引用本文： 楊汐靜, 陳曉婷, 于思淼, 劉偉. Red 重組介導大腸桿菌外膜蛋白 A 缺失突變菌株的構建及生物學特性初步研究. 華西醫學, 2017, 32(12): 1895-1899. doi: 10.7507/1002-0179.201701144 復制
許多微生物都可以作為表面展示多肽或蛋白的宿主，包括革蘭陽性（Gram-positive，G+）菌、革蘭陰性菌和酵母菌[1]。但由于 G+菌細胞壁是由一層厚而致密的肽聚糖和磷壁酸組成[2]，導致轉化效率低等缺點，而大腸桿菌以其高產量和便于基因工程操作成為主要的蛋白質表面展示菌株。盡管有許多的載體蛋白都被研究人員開發用來展示其他的異源蛋白，但多數載體蛋白的應用因承載蛋白的大小而受到了較大的限制[3]。相比較而言，外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）展示系統能展示相對分子質量較大且結構復雜的目的蛋白，從而成為生物技術研究的熱點[4]。大腸桿菌Omp是一類高度保守的、由 325 個氨基酸所組成的蛋白，該蛋白主要由 N 端和 C 端兩個結構域組成，能以 β-折疊組成桶狀樣結構，跨越外膜，此類蛋白主要包括 OmpA、麥芽糖孔蛋白、鐵色素外膜受體蛋白、OmpC 和 OmpX[5-8]。
大腸桿菌的 OmpA 因其自身具備的 β-折疊桶狀跨膜結構，常被人用于在大腸桿菌表面展示外源片段。外源抗原在大腸桿菌外表面進行表達，利于此種優勢可制備成有效的活載體疫苗。大腸桿菌外膜展示系統中，因表達量問題，常在 OmpA 前嵌入脂蛋白（lipoprotein，Lpp）構建 Lpp-OmpA 表達系統[9]。本實驗室前期構建了表達質粒 pet28a-lpp-ompa-trap 成功轉入大腸桿菌內，同時成功地在大腸桿菌基因組直接用 Red 同源重組的方式在 OmpA 跨膜區域插入外源基因 gapc1，但這兩類外源片段的展示均面臨一個問題就是外源基因表達量不夠，活載體疫苗的保護率不高[10-12]。分析認為在做外源片段展示的時候是直接構建好 Lpp-OmpA- 連接目的片段，直接進入宿主菌，不論是重組質粒轉化還是基因組外源片段電擊轉入均未去掉宿主菌原來的 OmpA，為進一步探究 OmpA 的保留是否與表達量有關，本研究利用 Red 同源重組的方法對大腸桿菌進行 OmpA 敲除，構建大腸桿菌 OmpA 缺失株，為后續研究奠定一定的基礎。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和質粒
大腸桿菌由黑龍江八一農墾大學預防獸醫學系實驗室提供。質粒 pKD46、pKD3、由揚州大學朱國強教授惠贈。
1.1.2 試劑
限制性內切酶 DpnⅠ；pfu DNA 聚合酶購自美國 New England BioLabs 公司；DreamTagTM Green PCR Master Mix（2×）購自立陶宛 MBI 公司；氨芐青霉素、氯霉素購自德國 Sigma 公司；細菌培養用胰蛋白胨和酵母提取物購自英國 Oxoid 公司；E.Z.N.ATM Plasmid Mini Kit 和 E.Z.N.ATM Gei Extraction Kit 購自美國 Omega bio-tek 公司；核酸標準品（DL2000 Plus DNA Marker）購自日本 Takara 公司；蛋白質標準品（SM0671 Protein Marker）購自美國 Thermo 公司；二氨基聯苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購自中山金橋公司；羊抗鼠免疫球蛋白G 二抗購自英國 Abcam 公司；其他試劑為國產分析純。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 引物設計與合成
根據已發表的大腸桿菌OmpA（GenBank Accessed Number AC-00091.1）基因序列和 pKD3 質粒序列，應用 DNA Star 軟件設計，其中 P1-C1和 P2-C2 分別由 2 部分組成，5’端加下劃線的序列與 OmpA 基因兩翼序列同源，3’端未加下劃線的序列與質粒 pKD3 上cm 基因兩側序列互補。在大腸桿菌 OmpA 基因同源重組區域外側和 cat 基因上設計鑒定引物 P3、P4、P5、P6。引物由上海生工生物有限公司合成，如表 1 和圖 1。
表1
實驗中所使用的引物
圖1
引物示意圖
1.2.2 基因敲除 cat 的制備和純化
以質粒 pKD3 為模板，P1-C1、P2-C2 為引物，進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。擴增產物用 DpnⅠ進行酶切，以切除模板減少模板質粒對實驗的影響。酶切后的產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、DNA 回收試劑盒純化和 DNA 濃度測定。回收產物于 4℃ 保存備用。
1.2.3 表達 Red 重組酶菌株的誘導和同源重組
用氯化鈣法將 pKD46 質粒轉化到野生型大腸桿菌中，用含有 100 μg/mL 氨芐青霉素的 LB 培養基篩選單個菌落并鑒定后， 經30℃ 震蕩培養至 600 nm 波長的吸光度（A600）值為 0.4～0.6 時加 30 mmol/L L-阿拉伯糖誘導，Exo、Bet、Gam 蛋白充分表達后，制備含有 10% 甘油的電轉感受態細胞。在 MicroPulser 電轉化儀（美國 Bio-Rad 公司）上，電壓 1.8 kV，脈沖 25 Μf，電阻 200 Ω 的參數下，將上述純化融合 PCR 產物電擊轉化到感受態細胞，在含氯霉素和氨芐青霉素的 LB 平板上篩選單克隆菌株。
1.2.4 重組菌株的 PCR 鑒定
將在氯霉素和氨芐青霉素的 LB 平板生長的菌株轉接入含相應抗性的液體 LB 中培養，后用鑒定引物 P3、P4、P5、P6 對菌株進行菌液 PCR 鑒定。鑒定體系為 Dream Tag TM Green PCR Master Mix（2×）10 μL、上下游引物各 0.5 μL、模板為單菌落，加雙蒸水至 20 μL，反應條件：94℃ 預變性 10 min 后，94℃ 變性 30 s，52℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 2 min，30 個循環，最后 72℃ 延伸 5 min。鑒定對的菌株送去上海生工測序。
1.2.5 蛋白質印記法檢測 OmpA 蛋白缺失
將 PCR 鑒定成功并測序正確的菌株進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及蛋白質印跡法分析。將細菌培養至 A600 為 0.6 時，收集菌液，12 000 r/min 離心 1 min，用無菌磷酸鹽緩沖液清洗 3 次后制備成電泳樣品，配制 12% 的 SDS-PAGE 凝膠進行電泳，然后采用濕轉法進行轉膜。轉印結束，將硝酸纖維素膜取出后用雙蒸水漂洗 1 次，用磷酸鹽吐溫緩沖液（0.1%PBS-Tween20，PBST）漂洗 3 次，將硝酸纖維素膜置于 5% 脫脂乳中封閉 2h；PBST 漂洗 3 次，加入抗 OmpA 的血清，室溫搖床溫育 1h；PBST 漂洗 3 次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白 G，室溫搖床溫育 1h；PBST 漂洗 3 次，雙蒸水漂洗 1 次，采用 DAB 顯色試劑盒顯色，見顯色，立即放入雙蒸水中終止反應，觀察結果，照相。
1.2.6 缺失株生長曲線的測定
將野生菌種和重組缺失菌株接入 LB 中培養至 A600 為 0.6 時作為培養的母液，按照 1∶100 轉接入 LB 中再培養，且分別于培養的 0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h 取出 2 mL 菌液測定 A600 值，每個時間點重復測定 3 次。
1.3 觀察指標
觀察 PCR 擴增片段核算電泳結果，重組細菌全菌體 PCR 檢測電泳結果，重組細菌蛋白質印跡法檢測結果，細菌生長 0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22h 細菌 A600 值。
2 結果
2.1 基因打靶片段構建結果
以質粒 pKD3 為模板，用引物 P1 和 P2 進行 PCR 擴增 H1-cm-H2 knock-out cat，擴增產物 經1% 瓊脂糖凝膠電泳，可見特異性 DNA 條帶，與預期值 1 104 bp 大小相符，見圖 2。
圖2
Hl-cm-H2 擴增產物電泳結果
泳道 1：H1-cm-H2 打靶片段擴增產物，大小為 1 104 bp（白色條帶）；泳道 M：8 000 bp Marker
2.2 基因缺失株的鑒定
經過抗生素初步篩選，得到 40 個克隆，利用 2 對鑒定引物 P3-P5、P4-P5 進行菌落 PCR 擴增鑒定，結果得到 6 個陽性克隆，命名為 E.coli△ OmpA1、E.coli△OmpA2、E.coli△OmpA3、E.coli△OmpA4、E.coli△OmpA5、E.coli△OmpA6，結果詳見圖 3。其中 1、3、5、7、9、11、13、15 為 P 和 P5 鑒定結果，大小為 839 bp，2、4、6、8、10、12、14、16 為 P4 和 P6 鑒定結果大小為 1 424 bp。陽性克隆擴增出的 DNA 片段大小與預期值一致，隱性對照大腸桿菌野生型（wild type，WT）及水對照均沒有擴增出任何 DNA 片段。
圖3
菌液 PCR 擴增鑒定結果
泳道 M：5 000 bp Marker；泳道 1、3、5、7、9、11：分別為
2.3 蛋白質印跡法檢測結果
將經濃縮后的WT和 OmpA 缺失后的 E.coli△OmpA1 細菌裂解上清液進行 SDS-PAGE，轉膜后進行蛋白質印跡法分析。圖 4 中樣品均為全菌體，一抗為抗 OmpA 蛋白的血清，第1道為 E.coli△OmpA1，未出現特異性條帶，第2道為大腸桿菌 WT，出現 1 條特異性條帶，相對分子質量約為 34×103，34×103處條帶與預期值大小接近，證明大腸桿菌 WT 表達的 OmpA 蛋白成功敲除。
圖4
蛋白質印跡法檢測 OmpA 蛋白表達結果
泳道 M：170×103 maker；泳道 1：大腸桿菌重組
2.4 缺失株生長曲線
為檢測 OmpA 缺失是否影響細菌的生長，將大腸桿菌重組缺失株 E.coli△OmpA1 和大腸桿菌野生株 WT 培養不同時期的 A600 值為縱坐標，時間為橫坐標繪制菌株隨時間變化的生長曲線，大腸桿菌重組缺失株 E.coli△OmpA1 的生長曲線符合大腸桿菌的生長規律。細菌的生長沒有顯著的影響。見圖 5。
圖5
大腸桿菌 OmpA 缺失株與大腸桿菌野生株的生長曲線
WT：大腸桿菌野生株；△OmpA1：大腸桿菌
3 討論
大腸桿菌的 β-桶狀 Omp，能以 β-折疊組成桶狀樣結構，并多次跨越外膜，此類蛋白主要為 OmpA、OmpC、OmpT 等。大多數以 Omp 為載體的展示系統在不影響其結構穩定性的情況下，僅允許小肽插入到 Omp 的膜外環上[13]。為了突破這種限制，新的以 Omp 為載體的展示系統被開發出來并廣為利用。如利用融合到假單胞菌的 OmpA 的羧基端的蛋白質分子大至 56×103 都可以被轉運到外膜[14]，而截斷的 OmpC 可以轉運 50×103 的蛋白質[15]。Lpp 是另一種 Omp，借于氨基端的脂質部分錨定在外膜上。Lpp 則是大腸桿菌表面最豐富的蛋白，它的信號肽與 OmpA 部分肽段融合組成一個復合展示系統 lpp-OmpA，這個系統已經展示許多大分子蛋白，如 β-內酰胺酶（30×103）、綠色熒光蛋白（27×103）和甲基對硫磷與綠色熒光蛋白融合物（60×103）[16-17]，解決利用大腸桿菌展示外源片段大小問題。
利用大腸桿菌外源展示系統制備基因工程活載體疫苗已見報道，無論是構建表達載體后導入大腸桿菌體內進行展示的，還是直接對大腸桿菌基因組進行外源片段同源重組打靶構建的，均面臨外源基因表達量小，疫苗免疫效果不佳，無法作為一個有效的活載體疫苗進行推廣，迫切需要找到影響表達量的關鍵因素。前期研究發現在利用大腸桿菌 Lpp-OmpA 系統進行外源片段展示的時候，保留了細菌原來的 OmpA，未進行丟失處理[18]。可對大腸桿菌 OmpA 進行基因敲除，得到大腸桿菌 OmpA 缺失突變菌株，以此突變菌株為宿主菌利用 Lpp-OmpA 進行外源基因的展示，來探索丟失原來的 OmpA 后重組細菌的表達量會有所變化。
本研究利用 Red 重組系統來構建OmpA 敲除菌株，通過菌落 PCR 檢測得到了 6 株大腸桿菌 OmpA 缺失菌株。對其中1株 E.coli△OmpA1 進行蛋白質印跡法檢測發現 OmpA 成功地完全丟失，重組菌株 E.coli△OmpA1 敲除 OmpA 成功。對 E.coli△OmpA1 進行生物特性檢查發現該重組菌株的生長情況不受敲除了OmpA 影響，與正常的大腸桿菌生長曲線類似。該結果為后續研究大腸桿菌外膜展示系統奠定了一定基礎。
許多微生物都可以作為表面展示多肽或蛋白的宿主，包括革蘭陽性（Gram-positive，G+）菌、革蘭陰性菌和酵母菌[1]。但由于 G+菌細胞壁是由一層厚而致密的肽聚糖和磷壁酸組成[2]，導致轉化效率低等缺點，而大腸桿菌以其高產量和便于基因工程操作成為主要的蛋白質表面展示菌株。盡管有許多的載體蛋白都被研究人員開發用來展示其他的異源蛋白，但多數載體蛋白的應用因承載蛋白的大小而受到了較大的限制[3]。相比較而言，外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）展示系統能展示相對分子質量較大且結構復雜的目的蛋白，從而成為生物技術研究的熱點[4]。大腸桿菌Omp是一類高度保守的、由 325 個氨基酸所組成的蛋白，該蛋白主要由 N 端和 C 端兩個結構域組成，能以 β-折疊組成桶狀樣結構，跨越外膜，此類蛋白主要包括 OmpA、麥芽糖孔蛋白、鐵色素外膜受體蛋白、OmpC 和 OmpX[5-8]。
大腸桿菌的 OmpA 因其自身具備的 β-折疊桶狀跨膜結構，常被人用于在大腸桿菌表面展示外源片段。外源抗原在大腸桿菌外表面進行表達，利于此種優勢可制備成有效的活載體疫苗。大腸桿菌外膜展示系統中，因表達量問題，常在 OmpA 前嵌入脂蛋白（lipoprotein，Lpp）構建 Lpp-OmpA 表達系統[9]。本實驗室前期構建了表達質粒 pet28a-lpp-ompa-trap 成功轉入大腸桿菌內，同時成功地在大腸桿菌基因組直接用 Red 同源重組的方式在 OmpA 跨膜區域插入外源基因 gapc1，但這兩類外源片段的展示均面臨一個問題就是外源基因表達量不夠，活載體疫苗的保護率不高[10-12]。分析認為在做外源片段展示的時候是直接構建好 Lpp-OmpA- 連接目的片段，直接進入宿主菌，不論是重組質粒轉化還是基因組外源片段電擊轉入均未去掉宿主菌原來的 OmpA，為進一步探究 OmpA 的保留是否與表達量有關，本研究利用 Red 同源重組的方法對大腸桿菌進行 OmpA 敲除，構建大腸桿菌 OmpA 缺失株，為后續研究奠定一定的基礎。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和質粒
大腸桿菌由黑龍江八一農墾大學預防獸醫學系實驗室提供。質粒 pKD46、pKD3、由揚州大學朱國強教授惠贈。
1.1.2 試劑
限制性內切酶 DpnⅠ；pfu DNA 聚合酶購自美國 New England BioLabs 公司；DreamTagTM Green PCR Master Mix（2×）購自立陶宛 MBI 公司；氨芐青霉素、氯霉素購自德國 Sigma 公司；細菌培養用胰蛋白胨和酵母提取物購自英國 Oxoid 公司；E.Z.N.ATM Plasmid Mini Kit 和 E.Z.N.ATM Gei Extraction Kit 購自美國 Omega bio-tek 公司；核酸標準品（DL2000 Plus DNA Marker）購自日本 Takara 公司；蛋白質標準品（SM0671 Protein Marker）購自美國 Thermo 公司；二氨基聯苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購自中山金橋公司；羊抗鼠免疫球蛋白G 二抗購自英國 Abcam 公司；其他試劑為國產分析純。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 引物設計與合成
根據已發表的大腸桿菌OmpA（GenBank Accessed Number AC-00091.1）基因序列和 pKD3 質粒序列，應用 DNA Star 軟件設計，其中 P1-C1和 P2-C2 分別由 2 部分組成，5’端加下劃線的序列與 OmpA 基因兩翼序列同源，3’端未加下劃線的序列與質粒 pKD3 上cm 基因兩側序列互補。在大腸桿菌 OmpA 基因同源重組區域外側和 cat 基因上設計鑒定引物 P3、P4、P5、P6。引物由上海生工生物有限公司合成，如表 1 和圖 1。
表1
實驗中所使用的引物
圖1
引物示意圖
1.2.2 基因敲除 cat 的制備和純化
以質粒 pKD3 為模板，P1-C1、P2-C2 為引物，進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。擴增產物用 DpnⅠ進行酶切，以切除模板減少模板質粒對實驗的影響。酶切后的產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、DNA 回收試劑盒純化和 DNA 濃度測定。回收產物于 4℃ 保存備用。
1.2.3 表達 Red 重組酶菌株的誘導和同源重組
用氯化鈣法將 pKD46 質粒轉化到野生型大腸桿菌中，用含有 100 μg/mL 氨芐青霉素的 LB 培養基篩選單個菌落并鑒定后， 經30℃ 震蕩培養至 600 nm 波長的吸光度（A600）值為 0.4～0.6 時加 30 mmol/L L-阿拉伯糖誘導，Exo、Bet、Gam 蛋白充分表達后，制備含有 10% 甘油的電轉感受態細胞。在 MicroPulser 電轉化儀（美國 Bio-Rad 公司）上，電壓 1.8 kV，脈沖 25 Μf，電阻 200 Ω 的參數下，將上述純化融合 PCR 產物電擊轉化到感受態細胞，在含氯霉素和氨芐青霉素的 LB 平板上篩選單克隆菌株。
1.2.4 重組菌株的 PCR 鑒定
將在氯霉素和氨芐青霉素的 LB 平板生長的菌株轉接入含相應抗性的液體 LB 中培養，后用鑒定引物 P3、P4、P5、P6 對菌株進行菌液 PCR 鑒定。鑒定體系為 Dream Tag TM Green PCR Master Mix（2×）10 μL、上下游引物各 0.5 μL、模板為單菌落，加雙蒸水至 20 μL，反應條件：94℃ 預變性 10 min 后，94℃ 變性 30 s，52℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 2 min，30 個循環，最后 72℃ 延伸 5 min。鑒定對的菌株送去上海生工測序。
1.2.5 蛋白質印記法檢測 OmpA 蛋白缺失
將 PCR 鑒定成功并測序正確的菌株進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及蛋白質印跡法分析。將細菌培養至 A600 為 0.6 時，收集菌液，12 000 r/min 離心 1 min，用無菌磷酸鹽緩沖液清洗 3 次后制備成電泳樣品，配制 12% 的 SDS-PAGE 凝膠進行電泳，然后采用濕轉法進行轉膜。轉印結束，將硝酸纖維素膜取出后用雙蒸水漂洗 1 次，用磷酸鹽吐溫緩沖液（0.1%PBS-Tween20，PBST）漂洗 3 次，將硝酸纖維素膜置于 5% 脫脂乳中封閉 2h；PBST 漂洗 3 次，加入抗 OmpA 的血清，室溫搖床溫育 1h；PBST 漂洗 3 次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白 G，室溫搖床溫育 1h；PBST 漂洗 3 次，雙蒸水漂洗 1 次，采用 DAB 顯色試劑盒顯色，見顯色，立即放入雙蒸水中終止反應，觀察結果，照相。
1.2.6 缺失株生長曲線的測定
將野生菌種和重組缺失菌株接入 LB 中培養至 A600 為 0.6 時作為培養的母液，按照 1∶100 轉接入 LB 中再培養，且分別于培養的 0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h 取出 2 mL 菌液測定 A600 值，每個時間點重復測定 3 次。
1.3 觀察指標
觀察 PCR 擴增片段核算電泳結果，重組細菌全菌體 PCR 檢測電泳結果，重組細菌蛋白質印跡法檢測結果，細菌生長 0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22h 細菌 A600 值。
2 結果
2.1 基因打靶片段構建結果
以質粒 pKD3 為模板，用引物 P1 和 P2 進行 PCR 擴增 H1-cm-H2 knock-out cat，擴增產物 經1% 瓊脂糖凝膠電泳，可見特異性 DNA 條帶，與預期值 1 104 bp 大小相符，見圖 2。
圖2
Hl-cm-H2 擴增產物電泳結果
泳道 1：H1-cm-H2 打靶片段擴增產物，大小為 1 104 bp（白色條帶）；泳道 M：8 000 bp Marker
2.2 基因缺失株的鑒定
經過抗生素初步篩選，得到 40 個克隆，利用 2 對鑒定引物 P3-P5、P4-P5 進行菌落 PCR 擴增鑒定，結果得到 6 個陽性克隆，命名為 E.coli△ OmpA1、E.coli△OmpA2、E.coli△OmpA3、E.coli△OmpA4、E.coli△OmpA5、E.coli△OmpA6，結果詳見圖 3。其中 1、3、5、7、9、11、13、15 為 P 和 P5 鑒定結果，大小為 839 bp，2、4、6、8、10、12、14、16 為 P4 和 P6 鑒定結果大小為 1 424 bp。陽性克隆擴增出的 DNA 片段大小與預期值一致，隱性對照大腸桿菌野生型（wild type，WT）及水對照均沒有擴增出任何 DNA 片段。
圖3
菌液 PCR 擴增鑒定結果
泳道 M：5 000 bp Marker；泳道 1、3、5、7、9、11：分別為
2.3 蛋白質印跡法檢測結果
將經濃縮后的WT和 OmpA 缺失后的 E.coli△OmpA1 細菌裂解上清液進行 SDS-PAGE，轉膜后進行蛋白質印跡法分析。圖 4 中樣品均為全菌體，一抗為抗 OmpA 蛋白的血清，第1道為 E.coli△OmpA1，未出現特異性條帶，第2道為大腸桿菌 WT，出現 1 條特異性條帶，相對分子質量約為 34×103，34×103處條帶與預期值大小接近，證明大腸桿菌 WT 表達的 OmpA 蛋白成功敲除。
圖4
蛋白質印跡法檢測 OmpA 蛋白表達結果
泳道 M：170×103 maker；泳道 1：大腸桿菌重組
2.4 缺失株生長曲線
為檢測 OmpA 缺失是否影響細菌的生長，將大腸桿菌重組缺失株 E.coli△OmpA1 和大腸桿菌野生株 WT 培養不同時期的 A600 值為縱坐標，時間為橫坐標繪制菌株隨時間變化的生長曲線，大腸桿菌重組缺失株 E.coli△OmpA1 的生長曲線符合大腸桿菌的生長規律。細菌的生長沒有顯著的影響。見圖 5。
圖5
大腸桿菌 OmpA 缺失株與大腸桿菌野生株的生長曲線
WT：大腸桿菌野生株；△OmpA1：大腸桿菌
3 討論
大腸桿菌的 β-桶狀 Omp，能以 β-折疊組成桶狀樣結構，并多次跨越外膜，此類蛋白主要為 OmpA、OmpC、OmpT 等。大多數以 Omp 為載體的展示系統在不影響其結構穩定性的情況下，僅允許小肽插入到 Omp 的膜外環上[13]。為了突破這種限制，新的以 Omp 為載體的展示系統被開發出來并廣為利用。如利用融合到假單胞菌的 OmpA 的羧基端的蛋白質分子大至 56×103 都可以被轉運到外膜[14]，而截斷的 OmpC 可以轉運 50×103 的蛋白質[15]。Lpp 是另一種 Omp，借于氨基端的脂質部分錨定在外膜上。Lpp 則是大腸桿菌表面最豐富的蛋白，它的信號肽與 OmpA 部分肽段融合組成一個復合展示系統 lpp-OmpA，這個系統已經展示許多大分子蛋白，如 β-內酰胺酶（30×103）、綠色熒光蛋白（27×103）和甲基對硫磷與綠色熒光蛋白融合物（60×103）[16-17]，解決利用大腸桿菌展示外源片段大小問題。
利用大腸桿菌外源展示系統制備基因工程活載體疫苗已見報道，無論是構建表達載體后導入大腸桿菌體內進行展示的，還是直接對大腸桿菌基因組進行外源片段同源重組打靶構建的，均面臨外源基因表達量小，疫苗免疫效果不佳，無法作為一個有效的活載體疫苗進行推廣，迫切需要找到影響表達量的關鍵因素。前期研究發現在利用大腸桿菌 Lpp-OmpA 系統進行外源片段展示的時候，保留了細菌原來的 OmpA，未進行丟失處理[18]。可對大腸桿菌 OmpA 進行基因敲除，得到大腸桿菌 OmpA 缺失突變菌株，以此突變菌株為宿主菌利用 Lpp-OmpA 進行外源基因的展示，來探索丟失原來的 OmpA 后重組細菌的表達量會有所變化。
本研究利用 Red 重組系統來構建OmpA 敲除菌株，通過菌落 PCR 檢測得到了 6 株大腸桿菌 OmpA 缺失菌株。對其中1株 E.coli△OmpA1 進行蛋白質印跡法檢測發現 OmpA 成功地完全丟失，重組菌株 E.coli△OmpA1 敲除 OmpA 成功。對 E.coli△OmpA1 進行生物特性檢查發現該重組菌株的生長情況不受敲除了OmpA 影響，與正常的大腸桿菌生長曲線類似。該結果為后續研究大腸桿菌外膜展示系統奠定了一定基礎。
