不知分組意義的第三方統計者負責，采用 SPSS 17.0 軟件處理所有的實驗數據。符合正態分布的計量數據采用均數±標準差表示，組間兩兩比較采用 SNK-q 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 創面愈合率
術后第 3 天，不同組別創面愈合率差異無統計學意義（P>0.05）。術后第 7、14、21 天西藥組、治療組和空白組創面愈合率明顯優于模型組和中藥組，差異有統計學意義（P<0.05）；西藥組、治療組和空白組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；中藥組優于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
術后不同時間各組創面愈合率比較（n=40，%，
）
2.2 創面愈合時間
空白組、模型組、中藥組、西藥組和治療組創面愈合時間分別為（16.35±0.95）、（20.38±1.28）、（20.17±1.12）、（18.05±1.55）、（17.39±1.23） d。空白組創面愈合最為迅速，相較于其他組別，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組和中藥組愈合相對最慢，相較于其他組別，差異有統計學意義（P<0.05）；在愈合時間上，模型組和中藥組比較、西藥組和治療組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
各組組織不同時間 IL-1β 含量的動態比較（n=10，pg/mL，
）
2.3 HE 染色結果
術后第 3 天：治療組、空白組創面炎癥反應與其他 3 組相比較輕，其他 3 組創面炎癥反應重，創面腫脹、滲出，鏡下皮下組織可見大量壞死組織及炎性細胞浸潤。術后第 7 天：各組均可見部分壞死組織及炎細胞浸潤，治療組、西藥組的壞死組織及炎細胞浸潤程度比模型組、中藥組輕，但各組炎癥反應均比第 3 天減輕。術后第 14 天：上皮組織大部分形成，表皮細胞分化良好，較正常上皮更為肥厚，且能夠看到膠原纖維（新生）和部分炎細胞。其下為平行排列的膠原纖維及小血管，可見瘢痕形成。治療組、西藥組的小血管數量比模型組、中藥組多，膠原纖維排列更為致密。術后第 21 天：各組創面可見上皮組織覆蓋，并可見大量瘢痕組織增生，大量成熟的且數量較多的膠原纖維，毛細血管管徑大，數量較前有所減少。見圖 1。
圖1
術后不同時間各組創面 HE 染色結果（HE ×200）
2.4 創面肉芽組織中 IL-1β 變化情況
在術后第 3、7 天，IL-1β 含量從低到高依次為空白組、治療組、西藥組、中藥組、模型組，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；術后第 14 天，IL-1β 含量從低到高依次為治療組、空白組、西藥組、中藥組、模型組，除西藥組和中藥組間差異無統計學意義（P>0.05）外，其余組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；術后第 21 天，治療組的 IL-1β 含量低于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05），其余組間兩兩比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
2.5 創面肉芽組織中 TNF-α 的表達
根據免疫組織化學圖像染色強度以及陽性細胞來判斷 TNF-α 的表達，模型組創面中 TNF-α 的表達在整個實驗過程中均高于其余各組，而經藥物干預的治療組和西藥組的 TNF-α 的表達下降較模型組明顯，中藥組 TNF-α 的表達強于治療組和西藥組。免疫組織化學圖像見圖 2。
圖2
各組術后不同時間 TNF-α 的免疫組織化學圖像（SABC ×200）
3 討論
創傷修復分為炎癥期、細胞增生期及重塑期[7]，炎癥期的應答對創面的修復至關重要，IL-1β、TNF-α 都是炎癥期重要的炎性因子。IL-1β 主要出現在早期炎癥免疫反應中，使不同的免疫活性細胞具備更多功能，它對炎性反應、機體防御有一定誘導作用，維持機體內環境相對平衡[8-9]。TNF-α 主要由巨噬細胞、成纖維細胞、淋巴細胞以及內皮細胞等產生[10]，TNF-α 若發生高表達，表皮細胞將無法進行增殖，進而導致慢性創面無法實現短期愈合[11]。相關研究結果顯示創傷傷口、全身血液均可表達出炎癥細胞因子，前者對機體組織造成的影響要大于后者，局部表達可快速啟動創傷修復，而 IL-1β、TNF-α 可對細胞反應進行調節，決定細胞外基質能不能合成，細胞是否能產生更多的血管以及肉芽組織，同時還決定細胞組織是否能進行更快分化，決定細胞組織是否具備更高的遷移活性[12]。因此，IL-1β、TNF-α 達到怎樣的表達水平，與組織創面的修復有很大的關系[13]，可見創面若具備良好的炎癥環境，其愈合時間也將大大縮短。
六合丹以清熱解毒、活血化瘀通絡立法，方中大黃為君藥，性寒，味苦，入胃、大腸和肝經，有瀉熱毒、蕩積滯、行瘀血的功效。黃柏為臣，性寒、味苦，歸腎、大腸、膀胱經，能清熱燥濕、瀉火解毒、利水消腫，祛瘀化腐。兩者協同發揮清熱解毒、祛腐通絡、逐瘀止痛的功效。白芨為佐使，性辛溫，能消腫生肌斂瘡，薄荷辛涼，可辛散通絡、活血散腫、透熱外出，溫涼并用，辛而行氣，以溫濟寒，加之烏梅酸澀，白芷辛溫芳香、長于止痛，烏金散拔毒解毒，陳小粉散瘀止痛，再使用蜂蜜調制成中藥糊劑，減少藥物刺激，諸藥共用，共奏清熱解毒、行氣活血、消腫止痛、散結化瘀之功效。彭小航等[14-15]將微米六合丹外敷于急性胰腺炎大鼠腹部，發現六合丹能降低急性胰腺炎大鼠的血清淀粉酶、TNF-α、IL-6、IL-10、血栓烷素 B2 及 6-酮-前列腺素 F1α 水平，提示六合丹外敷有助于減輕實驗大鼠急性胰腺炎過氧化損傷和炎癥反應。
本研究結果顯示在創面修復過程中，炎癥細胞因子呈現動態變化，在術后第 3 天開始明顯升高，術后第 7 天達到峰值，然后逐漸下降。模型組創面相較于其他組表達出更多的 IL-1β、TNF-α，所以創面愈合時間也更長，而經藥物干預的治療組和西藥組的 IL-1β、TNF-α 的表達下降較模型組明顯。西藥組和中藥組相比，西藥組的 IL-1β、TNF-α 的表達下降較中藥組明顯，藻酸鈣傷口敷料對炎癥因子的調控作用比紫草油強。術后第 14、21 天創面處于細胞增生期及重塑期，各組創面中的 IL-1β、TNF-α 表達下降，雖空白組未滴細菌，但實驗環境并不是無菌環境，治療組使用六合丹治療感染性創面，對創面的炎癥因子仍有調控作用，對比未使用藥物治療的空白組，其 IL-1β、TNF-α 表達減弱，從該層面也證實六合丹對慢性感染創面的促愈合作用。早期炎癥反應關系到創面愈合，IL-1β、TNF-α 這兩種因子間可相互協同導致后期感染性創面很難實現愈合。六合丹外敷感染性創面可有效抑制 IL-1β、TNF-α 的表達，減少感染性創面炎性因子的釋放。
綜上所述，六合丹具有清熱解毒、活血化瘀的功效，在炎癥期，通過降低感染性創面 IL-1β 和 TNF-α 的表達水平，阻止創面釋放出更多的炎癥介質，為創面愈合提供良好的條件。進入組織重建期后，前期炎癥反應輕的創面組織的細胞外基質、成纖維細胞、毛細血管具有更強的生長能力，加速創面的愈合。所以，六合丹通過對創面炎癥進行有效抑制，加快創面更好地愈合，但創面的愈合是一個復雜的過程，多種調控因子參與組織修復，我們未來仍需發掘研究六合丹對調控因子之間的影響。
